Спосіб вирощування культури калюсних тканин раувольфії зміїної rauwolfia serpentina benth. – продуцента аймаліну

1. Спосіб вирощування культури калюсних тканин раувольфії зміїної Rauwolfia serpentina Benth. - продуцента аймаліну, який включає вирощування біомаси культивованих клітин на живильних середовищах, позбавлених регуляторів росту, який відрізняється тим, що вирощування біомаси культивованих клітин раувольфії зміїної Rauwolfia serpentina Benth. виконують протягом одного пасажу (циклу вирощування) на твердому живильному середовищі 5С наступного складу, мг/л: NH4NO3 400 - 600 KNO3 1000 - 1200 Са(NО3)2 . 4H2O 800 - 1000 КСl 60 - 80 MgSO4 . 7H2O 400 - 600 NH4H2PO4 500 - 700 (NH4)2HPO4 50 - 150 (NH4)2SO4 200 - 400 KI 0,8 - 0,9 Na2MoO4 . 2H2O 0,2 - 0,3 CuSO4 . 5H2O 0,02 - 0,03 CoCl2 . 6H2O 0,02 - 0,03 MnSO4 . 5H2O 21 - 23 Н3ВО3 6,0 - 6,5 ZnSO4 . 4H2O 10 - 11 FeSO4 . 7H2O 27 - 28 2 (19) 1 3 Винахід відноситься до галузі біотехнології і стосується способу вирощування калюсної культури тканин раувольфії зміїної Ranwolfia serpentina Benth. - продуцента аймаліну, який використовується в якості протиаритмічного лікарського засобу. Найбільш близьким до пропонованого винаходу за кількістю суттєвих ознак є спосіб вирощування культури тканин раувольфії зміїної Raifwolfia serpentina Benth. - продуцента аймаліну, який включає вирощування біомаси культивованих клітин на живильних середовищах, позбавлених регуляторів росту /Кунах В. А. Біотехнологія лікарських рослин. Генетичні та фізіолого-біохімічні основи. - К.: Логос, 2005, 720 с./. Описаний спосіб включає поверхневе вирощування, яке є малотехнологічним, оскільки тривалість вирощування калюсу від пересадки до збирання врожаю складає від 70 до 120 діб і потребує значних матеріальних і трудових витрат. Альтернативним способом може бути вирощування культури тканин у рідкому, простішому за складом живильному середовищі у біореакторах (ферментерах) або на шейкерах. Проте відомі продуктивні суспензійні культури раувольфії зміїної потребують особливих умов вирощування і спеціального обладнання, що перешкоджає їх впровадженню у виробництво (1,2). Умови глибинного вирощування калюсних тканин відпрацьовано лише для порівняно низькопродуктивної клітинної лінії А раувольфії зміїної, калюсні тканини продуктивніших штамів у рідкому живильному середовищі ростуть погано, або й зовсім не ростуть і через короткий проміжок часу вирощування гинуть (1). У основу пропонованого винаходу поставлено задачу створення такого способу вирощування калюсної культури тканин раувольфії зміїної (високопродуктивного штаму К-27 раувольфії зміїної), який би забезпечив прискорення накопичення аймаліну в біомасі, забезпечив би його підвищений вихід за рахунок вирощування в рідкому живильному середовищі спрощеного складу. Зазначена задача вирішується пропонованим способом, який, як і відомий спосіб вирощування культури калюсних тканин раувольфії зміїної Rauwolfia serpentina Benth. – продуцента аймаліну, включає вирощування біомаси культивованих клітин на живильних середовищах, позбавлених регуляторів росту, а, відповідно до винаходу, вирощування біомаси культивованих клітин раувольфії зміїної Rauwolfia serpentina Benth. виконують протягом одного пасажу (циклу вирощування) на твердому живильному середовищі 5С наступного складу, мг/л: NH4NO3 400 - 600 KNO3 1000 - 1200 Са(NО3)2 4H2O 800 - 1000 КС1 60-80 MgSO4 7H2O 400 - 600 NH4H2PO4 500 - 700 (NH4)2HPO4 50 - 150 (NH4)2SO4 200 - 400 KJ 0,8 - 0,9 Na2MoO4 2H2O 0,2 - 0,3 CuSO4 5H2O 0,02 - 0,03 77366 4 CoCL2 6H2O 0,02 - 0,03 MnSO4 5H2O 21-23 Н3ВО3 6,0 - 6,5 ZnSO4 4H2O 10 - 11 FeSO4 7H2O 27 - 28 Na2 ЕДТА 37 - 38 Тіамін 0,8 - 1,2 Сахароза 5000 Агар 0,6 - 0,8% pH до автоклавування 5,8 – 6,2 на 35 - 45-у добу росту тканину переносять у рідке живильне середовище Рж наступного складу, мг/л: NH4NO3 