Спосіб експрес-визначення загальної антиоксидантної активності плазми озонованої крові хворих

Спосіб експрес-визначення загальної антиоксидантної активності озонованої плазми крові хво 3 чення її інгібуючого впливу на вільнорадикальне окислення мембран еритроцитів. Недоліки: а) використання субстрату (мембрани еритроцитів), який складно отримувати - матеріал для модельної системи при кожному його приготуванні має різні початкові параметри; б) інкубація одноразова - 30 хвилин; в) оцінка продуктів перекисного окислення здійснюється тільки на довжині хвилі 532 нм; г) важко отримати тестсистему в стандартному вигляді, так як при її зберіганні початковий рівень продуктів ПОЛ і їх ЗАА постійно змінюються. Існує спосіб "Модифікація методу визначення сумарної антиоксидантної активності крові" [Промыслов М. Ш., Демчук М. Л. // Вопросы медицинской химии. - 1996. - Т. 36. - 4. - С. 90-92]. Він полягає в оцінці ЗАА рідини, що досліджується, шляхом визначення її інгібуючого впливу на вільнорадикальне окислення в модельній системі з ліноленовою кислотою, в якій окислення індукується доданням FeSO4. Недоліки: а) неоднорідність і мала стійкість емульсії цієї кислоти в розчині, в результаті чого виникає значна розбіжність в даних; б) використання малодоступного субстрату окислення; в) використання лінолеату обмежує можливість дослідження процесів перекисного окислення інших ненасичених жирних кислот, які зустрічаються в природних субстратах (фосфоліпіди плазми, мембрани клітин тощо), г) низька достовірність способу відносно природних біосубстратів перекисного окислення. Відомий також спосіб контролю антиоксидантної активності профілактичних і лікувальних антиоксидантних засобів [Пат. РФ № 2182706, G01N33/15, G01N33/52, пр. 15.01.2001. Опубл. 20.05.2002]. Він полягає в оцінці ЗАА антиосидантного препарату, що досліджується, шляхом визначення його інгібуючого впливу на вільнорадикальне окислення в модельній системі, яка складається з поліненасичених жирних кислот кукурудзяного масла, в якій окислення індукується ініціаторами окислення за певний проміжок часу в стандартних умовах з наступним комплексним визначенням ЗАА методами спектрофотометрії і хемілюмінесценції за кількістю утворених продуктів перекисного окислення ліпідів. При цьому показник ЗАА, виражений в убіхінонових одиницях, обернено пропорціональний рівню продуктів перекисного окислення ліпідів. До недоліків способу можна віднести: а) залежність відтворення результатів від умов зберігання і ступеня початкового окислення субстрату, що унеможливлює стандартизацію вимірювань; б) низька достовірність способу відносно природних біосубстратів перекисного окислення; в) висока трудомісткість способу завдяки комплексному використанню двох методів визначення ЗАА - спектрофотометричному і хемілюмінесцентному. Найбільш близьким до заявленого є "Спосіб оцінки протизапальної активності цитокінів" [див. Пат. РФ № 2150113, G01N33/52, пр. 1999.01.28, Опубл. 2000.05.27]. Він полягає в тому, що в модельній системі гемоглобін - пероксид водню люмінол проводять оцінку інгібування вільних ра 66050 4 дикалів цитокінами, для чого визначають показник інтенсивності хемілюмінесценції в модельній системі, після чого до неї цитокін додають, який досліджують, і повторюють визначення інтенсивності хемілюмінесценції. При зниженні даного показника на 50 % і більше відносно початкового рівня оцінюють активність цитокіну як протизапальну. Недоліки способу: а) досить великий час вимірювання показника ЗАА за рахунок того, що люмінесценція люмінолу розвивається впродовж 1-2 годин, флуоресценцію реєструють певний час до досягнення максимуму, і при реєстрації люмінесценції існує латентний період і "плато" затримки; б) складність модельної системи, яка потребує за2+ стосування каталізатора (Fe ) для пришвидшення протікання реакції; в) обмеженість застосування способу при роботі з біологічними рідинами, забарвлення або каламутність яких перешкоджає отриманню достовірних результатів. