Тест-система імуноферментна “dia-hcv-igg-igm-d” для визначення антитіл класів igg та igm до окремих білків (ns3, ns4, ns5, core) вірусу гепатиту с

Реферат: Тест-система імуноферментна "DIA-HCV-IgG-IgM-d" для визначення антитіл класів IgG та IgM до окремих білків (NS3, NS4, NS5, core) вірусу гепатиту С, в якій використовують імуносорбент, в лунки якого внесені рекомбінантні поліпептиди core, NS3, NS4, NS5 - (кожний антиген сорбований на трьох окремих стрипах), аналоги антигенів ВГС і кон'югат. В складі кон'югатів використовують суміш моноклональних антитіл проти IgG та IgM людини, мічені ферментом, а як проявник - однокомпонентний розчин хромогену. UA 72456 U (12) UA 72456 U UA 72456 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до біотехнології, імунохімії та медицини і може бути використана для виявлення антитіл класу IgG та IgM до окремих білків вірусу гепатиту С в сироватці або плазмі крові людини методом імуноферментного аналізу як підтверджуючий тест результатів скринінгових досліджень при діагностиці гепатиту С. Гепатит С (ГС) - вірусне захворювання, що характеризується не тільки широким розповсюдженням, але й вкрай згубними наслідками, до яких може призвести ця інфекція. Гострий гепатит у більшості випадків перебігає з мінімальною клінічною симптоматикою. Жовтяниця та інші клінічні прояви інфекції відмічаються приблизно лише у 20 % хворих, тоді як у 50-85 % інфікованих вірусом гепатиту С (ВГС) розвивається хронічний гепатит, який і є основною клінічною формою цього захворювання. Багаторічна персистенція вірусу при хронічному ГС може викликати розвиток цирозу печінки з наступним високим ризиком виникнення гепатоцелюлярної карциноми. ВГС належить до родини Флавівірусів (Flaviviridae) окремого роду Гепацивірусів (Hepacivirus). Це дрібний вірус діаметром до 30-60 нм, вкритий білково-ліпідною оболонкою. Розрізняють 3 структурних білки: нуклеокапсидний "серцевинний" білок С (core) і 2 білки зовнішньої оболонки, кодовані зонами Е1 (р18 і gp33) та E2/NS1 (р38 і gp72); ці глікозильовані білки відіграють роль у прикріпленні і проникненні вірусу в клітину. До неструктурних належать білки, кодовані ділянками генома NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, NS5b. Зазначені білки виконують функції протеази, хелікази, РНК-залежної РНК-полімерази і необхідні для репродукції вірусу. Лабораторна діагностика ГС базується на виявленні специфічних антитіл (IgG та IgM) в сироватці крові або інших біологічних рідинах поряд з різними методами виявлення антигену та РНК вірусу. Серед серологічних методів діагностики ВГС найбільш поширеним є метод імуноферментного аналізу (ІФА), який характеризується високою чутливістю та специфічністю. В Україні розроблена і випускається тест-система для підтвердження антитіл класу IgG проти вірусу гепатиту С (DIA-HCV-different) виробництва НВК Діапроф-Мед [1]. Відома тестсистема "HCV Ab Confirmation" виробництва "Orgenics" (Ізраїль) для виявлення антитіл до структурних і неструктурних антигенів ВГС з використанням синтетичних аналогів антигенів ВГС [2]. В основу корисної моделі поставлена задача створити імуноферментну тест-систему для виявлення антитіл класів IgG та IgM до окремих структурного корового (core) та неструктурних (NS3, NS4, NS5) антигенів ВГС. При створенні імуноферментної тест-системи на основі рекомбінантних поліпептидів аналогів структурного корового (core) і неструктурних (NS3, NS4, NS5) антигенів ВГС, які окремо засорбовані в лунках полістиролового планшету, як кон'югат використовують суміш моноклональних антитіл проти IgG та IgM людини, що дає змогу