Тест-система для діагностики ринопневмонії коней на основі мікрометоду реакції нейтралізації по пригніченню бляшкоутворення

Реферат: UA 77259 U UA 77259 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі ветеринарної вірусології, зокрема до способів постановки реакції нейтралізації по пригніченню бляшкоутворення і може бути використана в роботі діагностичних та науково-виробничих лабораторій ветеринарної медицини. Реакція нейтралізації (РН) ґрунтується на властивості імунної сироватки, що додається до відповідного вірусу, блокувати його здатність до репродукції в чутливій біологічній системі. Здатність імунної сироватки інактивувати інфекційну активність вірусу є наслідком взаємодії нейтралізуючих антитіл з певними антигенними дотермінантами поверхневих вірусних білків відповідальних за адсорбцію вірусу на клітині-хазяїні. Її застосовують як для ідентифікації виділених вірусів, так і для серологічної діагностики вірусних інфекцій. В технологічний процес постановки РН по пригніченню бляшкоутворення для серологічної діагностики вірусних інфекцій входить приготування розведень парних сироваток крові з 2 - або 4 - разовим інтервалом, додавання до різних розведень сироваток крові суспензії вірусу в дозі 100 БТО/0,1 мл інкубацією отриманих сумішей при температурі +37 °C в термостаті протягом 2-х годин, внесенням кожної суміші в 4 флакони з-під пеніциліну з 24-48 годинною моношаровою культурою клітин з попереднім видаленням з них середовище росту. Після інкубації суміші сироватки та вірусу видаляють та заливають живильним агаровим покриттям. Культуру клітин інкубують при температурі +37 °C в СО2 - інкубаторі протягом 7 днів. Облік результатів РН по пригніченню бляшкоутворення проводять щодня протягом 7 діб, шляхом перегляду під малим збільшенням мікроскопа. Реакцію вважають позитивною при цілковитій відсутності бляшок або зниження їх кількості на 80 % при повноцінному контролі вірусу в наявності близько 50 - 100 бляшок), відсутність бляшок в культурі, що інокульована сумішшю вірусу з специфічною імунною сироваткою та відсутності бляшок та слідів дегенерації в контролях культури клітин (Посібник з медичної вірусології за редакцією Гиріна В.М.. – К.: Здоров'я, 1995. - 84-86; Диагностика вирусных болезней животных: Справочник /В.Н. Сюрин, Р.В. Белоусова, Н.В. Фомина. - М.: Агропромиздат, 1991. - С. 177). Недоліком цього способу є те, що для свого застосування він потребує значної кількості компонентів реакції, посуду, перешкоджаючи цим масовим діагностичним дослідженням. Задачею корисної моделі є розроблення тест-системі, що скоротить витрати реагентів. Поставлена задача вирішується тим, що у тест-системі використовують 96-лункові планшети малого об'єму і автоматичні дозатори, що прискорює постановку реакції. Внесення компонентів на сформований моношар полегшує постановку реакції і гарантує об’єктивний результат дослідження. Спосіб постановки мікрометоду реакції нейтралізації по пригніченню бляшкоутворення здійснюється наступним чином: Для проведення реакції беруть робоче розведення вірусу ринопневмонії коней 100 БТО/0,1 мл. Сироватки від хворих та перехворілих коней досліджують парні або одноразово відібрані. Паралельно для контролю, нормальну сироватку крові коня або кроля. Сироватки в розведенні 1:10 перед дослідженням прогрівають у водяній бані протягом 30 хвилин при температурі +56 °C для інактивації неспецифічних термолабільних інгібіторів. 3 Для приготування дослідних проб у лунки планшета вносять по 0,1 см живильного 3 середовища з антибіотиками. В перший ряд лунок додають по 0,1 см сироватки в розведенні 3 1:10. Після перемішування піпетуванням 0,1 см суміші переносять у наступний ряд лунок. Таким чином отримували розведення сироваток. 3 У кожну лунку вносять по 0,1 см вірусу ринопневмонії коней та інкубують суміші при температурі +37 °C протягом 2-ох годин. Одночасно ставлять контролі: 1. Контроль культури клітин: у 4 лунки вносять тільки суміш живильного агарового покриття, для виявлення неспецифічної деградації клітин. 2. Контроль специфічності вірусу: - робоче розведення вірусу змішують з дворазовими розведеннями специфічної сироватки інактивованої при +56 °C в розведенні 1:10 - робоче розведення вірусу змішують з дворазовими розведеннями нормальної сироватки; інактивованої при +56 °C в розведенні 1:10 3. Контроль робочого розведення вірусу: з робочого розведення вірусу готують 4 ряди 3 десятиразових розведень, так щоб у лунках було по 100, 10, 1,0 бляшок вірусу в об'ємі 0,2 см . Потім суміші переносять в планшет із сформованим моношаром клітин, з якого попередньо видалили ростове середовище. Після інкубації сумішей протягом 2-х годин при 37 °C їх видаляють та заливають живильним агаровим покриттям та поміщають в термостат в пристрої 1 UA 77259 U 5 10 15 для культивації клітин (Патент № 67895 Україна, МПК G01N33/00, № u201109473. Заявлено 28.07.2011; Опубл.12.03.2012; Бюл. № 5.). Облік результатів реакції нейтралізації з контролями проводять щодня протягом 7 діб, шляхом перегляду під малим збільшенням мікроскопа. Реакцію вважають позитивною при відсутності бляшкоутворення в лунках з досліджуваною сироваткою, зважаючи на наявність бляшок у контролях вірусу, відсутність бляшок в культурі, що інокульована сумішшю вірусу із специфічною імунною сироваткою і відсутності слідів дегенерації в контролях культури клітин. Титр сироваток розраховують за Рідом і Менчем. Діагностичним титром проти 100 БТЩ 50/0,1 мл вірусу вважають розведення сироватки 1:80 і більше. Якщо сироватка нейтралізує вірус не менше ніж у 50 % заражених культур клітин в лунках, то можна ставити позитивний діагноз на ринопневмонію коней. Експериментальні дослідження показали, що розроблена тест-система для діагностики ринопневмонії коней є високочутливою, специфічною, а сам спосіб постановки мало трудомістким. Користуючись цим способом можна проводити масові діагностичні обстеження із значною економією антигену та контрольних сироваток. Запропонована тест-система знайде застосування у вірусологічних лабораторіях ветеринарної медицини та науково-дослідних установах. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 20 25 Тест-система для діагностики ринопневмонії коней на основі мікрометоду реакції нейтралізації по пригніченню бляшкоутворення, що включає зв'язування вірусу із специфічними антитілами та ідентифікацією виділеного вірусу з використанням явно позитивної до вірусу ринопневмонії коней сироватки, яка зв'язує вірус, що проявляється відсутністю цитопатичної дії в культурі клітин, яка відрізняється тим, що використовують 96-лункові планшети і автоматичні дозатори із змінними наконечниками для зменшення витрат реагентів, часу, праці, використання сформованого на планшеті моношару клітин робить реакцію більш чутливою та специфічною. Комп’ютерна верстка Д. Шеверун Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2