Спосіб комплексної оцінки токсичності лікарських препаратів

1 Спосіб оцінки токсичності лікарських препаратів, який включає введення в розчин лікарського препарату тест-організму і визначення токсичності середовища, який відрізняється тим, що використовують окремий тест-організм і його клітини як модель для аналізу різних типів токсичності, орга нізм витримують у середовищі протягом 0,5 години 3 доби, токсикологічний аналіз проводять по параметрах цілого організму, паралельно беруть клітини цього ж організму і здійснюють цитогенетичний аналіз по функціональних і структурних параметрах клітин, а також мутагенний - по розривах ниток ДНК і на основі порівнювального аналізу отриманих результатів з контролем одержують комплексну оцінку токсичності, генотоксичності, цитотоксичності та мутагенності лікарських препаратів 2 Спосіб по п 1, який відрізняється тим, що як тест-організм використовують цибулю звичайну Alhum сера 3 Спосіб по п 1, який відрізняється тим, що як параметри цілого організму застосовують двоїчну оцінку по довжині й вазі корейців тест-організму Винахід відноситься до галузі медицини, екологи навколишнього середовища, зокрема, до методів бютестування водного середовища (розчинів) і може бути використаний для попереднього скринінга нових лікарських препаратів і отримання додаткової інформації для вже існуючих ЛІКІВ, а також ОЦІНЦІ якості водного середовища Відомий спосіб оцінки генотоксичності водного середовища (розчинів) по частоті хромосомних аберацій на клітинах цибулі (Fiskesijo G 1997 Alhum test for screening chemicals, evaluation of cytological parameters // In Wuncheng Wang, Gorsuch JW, Hughes JS, editors Plants for environmental studies New York Lewis Publ p 307333) (1) Автор запропонувала аналізувати порушення хромосом (змінення їх КІЛЬКОСТІ, порушення структури) на цитологічних препаратах клітин цибулі, досліджуваних під світловим мікроскопом Даний метод був використай, поряд з іншими, стандартними методами, для аналізу генотоксичності лікарських препаратів (Clemedson C, McFarlaneAbdulla E, Andersson M et al 1996 MEIC evaluation of acute systemic toxicity // ATLA (Alternatives To Laboratory Animals) 24 251-311(2) Показана висока кореляція (R2 = 0 68-0 82, P 13, 4°С) на 20 хв, ПОТІМ вони переносилися в електрофорез ну 61648 камеру з лужним буфером і піддавалися впливові електричного поля 0,86 Вт/см протягом20хв при 4°С Після електрофорезу гель нейтралізували 0,4М Tns (p =7 5), відмивали, дегидратували в 100% етанолі і сушили всю ніч при кімнатній температурі Оцінка ефекту проходила ВІДПОВІДНО ДО вимог аналізу мікроскопічних зображень Найбільш близьким аналогом до винаходу по технічній сутності й ефектові, що досягається, є спосіб оцінки генотоксичності водного середовища (розчинів) по частоті хромосомних аберацій на клітках цибулі (1) Сутність способу полягає в наступному Для оцінки якості водних зразків досліджували вплив токсичності на тест організм, у якості якого беруть цибулину цибулі звичайної, Alhum сера, пророщують на контрольному середовищі і водних розчинах аналізованих речовин протягом 72-120 годин Мікроскопічні дослідження виконують на трьох препаратах, приготовлених з КІНЧИКІВ корінців цибулі, для кожної досліджуваної концентрації При максимальному збільшенні світлового мікроскопа (окуляри 10-15х, об'єктив 100х) аналізують по 300 МІТОЗІВ (метафаз або анафаз) на одну пробу Отримані результати класифікують у такий спосіб нормальні метафази й анафази, а також ефекти, що відносяться до хромосомних аберацій злиплі (sticky) хромосоми, фрагменти хромосом і хромосомні мости,) хромосоми, що відстали (vagrant) і Кмітози Генотоксичний ефект визначать по росту частоти хромосомних аберацій у дослідних варіантах у порівнянні з контрольним Для прототипу, що оцінює генотоксичність водних розчинів по частоті хромосомних аберацій на клітках цибулі, показана висока і достовірна кореляція з даними по генотоксичності розчинів лікарських речовин, отриманими на клітках людини (2) До недоліків відомого способу відноситься наступне - реалізація способу дозволяє визначати тільки токсичність і генотоксичність досліджуваного середовища, не досліджуючи цитотоксичність і мутагенність водного середовища (розчинів лікарських речовин), - трудомісткість проведення аналізу і реєстрації хромосомних порушень, - складність мікроскопічного аналізу, наприклад, пред'являються