виявляти як ранню серонверсію, так і хронічну стадії захворювання. Поставлена задача вирішується тим, що отримають імуносорбент, в лунки якого окремо засорбовані рекомбінантні поліпептиди core, NS3, NS4, NS5 - аналоги антигенів ВГС (кожний антиген сорбований на трьох окремих стрипах). В складі кон'югатів використовується суміш моноклональних антитіл проти імуноглобулінів людини класів G та М, мічені ферментом. Ферментативну реакцію визначають за допомогою однокомпонентного субстратного розчину з хромогеном. За одну постановку (2 години) можна проаналізувати 18 сироваток. Приклад. Визначення антитіл до окремих антигенів вірусу гепатиту С у сироватці крові хворої Α., 1970 року народження. Визначення проводять за відомою методикою [3] твердофазного імуноферментного аналізу. Рекомбінантні поліпептиди - аналоги антигенів ВГС сорбовані в вертикальних рядах планшета наступним чином: Core - стрипи №№ 1, 5, 9 - червоного кольору; NS3 - стрипи №№ 2, 6, 10 - жовтого кольору; NS4 - стрипи №№ 3, 7, 11 - зеленого кольору; NS5 - стрипи №№ 4, 8, 12 - синього кольору. Після однократного промивання планшету у лунки імуносорбенту вносять по 80 мкл розчину для розведення сироваток і по 20 мкл досліджуваних зразків сироватки від хворої для виявлення антитіл до окремих білків ВГС і контрольні зразки: 4 позитивних і 4 негативних. Накривають планшет клейкою плівкою або кришкою та інкубують при температурі 37 °C протягом 60 хв. При наявності в зразку антитіл до окремих антигенів ВГС, вони зв'язуються з антигенами на твердій фазі, утворюючи комплекс антиген-антитіло. Після відмивання планшету в лунки додають кон'югат суміш моноклональних антитіл проти IgG та IgM людини, мічені пероксидазою і інкубують при 37 °C протягом 30 хв. Після відмивання 6 разів в лунки додають 1 UA 72456 U 5 10 15 розчин проявника (однокомпонентний субстратний розчин з хромогеном) та інкубують при 1822 °C у темряві 30 хв. Зупиняють кольорову реакцію, вносячи до всіх проб по 100 мкл стопреагенту. Не більш як через 5 хв. після зупинення кольорової реакції визначають оптичну густину (ОГ) в лунках у двохвильовому режимі за допомогою спектрофотометра. Значення ОГ зразка прямо пропорційне кількості антитіл до відповідних антигенів ВГС у сироватці. Позитивні значення ОГ хоча б двох з чотирьох антигенів ВГС свідчить про наявність антитіл до ВГС і захворюваність на гепатит С. У хворої А. Визначені антитіла до антигенів core, NS3 і NS4, що свідчить про активний гепатит С. Джерела інформації: 1. Патент на корисну модель UA № 18813 А. Тест-система імуноферментна для визначення антитіл до окремих антигенів вірусу гепатиту С (DIA-HCV-different). Семиноженко В. П. Гураль A. Л, Шевчук О. А. 15.11.2006. бюл. № 11. 2. Инструкция по применению тест-системы "HCV Ab Confirmation" производства "Orgenics" (Ізраїль)", 2010, 12 с. 3. Михайлов А. Т., Симирский В. Н. Методы иммунохимического анализа в биологии развития. - М.: Наука, 1981. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 20 25 Тест-система імуноферментна "DIA-HCV-IgG-IgM-d" для визначення антитіл класів IgG та IgM до окремих білків (NS3, NS4, NS5, core) вірусу гепатиту С, в якій використовується імуносорбент, в лунки якого внесені рекомбінантні поліпептиди core, NS3, NS4, NS5 - (кожний антиген сорбований на трьох окремих стрипах), аналоги антигенів вірусу гепатиту С (ВГС) і кон'югат, яка відрізняється тим, що в складі кон'югатів використовують суміш моноклональних антитіл проти IgG та IgM людини, мічені ферментом, а як проявник - однокомпонентний розчин хромогену. Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2