Тест-система на основі мікрометоду реакції нейтралізації для діагностики інфекційної анемії коней

Реферат: UA 71600 U UA 71600 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі ветеринарної вірусології, зокрема до способів постановки реакції нейтралізації і може бути використана в роботі діагностичних та наукововиробничих лабораторій ветеринарної медицини. Реакція нейтралізації (РН) ґрунтується на властивості імунної сироватки, що додається до відповідного вірусу, блокувати його здатність до репродукції в чутливій біологічній системі. Здатність імунної сироватки інактивувати інфекційну активність вірусу є наслідком взаємодії нейтралізуючих антитіл з певними антигенними дотермінантами поверхневих вірусних білків, що відповідають за адсорбцію вірусу на клітині-хазяїні. Її застосовують як для ідентифікації виділених вірусів, так і для серологічної діагностики вірусних інфекцій. У загальноприйнятий технологічний процес постановки РН у культурі клітин для серологічної діагностики вірусних інфекцій входить приготування розведень парних сироваток крові з 2- або 4-разовим інтервалом, додавання до різних розведень сироваток крові суспензії вірусу в дозі 3 100 ТЦД50 у 0,1 см , інкубацією отриманих сумішей при температурі 37 °С протягом 1-2 години, внесенням кожної суміші в 4 пробірки з 24-48- годинною моношаровою культурою клітин з попереднім видаленням з них сироватки росту. Культуру клітин інкубують при температурі 37 °С протягом 7 днів. Облік результатів РН проводять щодня протягом 7 діб шляхом перегляду під малим збільшенням мікроскопа. Реакцію вважають позитивною при відсутності цитопатичної дії (ЦПД) вірусу в пробірках з досліджуваною сироваткою, зважаючи на наявність ЦПД у контролях вірусу, відсутність ЦПД в культурі, що інокульована сумішшю вірусу зі специфічною імунною сироваткою і відсутності слідів дегенерації в контролях культури клітин (Руководство по лабораторной диагностике вирусных и реккетсиозных болезней /под. ред. П.Ф. Здроводского и проф. М.И. Соколова.- М.: Издательство "Медицина", 1965. - 591 с. Посібник з медичної вірусології/ за ред. В.М. Гиріна. - К.: Здоров'я, 1995. - 367 с. Диагностика вирусных болезней животных: Справочник// В.Н. Сюрин, Р.В. Белоусова, Н.В. Фомина.- М.: Агропромиздат, 1991. 527с). Недоліком цього способу є те, що для свого застосування він потребує значної кількості компонентів реакції, посуду, що перешкоджає цим масовим діагностичним дослідженням. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити тест-систему, яка в десять раз зменшує витрати реагентів, часу, праці та полегшує постановку реакції. Поставлена задача вирішується таким чином, що тест-система на основі мікрометоду реакції нейтралізації для діагностики інфекційної анемії коней, що включає зв'язування вірусу зі специфічними антитілами та ідентифікацією виділеного вірусу з використанням явно позитивної до вірусу інфекційної анемії коней сироватки, яка зв'язує вірус, що проявляється відсутністю цитопатичної дії в культурі клітин, яка відрізняється тим, що використовують 96-лункові планшети і автоматичні дозатори із змінними наконечниками для зменшення витрат реагентів, часу та праці, а також робить реакцію більш чутливою і специфічною. Спосіб постановки мікрометоду реакції нейтралізації, здійснюється наступним чином. Для 3 проведення реакції беруть робоче розведення вірусу інфекційної анемії коней 100 ТЦД 50/0,1 см . 3 Для приготування дослідних проб у лунки планшета вносять по 0,1см живильного середовища 3 з антибіотиками. В перший ряд лунок додають по 0,1 см сироватки, яку перед дослідженням прогрівають у водяній бані протягом 30 хвилин при температурі 56 °C для інактивації 3 неспецифічних термолабільних інгібіторів. Після перемішування піпетуванням 0,1см суміші переносять у наступний ряд лунок. Таким чином отримували дворазові розведення сироваток. 3 У кожну лунку вносять по 0,1см вірусу інфекційної анемії коней. Одночасно ставлять контролі: 1. Контроль культури клітин: у 4 лунки вносять тільки живильне середовище, для виявлення неспецифічної дегенерації клітин. 2. Контроль токсичності сироватки: у 4 лунки вносять сироватку в найменшому розведенні, яке використовували в реакції. 3. Контроль специфічності вірусу: робоче розведення вірусу змішують з дворазовими розведеннями специфічної сироватки; робоче розведення вірусу змішують з дворазовими розведеннями нормальної сироватки. 4. Контроль робочого розведення вірусу: з робочого розведення вірусу готують 4 ряди 3 десятиразових розведень, так щоб у лунках було по 100, 10, 1, 0,1 доз вірусу у об'ємі 0,2 см . Планшет ставлять на одну годину в СО 2 - інкубатор для контакту вірусу з сироватками. Потім суміші переносять у планшет із сформованим моношаром клітин, з якого попередньо видалили ростове середовище. Облік результатів реакції нейтралізації з контролями проводять щодня протягом 7 діб шляхом перегляду під малим збільшенням мікроскопа. Реакцію вважають позитивною при 1 UA 71600 U 5 10 відсутності ЦПД в лунках з досліджуваною сироваткою, зважаючи на наявність ЦПД у контролях вірусу, відсутність ЦПД в культурі, що інокульована сумішшю вірусу зі специфічною імунною сироваткою і відсутності слідів дегенерації в контролях культури клітин. Титр сироваток розраховують за Рідом і Менчем. Діагностичним титром проти 100 ТЦД 50/0,1 3 см вірусу вважають розведення сироватки 1:80 і більше. Якщо сироватка нейтралізує вірус не менш як у 50 % заражених культур клітин у лунках, то можна ставити позитивний діагноз на інфекційну анемію коней. Експериментальні дослідження проведені, в лабораторії Інституту епізоотології НААН, показали, що розроблена тест-система для діагностики інфекційної анемії коней є високочутливою, специфічною, а сам спосіб постановки не трудомісткий. Користуючись цим способом, можна проводити масові діагностичні обстеження із значною економією антигену та контрольних сироваток. Запропоновано тест-система знайде застосування у вірусологічних лабораторіях ветеринарної медицини та науково-дослідних установах. 15 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 20 Тест-система на основі мікрометоду реакції нейтралізації для діагностики інфекційної анемії коней, що включає зв'язування вірусу зі специфічними антитілами та ідентифікацією виділеного вірусу з використанням явно позитивної до вірусу інфекційної анемії коней сироватки, яка зв'язує вірус, що проявляється відсутністю цитопатичної дії в культурі клітин, яка відрізняється тим, що використовують 96-лункові планшети і автоматичні дозатори із змінними наконечниками для зменшення витрат реагентів, часу та праці, а також робить реакцію більш чутливою і специфічною. 25 Комп’ютерна верстка Д. Шеверун Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2