високі вимоги до готування цитологічних препаратів (необхідні хромосомні пластинки високої якості), - недостатня чутливість способу, для визначення структурних порушень потрібно більш сильний (по дозі або концентрації) і тривалий за часом вплив токсикантів Можна сказати, що, виходячи з рівня техніки в області визначення якості водного середовища з використанням бютестів, ВІДОМІ способи визначення токсичності на організменому або клітинному рівні, кожний окремо, не дозволяє вирішити задачу комплексної, швидкої, дешевої й адекватної оцінки показників різних видів токсичності водних розчинів, що особливо необхідно для скринінга лікарських препаратів Винахід, що заявляється, спрямовано на рішення задачі розробки комплексного, швидкого і 61648 дартних методах (тест організм ссавці, а мутагенність і генотоксичність виявляються в черзі поколінь) припускає терміни до 2 років, використання способу приводить до істотного зниження ціни аналізів (для 1 лікарського препарату ціна аналізу зменшується натри-чотири порядки) Таким чином, за рахунок спрощення й здешевлення методики оцінки токсичного ефекту лікарського препарату пропонується альтернативна (у порівнянні зі стандартними методами) модель дослідження токсичності, гено- і цитотоксичності, мутагенності лікарської речовини на рослинному організмі і його клітках Спосіб рекомендується для попереднього скринінга нових лікарських препаратів, при ОЦІНЦІ їхньої можливої токсичності, цито- і генотоксичності, мутагенності, а також одержання додаткової інформації про різні типи токсичності для вже існуючих ЛІКІВ, екологічного моніторингу водного середовища В таблиці 1 наведені порівняльні дані з відомими способами Таким чином, сукупність істотних ознак запропонованого способу комплексної оцінки токсичності лікарських препаратів, а саме визначення токсичних ефектів за допомогою рослинного тесторганізму в сполученні зі змінами його клітинних параметрів, є необхідного і достатньою для досягнення забезпечуваного винаходом технічного результату - значного спрощення методу й поліпСпосіб оцінки токсичності лікарських препарашення результатів тестування токсичності тів, що заявляється, заснований на комплексному лікарських препаратів за рахунок одержання об'єкдослідженні показників тест організму і його кліток, тивної, повної і достовірної оцінки різних видів токщо включає вимір гальмування росту і зниження сичності токсичності, цитотоксичності, генотоксичваги корінців, аналіз ядерцевих характеристик кліності і мутагенності досліджуваних речовин ток, облік частоти мікроядер і подвійних ядер кліток, оцінка мутагенності по розривах ниток ДНК і з Приклади реалізації способу, що заявляється урахуванням отриманих результатів дозволяє Приклад 1 зробити всебічну, об'єктивну оцінку різних токсичУ якості тест організму використовували цибуних властивостей лікарських препаратів лю звичайну Alhum сера, представника однодольних рослин Досягається високий результат оцінки різних токсичних властивостей досліджуваного водного Як контрольний зразок використовували артесередовища за рахунок об'єднання різних метозіанську воду дик, сполучення яких можливо при використанні У ВІДПОВІДНОСТІ зі стандартною методикою бюданого тест організму (звичайна цибуля Alhum тестування водних проб [Методи биоиндикации и сера Швидкий розвиток корінців у водному серебиотестирования природних вод Випуск 2 // Под довищі, їхня висока чутливість і двоїчна оцінка по ред В А Бризкало, Т А Хорунжей - Л Гидромедовжині й вазі корінців дозволяють адекватно оцітеоиздат, 1989 - 276 с ] , зразки води, використонити рівень токсичності водного середовища, навуваної для контролю й розчинення лікарських явність безлічі корінців в однієї рослини дозволяє препаратів, після доставки їх з артезіанських свепровести весь комплекс клітинних досліджень на рдловин зберігали протягом 1-3 діб у холодильниобмеженій КІЛЬКОСТІ організмів і збільшує вірогідку (при температурі 5-8°С) ність результатів (у ВІДМІННІСТЬ, наприклад, від Як досліджуваний зразок узяли розчин аспіритестів на насіннях рослин, де для достовірної стану Цибулю розміщали нагорі пробірок (10шт) затистичної оцінки необхідне використання безлічі повнених досліджуваним розчином, причому з тест організмів), наявність еукариотичного ядра розчином контактує тільки зона росту корінців дозволяє провести весь комплекс клітинних і субЦибулини