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалити відомий спосіб визначення ЗАА біологічного зразка шляхом прямого використання люмінесцентного агента, що зв'язується з низькомолекулярними білками плазми крові, який спеціально вводять в плазму або сироватку і реєструють кінетику його гасіння. Тим самим досягається скорочення часу вимірювання показника ЗАА, спрощується модельна система і розширюються межі застосування способу. Поставлена задача вирішується тим, що в способі експрес-визначення загальної антиоксидантної активності озонованої плазми крові хворих, який включає оцінку інактивації вільних радикалів з використанням люмінесцентного агента, згідно з корисною моделлю, як люмінесцентний агент вибирають продукт взаємодії фенілового ефіру N-метилакридинійкарбонової кислоти і пероксиду водню в середовищі карбонатного буферного розчину (рН 9,93), а загальну антиоксидантну активність плазми оцінюють за допомогою реєстрації кінетики гасіння люмінесценції люмінесцентного агента в розчині плазми крові в умовних оди-1 -1 ницях (с мкл ) з формуванням кривих гасіння і обчисленням по них питомої сталої швидкості га(K ) сіння хемілюмінесценції CL пит . Пероксид водню реагує з сіллю Nметилакридинійкарбонової кислоти і продукт, який при цьому утворюється (пероксипохідне Nметилакридинійкарбонової кислоти) розпадається з певною швидкістю і випромінює кванти світла. Саме цей продукт виявляє чутливість до відновлювачів (донорів електронів), які містяться в біологічній рідині (плазмі крові). Чим більше антиоксидантів в плазмі, тим повільніше йде розпад люмінесцентного агента і, відповідно, швидкість згасання люмінесценції. Як показник ЗАА плазми (або сироватки) крові використовують так звану питому сталу швидкості (K CL пит ) гасіння хемілюмінесценції , величина якої є обернено пропорційною загальній активності K оксидантів плазми. Параметр CL пит є інтегральним показником, який реагує на наявність в плазмі (сироватці) всіх можливих оксидантів, як низько-, 5 66050 6 так і високомолекулярних, і дозволяє таким чином отримати найбільш повну інформацію про резервні можливості антиоксидантної системи організму хворого. Використання люмінесцентного агента, основною діючою речовиною якого є феніловий ефір Nметилакридинійкарбонової кислоти і як показник ЗАА плазми крові - питомої сталої швидкості гасіння хемілюмінесценції (K CL пит ) , дозволяє: При першому введенні ОФР в дозі 4 мг/л цей пока - скоротити час вимірювань до 1-2 хв.; - спростити систему за рахунок виключення з неї каталізатора; - розширити межі застосування методу за рахунок забезпечення можливості вимірювання забарвлених і каламутних зразків. Спосіб визначення ЗАА плазми озонованої крові хворих здійснюється таким чином. У пацієнта натще з кубітальної вени в асептичних умовах відбирають 3 мл крові в 5-мл шприц, який містить антикоагулянт (0,06 мл гепарину). Плазму відокремлюють від клітин крові центрифугуванням 5 хв. при 800 g. В центрифугальні пробірки відбирають різні об'єми плазми (від 0,1 до 0,3 мл), доводять їх об'єм до 2 мл карбонатним буферним розчином (рН = 9,93) та додають 0,2 мл 5 %-го водного розчину Н2О2. Безпосередньо перед вимірюванням до кожної суміші додають 0,2 мл розчину люмінесцентного агента. Як люмінесцентний агент вибирають систему феніловий ефір N-метилакридинійкарбонієвої кислоти - пероксид водню в середовищі карбонатного буферного розчину (рН 9,93) [Weeks I., Behehti I., McCapra F. et al. // Clin. Chem. - 1983. - № 29. - P. 1474]. Кинетику гасіння люмінесценції агента в плазмі реєструють впродовж 2 хв. на довжині хвилі 400 нм на хемілюмінометрі або спектрофлуориметрі, який працює в режимі біохемілюмінометра. По отриманих показниках будують криві гасіння. Криві гасіння люмінесценції логарифмують, тангенси кутів нахилу отриманих прямих ділять на відповідні об'єми плазми, і, таким чином, отримують питомі сталі швидкості гасіння хемілюмінесценції (K CL,пит ) . З отриманих для кожної концентрації підвищився до значення 4,2  10 5 c 1мкл1 і далі не зростав. Тому на останніх процедурах пацієнту вводили ОФР з