Штам культивованих клітин раувольфії зміїної rauwolfia serpentina benth. – продуцент аймаліна

Штам культивованих клітин раувольфії зміїної Rauwolfia serpentma Benth - продуцент аймаліна, який зареєстровано в Колекції клітинних культур Інституту молекулярної біологи і генетики НАН України під номером 8 Штам культивованих клітин раувольфії зміїної Rauwolfia serpentma Benth, - продуцент аймаліна Винахід відноситься до галузі біотехнологп і може бути використаний у фармацевтичній промисловості Аймалін або його ПОХІДНІ (наприклад, N-4 пропілаймалін бромід, N-4 пропілаймалін бітартрат) сьогодні є найбільш ефективними, а враховуючи меншу побічну дію - найбільш рекомендованими лікарськими засобами серед відомих препаратів для лікування шлуночкових аритмій серцевої ДІЯЛЬНОСТІ Сировиною для отримання аймаліна є деякі тропічні рослини роду Раувольфія Альтернативним джерелом отримання аймаліна можуть бути культивовані клітини цих рослин Завдання вирішується створенням нового штаму Раувольфія R-31 Родові культури Штам походить від ауксин- і цитокіншнезалежного штаму Rauwolfia R III культури клітин раувольфії зміїної [2], що в свою чергу походить від клітинної лінії А [1] Штам Раувольфія R-31 отримано шляхом тонування окремих КЛІТИН І невеликих (до 25-30 КЛІТИН) агрегатів штаму Rauwolfia R III та тривалої селекції за найштенсивнішим ростом та найбільшим вмістом ІНДОЛІНОВИХ алкалоїдів Штам Раувольфія R-31 вберігається в Колекції клітинних культур інституту молекулярної біологи і генетики НАН України під номером 8 Число пасажів на момент паспортизації (20 01 2000 р ) -170 Стандартні умови вирощування Вирощування штаму проводиться одностадійним способом в рідкому середовищі при температурі 24-26°С, вологості повітря - 70-80%, відсутності освітлення, постійному перемішуванні на качалці при 60-80 об/хв Склад живильного середовища , мг/л ВІДОМІ КЛІТИННІ штами раувольфії зміїної Rau wolfia serpentma Benth , що накопичують понад 1% аймаліна [1], однак вони не є технологічними, тому що вирощуються на агаризованому живильному середовищі Відомий також більш технологічний штам Rauwolfia R III, що вирощується в рідкому живильному середовищі у вигляді суспензійної культури Штам Rauwolfia R III накопичує на 45-50 день вирощування 1,35-1,45% суми алкалоїдів, при цьому частка аймаліна складає 0,28-0,58% від сухої маси клітин (2, прототип), що є недостатнім рівнем продуктивності Суму алкалоїдів ІНДОЛІНОвого ряду визначають на основі кольорової реакції з НІЧОз згідно фотометричному методу [3], аймалін та ІНШІ індивідуальні алкалоїди - методом мікроколоночної хроматографії [4] Завданням винаходу є підвищення продуктивності культивованих клітин раувольфії зміїної по накопиченню аймаліна при вирощуванні в рідкому живильному середовищі NH4NO3 KNO3 (NH4)2SO4 MgSO4-7H2O Ca(NO3)2-4H2O NH4H2PO4 (NH4)2HPO4 KCL KJ Na2MoO4-2H2O CuSO4-5H2O CoCL2-2H2O MnSO4-5H2O H3BO3 290-310, 1000-1200, 190-210, 490-510, 890-910, 270-280, 0,02-0,03, 65-75, 0,78-0,88, 0,22-0,28, 0,022-0,028, 0,08-0,12, 23,1-25,1, 8,3-10,3, О Ю 42150 ZnSO4-7H2O 9,52-11,52, FeSO4-7H2O 26,7-28,7, №2-ЕДТА 35,0-39,0, тіаміна бромід 0,9-1,1, сахароза 24000-26000, вода до1 л, 5,5-5,6 рН Режим стерилізації середовища - 115-120°С (гарячою парою) протягом 15-20 хв Штам хараісгеризується наступними ознаками Культуральні ознаки Штам представляє собою суспензію від сіробілого до жовто-білого кольору Вирощування здійснюється в конічних колбах в стерильному живильному середовищі Режим пересіву культури ~ 14-18 днів