пророщували протягом 72 години на клітинних досліджень на цито- і генотоксичність, контрольних і дослідних зразках при кімнатній темутагенність, швидка відповідна реакція ядерець мпературі, у захищеному від прямого сонячного на токсичний вплив дозволяє одержати результат світла МІСЦІ у перші години тестування, сполучення аналізу Для визначення загальної токсичності порівядерцевих характеристик, частоти мікроядер і понювали середню довжину і вагу корінців у контродвійних ядер у клітках, виникнення розривів ниток льному й досліджуваному зразках Суть цього тесДНК найбільше об'єктивно характеризує різні типи ту полягає в гальмуванні росту корінців у випадку токсичності на клітинному рівні токсичного впливу Дані досліду, приведені в таблиці 2 свідчать про токсичність досліджуваного Спосіб, що заявляється, скорочує терміни зразка в порівнянні з контролем аналізу препаратів (до 1 місяця), тоді як при стандешевого способу оцінки різних типів токсичності і підвищення вірогідності одержуваних результатів, зокрема при проведенні попереднього скринінга нових лікарських препаратів і одержанні додаткової інформації про вже існуючі лікарські препарати за допомогою бютестування, за допомогою якого проводиться комплексне дослідження тест організму, функціональних і структурних параметрів його кліток, який виступає у якості моделі для аналізу різних типів токсичності Для рішення поставленої задачі пропонується спосіб комплексної оцінки токсичності лікарських препаратів шляхом використання цілого тест організму і його кліток, що включає введення в досліджуване середовище тест організму, витримування тест організму в досліджуваному середовищі від 0,5-3,0 годин при визначенні цитотоксичності середовища по функціональних параметрах кліток (ядерцеві характеристики) і до 2-3 діб при визначенні токсичності середовища по параметрах організму (довжина й вага корінців), генотоксичності середовища по структурних параметрах (частота мікроядер і подвійних ядер) і мутагенності середовища по структурних параметрах (по розривах ниток ДНК) на клітинному рівні одержують комплексну оцінку різних токсичних властивостей лікарських препаратів Як тест-організм використовують цибулю звичайну Alhum сера, представника однодольних рослин 61648 8 люмінесцентним мікроскопом визначали відсоток кліток із розривами ниток ДНК, тобто кліток, що відрізняються від нормальних кліток наявністю різної довжини комет-хвостів На заключному етапі експериментів проводилося порівняння результатів у контрольних і дослідних варіантах, їхня статистична обробка Усі дані про проведені дослідження на клітинному рівні приведені в табл 2 З приведених даних дослідження можна зробити оцінку впливу аспірину на біологічний об'єкт Приклад 2 Для проведення досліджень підготовлені зразки ВІДПОВІДНО до технологи, що використовували в прикладі 1 Як контроль узята артезіанська вода, а як досліджуваний зразок узяли розчин лікарського препарату - анальгіну ПОСЛІДОВНІСТЬ проведення всіх досліджень проводили аналогічно прикладові 1 Отримані результати відображені в табл 2 Зіставивши з результатами дослідження аспірину можна сказати про стійке підвищення рівня токсичного впливу анальгіну на біологічний об'єкт, підвищена токсичність, генотоксичність, мутагенність за винятком цитотоксичності, де відхилення Для визначення генотоксичності (мікроядерсереднього обсягу ядерець від контролю зменшиний тест) і мутагенності (розриви ниток ДНК) долося в порівнянні з аспірином сліджуваного розчину узяті клітки корінців пророщеної у перебігу 3 діб на досліджуваному зразку Аналізуючи результати тестування , згруповані цибулі в табл 2, можна сказати, що одна і та ж токсична речовина може визивати різні ефекти по токсичноПоказник генотоксичності визначали по мікрості, генотоксичності, цитотоксичності, мутагенності ядерному тесті (4), що фіксує структурні порушені урахування тільки одного показника може привеня генома клітки Визначали частоту структурних сти до невірогідності отриманих результатів і порушень у розрахунку на 1000 досліджених клісуб'єктивній ОЦІНЦІ впливу токсикантів на клітину и ток, тобто в промилле Для однієї проби частоту організм Тільки урахування всіх аналізуємих памікроядер підраховували в 3 - 4 тисяч кліток раметрів може дати об'єктивну оцінку впливу токІншим показником генотоксичності служить сикантів на організм і його клітини частота