поступовим зниженням дози озону до 7 мг/л. Такий підхід, з визначенням максимально комфортної для хворого дози розчиненого озону дозволив покращити показники гемодинаміки, ліквідувати бронхіт з астматичним компонентом і стимулювати імунну систему, ліквідувати клінічні прояви синдрому хронічної втоми. Приклад 2. Застосування способу експресвизначення ЗАА озонованої плазми крові хворих для визначення ефективності сумісної дії процедур ОФР і ВАГОТ. Пацієнт А., 21 рік, д-з: хронічний протозойнобактеріальний уретропростатит. При первинному обстеженні крові 18.03.2010 р. визначено величину плазми K CL,пит даних вираховують середнє зна-1 -1 чення, величина якого виражається в с мкл і є обернено пропорційною загальній активності оксидантів плазми. Практичне застосування способу ілюструють наступні приклади. Приклад 1. Застосування способу експресвизначення ЗАА озонованої плазми крові хворих для визначення ефективності введення в організм пацієнтів озонованого фізіологічного розчину (ОФР). Пацієнт Щ., 55 років, д-з: ішемічна хвороба серця (ІХС), гіпертонічна хвороба (ГХ) ІІА ст., синдром хронічної втоми, загострення хронічного обструктивного бронхіту. При первинному обстеженні крові 8.06.2010 р. визначено величину K CL,пит  4,2  105 c 1мкл1 , яка для даного пацієнта прийнята за контрольну. зник знизився до значення 2,5  10 5 c 1мкл1 . Далі озонотерапія проводилась щоденно шляхом введення внутрішньовенно ОФР в поступово зростаючих концентраціях (з 4 до 12 мг/л) з дискретністю підвищення дози 2 мг/л. При цьому клініколабораторні показники значно покращились, а контрольне дослідження показника ЗАА плазми крові 13.06.2010 р. показало, що показник ЗАА K CL пит  2,7  10 5 c 1мкл1 , яка для даного паці єнта прийнята за контрольну. Почато курс озонотерапії 18.03.2010 р. з введення ОФР з мінімальною концентрацією розчиненого озону 2 мг/л. 18.03.2010 р. взято контрольну K пробу крові і визначено, що показник CL пит зни5 1 1 зився до значення 0,6  10 c мкл . Після цього через день проводили процедуру ВАГОТ з поступово зростаючими дозами озону від 6 до 20 мг/л. Останню було досягнуто 30.03.2010 р. на 6-й процедурі. Було взято кров для аналіз і визначено значення показника K CL пит  10,3  10 5 c 1мкл1 . Цю концентрацію було визнано нами максимально припустимою для даного пацієнта. Наступне поступове зниження вмісту озону к 12-й процедурі K ВАГОТ показало збереження показника CL пит на рівні 6,9  15 c 1мкл1 . Клініко-лабораторні показ, ники підтвердили правильність обраної нами тактики лікування. Приклад 3. Застосування способу експресвизначення ЗАА озонованої плазми крові хворих для визначення ефективності процедури великої аутогемоозоотерапії (ВАГОТ). Пацієнт Л., 26 років, д-з: хронічний протозойно-бактеріальний уретропростатит. В комплексному лікуванні було застосовано метод озонотерапії шляхом проведення 12кратного (через день) озонування крові (ВАГОТ). Перед курсом ВАГОТ 28.03.2010 р. у хворого було взято кров, яка вважалась контрольним зразком. Початкове значення показника ЗАА становило 3,8  10 5 c 1мкл1 . 7 Курс озонотерапії хворий переносив добре, тому до 7-ї процедури концентрацію озону було підвищено до 30 мг/л. Значення показника при цьому сягнуло 10,7  10 5 c 1мкл1 , але надалі почало дещо знижуватись, зостаючись на досить високому рівні (9,5  15 c 1мкл1 ) . Тому подальше , проведення ВАГОТ проводили з поступовим зниженням концентрації розчиненого озону, яка до 26.04.2010 p. (12-та процедура) досягла значення 5 мг/л. Показник ЗАА плазми крові при цьому ста Комп’ютерна верстка Л. Купенко 66050 8 новив 9,3  15 c 1мкл1 . У даного пацієнта було , отримано найбільш виражений позитивний клініколабораторний ефект від лікування. Таким чином, як витікає з наведених прикладів, спосіб експрес-визначення ЗАА озонованої плазми крові хворих, який нами заявляється, дозволяє швидко визначати показник ЗАА крові у пацієнтів і оперативно корегувати цей процес при проведенні процедур озонотерапії. Підписне Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601