Тривалість культивування - 25-35 днів Маса шокуляту для засіву складає 3-4 г на 1 л середовища (розрахунок по сухій біомасі) Відсутність інфекції мікроорганізмами Особливості росту Раувольфія R-31 характеризується вирівняним однотипним ростом Крива росту має типовий S-подібний характер з виходом на стаціонарну фазу на 14-18 добу В цей час КІЛЬКІСТЬ КЛІТИН скла дає 1,6-2,8-Ю6 в мл, серед них живі клітини складають понад 80% Карюлопчні ознаки Культура є МІКСОПЛОІДНОЮ клітинною популяцією Межі варіювання мітотичне активних клітин за числом хромосом від 16 до 80 Більш ЯК 75% клітин мають від 40 до 60 хромосом при 2п-22 Частота анафаз з абераціями хромосом не перевищує 3%, при цьому анафази зі свіжими розривами хромосом (анафази в фрагментами) складають менше 1% від суми анафаз Цитоморфолопчні ознаки Суспензія складається з округлих та видовжених клітин, що утворюють ланцюжки Окремі клітини зустрічаються рідко Розміри клітин від 22 до 160 мкм, найчастіше зустрічаються клітини середніх розмірів найчастіше зустрічаються ядра середніх розмірів - 9-12 мкм Зустрічаються елементи диференціації клітин у вигляді волокон діаметром 40-80 мкм, що довжиною сягають 5 мм і більше Здатність культури до морфогенезу В стандартних умовах вирощування культура до морфогенезу не здатна Протягом 1989-1999 років це спостерігали утворення стеблових бруньок, формування пагонів чи коренів Маркерні ознаки Приріст біомаси штаму на 20-25 день росту складає 12-15 г, в окремих випадках до 17 г сухої маси в перерахунку на 1 л живильного середовища Ростовий індекс 4-5 Протягом пасажу (тривалість пасажу - 14-16 днів) спостерігається один підйом мітотичної активності на 2-7 день росту із значенням мітотичного індексу 1,8-3,1% Найвищий мітотичний індекс (56%) спостерігається на третій - четвертий день росту з падінням на 7-8 день Культура здатна до росту на середовищі з глюкозою, де и продуктивність може бути вища, ніж на середовищі з сахарозою Накопичення аймаліна в КІНЦІ циклу вирощування (30-35 днів) 8,8-1,1% від сухої біомаси Розмах МІНЛИВОСТІ за числом хромосом - від 16 до 80 при модальному класі, який формується поЛІПЛОІДНИМИ(4П-5П) клітинами Культурі властивий низький рівень структурних перебудов хромосом, що виявляється в анафазі мітозу - біля 3, при цьому анафази з фрагментами складають лише 1% від суми анафаз БІОХІМІЧНІ та бютехнолопчні ознаки ІНДОЛІНОВІ алкалоїди накопичуються в біомасі культивованих клітин, в живильне середовище виділяється до 5 синтезованих алкалоїдів Висушена на 25-35 день росту при 50-55°С біомаса містить 1,7-2,1% суми алкалоїдів Вміст алкалоїдів групи індоліна при цьому складає 0,8-1,2%, з них чястка аймаліна - 85-90% Всього біомаса містить не менше 20 алкалоїдів, при цьому основними є аймалін (0,8-1,1%) і воміленш (0,3-0,5%) Життєздатність штаму та стабільність продукування ІНДОЛІНОВИХ алкалоїдів перевірена протягом 10 років (1989-1999) Винахід ілюструється такими прикладами Приклад 1 В КОНІЧНІ колби об'ємом 250-300 мл розливають по 50 мл живильного середовища, склад якого та умови культивування наведено вище На ЗО добу біомасу висушують при температурі 50-55°С та аналізують фотоколоримеричним методом [3] на загальний вміст ІНДОЛІНОВИХ алкалоїдів та хроматографічне [4] на вміст аймаліну та інших алкалоїдів Результати вимірювань дев'яти партій сировини, отриманої в різний час, наведено втабл 1 Приклад 2 Вирощують та аналізують культуру аналогічно до прикладу 1 Але в склад живильного середовища замість сахарози додають глюкозу в концентрації 