кліток із подвійними ядрами (5) Частоту кліток з подвійними ядрами визначали також у 3-4 Таким чином, запропонований спосіб оцінки тисяч кліток у кожній пробі, із наступним и перератоксичності лікарських препаратів, заснований на хуванням на 1000 кліток, тобто величина індексу комплексному ПІДХОДІ, що поєднує аналіз токсичвиражалася в промилле ності на організменому рівні з аналізом гено- і цитотоксичності, мутагенності на клітинному і субкліПоказником мутагенності є тест на розриви тинному рівнях, забезпечує об'єктивну і всебічну ниток ДНК або Комета-аналіз Для готування преоцінку різних видів токсичності лікарських препапаратів була використана стандартна процедура ратів, що не досягається жодним із відомих спосо(6) і и модифікація (7) бів Перевага даного підходу полягає також у можКлітки корінців цибулі аналізували після 48 голивості комплексної оцінки різних токсичних дин обробки досліджуваним розчином ЦИТОЛОГІЧНІ ефектів лікарських препаратів препарати після обробки лізисним розчином піддавалися электрофорезу в лужному буфері Під Для визначення цитотоксичності (ядерцевий бюмаркер), пророщені на контрольній воді корінці цибулі поміщали на 0,5-3,0 години в досліджуваний розчин Потім КЛІТКИ корінців цибулі досліджували Аналізували давлені ЦИТОЛОГІЧНІ препарати рослинних кліток, пофарбовані 50% розчином азотнокислого срібла (АдІЧОз) Показники ядерцевого бюмаркера для контролю і кожної проби фіксували періодично через 3 0 - 1 8 0 хв після початку аналізованого впливу Під СВІТЛОВИМ мікроскопом (окух х ляри 10 , об'єктив 100 , загальне збільшення х 1000 ) визначали наступні показники число ядерець у КЛІТЦІ, розмір одиночного ядерця, а також відсоток гетероморфних парних ядерець (ГПЯ) Для кожної проби підраховували число ядерець у 1500-1800 кліток і визначали їхній розмір у 200 кліток при максимальному збільшенні світлового мікроскопа На заключному етапі проводили порівняння результатів у контрольному й дослідному варіантах, після їхньої статистичної обробки дані внесли в табл 2 Слід зазначити, що при незначному відхиленні від контролю середнього числа ядерець у КЛІТЦІ (5,2%) і гетероморфності парних ядерець (4,3%) різко змінився середній обсяг ядерець (182%) 61648 10 Таблиця 1 Порівнювані параметри Прототип Спосіб, що заявляється Токсичність (ПО ЗМІНІ ДОВЖИНИ І ваги корінців рослини) Генотоксичність (по мікроядерному рінців рослини) тесту) Генотоксичність (по хромосомних Цитотоксичність (по ядерцевому биоабераціях) маркеру) Мутагенність (по розривах ниток ДНК) 0,5 - 3,0 години для тесту на цитоток3 - 5 діб для тестів по токсичності і сичність і 2-3 доби для тестів по токсичності, генотоксичності і мутагенногенотоксичності сті Токсичність (ПО ЗМІНІ ДОВЖИНИ ко Реєструємий результат Терміни виконання тесту Вартість тесту (у порівнянні зі стандартними методами оцінки ТОКСИЧНОСТІ, ГЄНО- І ЦИТОТОКСИЧ ності, мутагенності лікарських препаратів, тому що прототип не пропонували для цих цілей) 1 000 000 умовних одиниць 1 000 умовних одиниць Реєструє зміни функціонування генеРеєструє порушення структури тичного апарату (цитотоксичність), генетичного апарату (генотоксичтобто чутливість по первинній ВІДПОВІність) ДІ зростає на кілька порядків Трудомісткий і складний аналіз Трудомісткість, складність анаПростий облік частоти кліток з мікрохромосомних аберацій (генотоклізу ядрами (генотоксичність) сичність) Чутливість методу Таблиця 2 Визначення токсичності, цито-і генотоксичності, мутагенності двох лікарських препаратів (анальгіну і аспірину) за допомогою біотестів на клітинах цибулі звичайної Allium сера Цибуля звичайна Allium сера, ТОКСИЧНІСТЬ Зразки розчинів Довжина і вага корейців, % Відхилення від контролю, % генотоксичність мЯ відхилення ВІД контролю, % 2Я відхилення ВІД контролю, % В КЛІТИНІ Контроль 100% 0% (питна вода) Розчин 37,9% 62,1% аспірину Розчин 2,1% 97,9% анальгіну СереВідхидній лення об'єм від конядертролю, Ц Я % з (мкм ) 0% 0% 1,303 0% 294% 41% 1,235 5,2% 420% 153% 1,201 7,8% Комп'ютерна верстка М Клюкш мутагенність ПроГете ром оцент ВідхиВідхиленрфність КЛІТИН лення ня ВІД парних з комет від конконтролю, ядерець, - хвос- тролю, % % тами, % % ЦИТОТОКСИЧНІСТЬ Середнє число ядерець 46,6 Відхилення від контролю, % 0% 83,2 0% 1,2 0% 131,8 182,8% 79,6 4,3% 25 4 24,2% 84,7 70,9 14,8% 29,8 28,6% 81,8% Підписне Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119