200 - 400 KNO3 1000 - 1200 Са(NO3)2 4Н2O 800 - 1000 КС1 60 - 80 MgSO4 7Н2O 400 - 600 NH4H2PO4 250 - 290 (NH4)2HPO4 200 - 300 (NH4)2SO4 150 - 250 KJ 0,8 - 0,9 Na2MoO4 2Н2O 0,2 - 0,3 CuSO4 5Н2O 0,02 - 0,03 CoCL2 6Н2O 0,02 - 0,03 MnSO4 5Н2O 21 - 23 Н3ВО3 6,0 - 6,5 ZnSO4 4Н2O 10 - 11 FeSO4 7Н2O 27 - 28 Na2 ЕДТА 37 - 38 Тіамін 0,8 - 1,2 Сахароза 2500 рН до автоклавування 5,8 – 6,2, в якому калюсну тканину вирощують в глибинній культурі протягом 20-35 діб. Особливістю пропонованого способу є і те, що культуру тканин на агаризованому середовищі 5С вирощують не менше 5 пасажів, а потім переносять в рідке живильне середовище Рж, де вирощують калюсну тканину у вигляді глибинної культури протягом 20–35 діб. Пропонований спосіб включає двоетапне вирощування калюсної культури раувольфії зміїної, де першим етапом є вирощування на агаризованому середовищі спеціального складу 5С за (3) без регуляторів росту, а другим етапом - вирощування калюсної тканини в рідкому живильному середовищі без регуляторів росту Рж за (4) з деякими модифікаціями на шейкерах (гойдалках) або в біореакторах (ферментерах). Спосіб ілюструється наступними прикладами та таблицею: Приклад 1. Штам К-27 раувольфії зміїної вирощується в колекції у вигляді калюсної тканини на агаризованому живильномусередовищі 10С наступного складу, мг/л: NH4NO3 2300 - 2600 KNO3 250 - 350 Са(NО3)2 4Н2O 800 - 1000 КС1 50 - 90 MgSO4 7H2O 1200 - 1400 NH4H2PO4 100 - 300 (NH4)2HPO4 250 - 350 (NH4)2SO4 200 - 400 5 77366 6 KJ 0,8 - 0,9 CoCL2 6H2O 0,02 - 0,03 Na2MoO4 2H2O 0,2 - 0,3 MnSO4 5H2O 21 - 23 CuSO4 5H2O 0,02 - 0,03 Н3ВО3 6,0 - 6,5 CoCL2 6H2O ZnSO4 4H2O 0,08 - 0,12 10 - 11 MnSO4 5H2O 21 - 23 FeSO4 7H2O 27 - 28 Н3ВО3 10 - 12 Na2 ЕДТА 37 - 38 Тіамін 0,8 - 1,2 ZnSO4 4H2O 10 - 11 Сахароза 2500 FeSO4 7H2O 27 - 28 pH до автоклавування 5,8 – 6,2 Na2 ЕДТА 37 - 38 Приготовлене рідке середовище розливають Тіамін 4-6 по 50мл в колби Ерленмейера об'ємом 250-300мл, Сахароза 10000 стерилізують і в кожну з них в асептичних умовах Агар 0,6 - 0,8% вносять 5-6г живої біомаси калюсної тканини, поpH до автоклавування 5,8 – 6,2 передньо вирощеної на середовищі 5С. Колби з Першим етапом вирощування за пропоновависадженими експлантами ставлять на шейкери ним способом є перенесення калюсної тканин (гойдалки) з циклом коливань 50-60обертів/хв і штаму К-27 на інше агаризоване живильне серевирощують протягом 25-35 діб. Отриману калюсну довище 5С за (3) без регуляторів росту наступного тканину збирають, видаляють з неї залишки живискладу, мг/л: льного середовища, висушують до стану повітряNH4NO3 400 - 600 но-сухої біомаси при температурі 54-55°С і визнаKNO3 1000 - 1200 чають у ній вміст аймалі-ну. 800 - 1000 Са(NО3)2 4Н2O Швидкість накопичення аймаліну в сухій біоКС1 60 - 80 масі калюсної тканини штаму К-27 раувольфії змії400 - 600 MgSO4 7H2O ної за її вирощування двоетапним процесом, друNH4H2PO4 500 - 700 гим етапом якого є глибинне вирощування в (NH4)2HPO4 80 - 110 рідкому живильному середовищі Рж спеціального (NH4)2SO4 200 - 400 складу зростає вдвічі-втричі порівняно з відомим KJ 0,8 - 0,9 способом вирощування на агаризованому середо0,2 - 0,3 Na2MoO4 2H2O вищі 10С. За рахунок цього термін вирощування 0,02 - 0,03 CuSO4 5H2O калюсної тканини, яка накопичує 1% аймаліну і 0,02 - 0,03 CoCL2 6H2O більше суттєво скорочується - до 20 - 35 діб, тоб21 - 23 MnSO4 5H2O то, практично, втричі. Порівняльні дані динаміки Н3ВО3 6,0 - 6,5 накопичення аймаліну в біомасі за її вирощування 10 - 11 ZnSO4 4H2O згідно розробленого та відомого способів наведені 27 - 28 FeSO4 7H2O в таблиці. Na2 ЕДТА 37 - 38 Приклад 2. Агаризоване живильне середовиТіамін 0,8 - 1,2 ще 5С готують за прикладом 1. Калюсну тканину Сахароза 5000 штаму К-27 раувольфії зміїної вирощують на цьоАгар 0,6 - 0,8% му середовищі не менше п'яти (до 10 - 12) пасажів pH до автоклавування 5,8 – 6,2 за тривалості пасажу 35-45 діб. Після цього тканиПриготовлене середовище розливають по 50 ну переносять в рідке живильне середовище Рж і мл у колби Ерленмейера об'ємом 250 мл, стерилівирощують згідно прикладу 1. Швидкість накопизують в автоклаві гарячою парою при 1 атм 15-20 чення аймаліну зростає і порівняно з відомим прохвилин. Для пересадки використовують охололе цесом вміст аймаліну в сухій біомасі на 20 - 35 середовище. добу росту підвищується у 3 -4 рази, сягаючи 1,8% У колби в асептичних умовах вносять 5-6 грам (таблиця). живої біомаси калюсної тканини 30-45-добового Інші процеси (способи) вирощування у глибинвіку, яка виросла на колекційному середовищі 5С. ній культурі в різних за складом середовищах, у Колби з висадженими на середовищі 10С експлантому числі пряме перенесення калюсної тканини тами ставлять у термостатоване темне приміщенштаму К-27 із агаризованого середовища 10С в 0 () ня (t = 25 - 28 C, відносна вологість повітря - 70 рідке середовище Рж позитивного ефекту не да80%). ють. Через 30-45 діб калюс переносять в рідке жиВисновок. Запропонований спосіб вирощуванвильне середовище Рж (другий етап вирощування калюсної тканини штаму К-27 раувольфії зміїної ня) наступного складу, мг/л: на спрощених за складом живильних середовищах NH4NO3 200 - 400 без регуляторів росту, спочатку на агаризованому КNО3 1000 - 1200 середовищі 5С, а потім у рідкому живильному сеCa(NO3)2 4Н2O 800 - 1000 редовищі Рж на шейкерах, у 2 -4 рази підвищує КС1 60 - 80 швидкість накопичення аймаліну в сухій біомасі. MgSO4 7H2O 400 - 600 Це дозволяє: 1) удвічі - втричі скоротити термін NH4H2PO4 250 - 290 вирощування калюсної тканини до збору врожаю (NH4)2HPO4 20 - 30 (з 70 - 90 діб за відомим способом до 20 - 35 діб за (NH4)2SO4 150 - 250 розробленим способом) та 2) зменшити трудові та KJ 0,8 - 0,9 матеріальні витрати при отриманні аймаліну внаNa2MoO4 2H2O 0,2 - 0,3 слідок вирощування калюсних тканин на простіших CuSO4 5H2O 0,02 - 0,03 за складом живильних середовищах на шейкерах 7 77366 8 або у ферментерах у вигляді глибинної культури слідок швидкого накопичення аймаліну в біомасі. та значного скорочення об'ємів виробництва внаТаблиця Динаміка накопичення аймаліну в сухій біомасі культури тканин штаму К-27 раувольфії зміїної за його вирощування згідно відомого та розробленого процесів (середнє з трьох дослідів по 5 повторностей у кожному) Доба росту 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 60 Розроблений процес за приклаВідомий продом 1 цес, вміст айВміст аймаліну, ефект стимулямаліну, % % ції, % 0,40 0,41 102,5 0,39 0,49 125,6 0,35 0,69 197,1 0,32 1,00 312,5 0,40 1,08 270,0 0,48 1,08 225,0 0,61 1,12 183,6 0,73 1,01 138,4 0,85 1,07 125,9 0,92 1,12 121,7 0,98 1,15 117,4 Джерела інформації 1. Кунах В. А. Біотехнологія лікарських рослин. Генетичні та фізіолого-біохімічні основи. К.: Логос, - 2005. - 720с. 2. Деклараційний патент України №42150А, МПК 6 C12N5/04. Штам культивованих клітин раувольфії зміїної Rauwolfia serpentina Benth. продуцент аймаліну // Кунах В. А., Можилевська Л. П., Алпатова Л. К., Кацан В. А., Адонін B. I. Опубл. 15.10.2001, Бюл. №9. Комп’ютерна верстка Л. Купенко Розроблений процес за прикладом 2 Вміст аймаліну, Ефект стимуля% ції, % 0,58 145,0 0,62 159,0 0,84 240,0 1,12 350,0 1,59 397,5 1,75 364,6 1,81 296,7 1,83 250,7 1,78 209,4 1,75 190,2 1,79 182,7 3. Патент України №10338А, МПК 6 C12N5/00, C12N5/02. Живильне середовище для одержання і вирощування калюсних тканин рослин // Кунах В. А., Алпатова Л. К., Можилевська Л. П. - Опубл. 25.12.96, Бюл, №4. 4. И. Е. Каухова, А. Г. Воллосович, В. А. Цыганков. Выбор питательной среды для глубинного культивирования тканей раувольфии змеиной (Rauwolfia serpentina Benth.) // Растительные ресурсы, 1981, т. 17, №2, с. 217-224. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601