25000 мг/л Результати вимірювань дев'яти партій сировини, отриманої в різний час, наведено втабл 2 Наведені результати свідчать проте, що штам Раувольфія R-31 культивованих клітин раувольфії зміїної перевищує відомий штам Rauwolfia R III no накопиченню як ІНДОЛІНОВИХ алкалоїдів, так і аймаліна більше ніж ВДВІЧІ За рахунок скорочення циклу вирощування до збору врожаю з 45-50 днів (прототип) до 25-35 днів (штам Раувольфія R-31), підвищення виходу біомаси та накопичення алкалоїдів, загальна продуктивність штама Раувольфія R-31 перевищує прототип - відомий штам Rauwolfia R III по ІНДОЛІНОВИХ алкалоїдах на 345-367%, а по аймаліну - на 388-410% (табл 3) Джерела інформації 1 Кунах В А Геномная изменчивость и накопление индолиновых алкалоидов в культуре клеток раувольфии змеиной Rauwolfia serpentma Benth // Биополимеры и клетка -1994 - 10, N 1 - С 3-30 2 А с 1336563 СССР МПКС12Ы5/00 Штамм Rauwolfia serpentma Benth , используемый для получения аймалина / Кунах В А , Каухова И Е , Алпатова Л К , Костенюк И А , Воллосович А Г - приоритет от 13 12 84, зарегистр 08 05 87 (непубл) (прототип) 3 Воллосович А Г , Николаева Л А , Позднякова Н Н , Пучинина Т Н Метод количественного определения алкалоидов группы индолина в культуре ткани Rauwolfia serpentma Benth // Растительные ресурсы - 1977 - XIII - Вып 1 С 127-132 42150 4 Губарь С И , Константинова Е П Микрохроматографичеокий анализ культуры тканей раувольфии на содержание индольных алкалоидов // Физиология растений - 1991 - 38 - Вып 5 С 1023-1031 Таблиця 1 Приріст біомаси та вміст алкалоїдів в суспензії культивованих клітин раувольфії зміїної при їх вирощуванні на середовищі з сахарозою Вихід сухої тканини з 1 л сеВміст алкалоїдів в сухій тканині, % редовища, г Алкалоїди групи індоліна Аймалін Штам Рауво- Відомий штам Штам РаувоВідомий штам Штам Рауво- Відомий штам льфія R-31, Rawolfia R-III, льфія R-31, ЗО Rawolfia R-III, льфія R-31, ЗО Rawolfia R-III, ЗО днів росту 50 днів росту днів росту 50 днів росту днів росту 50 днів росту 1 14,1 13,4 0,94 0,35 0,81 0,28 2 12,9 13,2 0,86 0,38 0,77 0,30 3 12,8 13,6 0,89 0,39 0,75 0,31 4 15,4 13,0 0,88 0,44 0,78 0,35 5 15,6 13,4 0,95 0,45 0,86 0,34 6 13,2 12,8 1,18 0,52 1,00 0,39 7 13,4 13,4 0,82 0,72 0,72 0,58 8 15,8 14,2 0,93 0,35 0,84 0,29 9 15,4 13,5 1,09 0,82 0,98 0,58 Середнє 14,3+0,4 13,4+0,5 0,95+0,03 0,49+0,05 0,83+0,02 0,38+0,07 Партія сировини Таблиця 2 Приріст біомаси та вміст алкалоїдів в біомасі штама Раувольфія R-31 при вирощуванні на середовищі з глюкозою на 30-й день росту Партія сировини 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Середнє Вихід сухої тканини з 1 л середовища, г 11,4 13,6 16,8 16,6 14,8 12,6 13,4 14,8 14,7 14,3+0,5 Вміст алкалоїдів в сухій тканині, % Алкалоїди групи індоліна Аймалін 1,26 1,09 1,16 0 93 1,07 0,96 0,99 0,88 0,98 0,86 1,03 0,92 0,93 0,81 0,83 0,71 0,88 0,76 1,01+0,04 0,88+0,03 Таблиця З Продуктивність суспензійних культур культивованих клітин раувольфії зміїної Штамм Rauwolfia R-III (прототип) Раувольфія R-31 Тип цукру в середовищі Вихід алкалоїдів з 1 л середовища за добу Алкалоїди групи індоліна Аймалін мг % відносно прототипу мг % відносно прототипу сахароза 1,31 100,0 1,02 100,0 сахароза глюкоза 4,53 4,81 345,8 367,2 3,96 4,19 388,2 410,8 42150 ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Киів-133, бульв Лесі Українки, 26 (044)295-81-42, 295-61-97 Підписано до друку 2002 р Формат 60x84 1/8 Обсяг обл -вид арк Тираж 50 прим Зам УкрІНТЕІ, 03680, Киів-39 МСП, вул Горького, 180 (044) 268-25-22