Процес вирощування калюсної культури тканин раувольфії зміїної

1. Процес вирощування культури калюсних тканин раувольфії зміїної Rauwolfia serpentina Benth. - продуцент аймаліну, який включає вирощування біомаси культивованих клітин на живильних середовищах, позбавлених регуляторів росту, який відрізняється тим, що вирощування біомаси культивованих клітин раувольфії зміїної Rauwolfia serpentina Benth. виконують протягом принаймні одного пасажу (циклу вирощування) на твердому живильному середовищі 5С наступного складу, мг/л: NH4NO3 400-600 KNO3 1000-1200 Са(NO3)2 4H2O 800-1000 KСl 60-80 MgSO4 7H2O 400-600 NH4H2PO4 500-700 (NH4)2HPO4 50-150 (NH4)2SO4 200-400 KJ 0,8-0,9 Na2MoO4 2H2O 0,2-0,3 CuSO4 5H2O 0,02-0,03 CoCL2 6H2O 0,02-0,03 MnSO4 5H2O 21-23 Н3ВО3 6,0-6,5 ZnSO4 4H2O 10-11 FeSO4 7H2O 27-28 U 2 UA 1 3 14450 4 них середовищах, позбавлених регуляторів росту на 35-45-у добу росту тканину переносять у рідке [Кунах В.А. Біотехнологія лікарських рослин. Генеживильне середовище Рж наступного складу, мг/л: тичні та фізіолого-біохімічні основи. - К.: Логос, NH4NO3 200-400 2005, 720с.]. KNO3 1000-1200 Описаний процес включає поверхневе вироСа(NO3)2 4Н2О 800-1000 щування, яке є малотехнологічним, оскільки триKСl 60-80 валість вирощування калюсу від пересадки до MgSO4 7H2O 400-600 збирання врожаю складає від 70 до 120 діб і потNH4H2PO4 250-290 ребує значних матеріальних і трудових витрат. (NH4)2HPO4 200-300 Альтернативним способом може бути вирощуван(NH4)2SO4 150-250 ня культури тканин у рідкому, простішому за склаKJ 0,8-0,9 дом живильному середовищі у біореакторах (ферNa2MoO4 2H2O 0,2-0,3 ментерах) або на шейкерах. Проте відомі CuSO4 5H2O 0,02-0,03 продуктивні суспензійні культури раувольфії зміїCoCL2 6H2O 0,02-0,03 ної потребують особливих умов вирощування і MnSO4 5H2O 21-23 спеціального обладнання, що перешкоджає їх Н3ВО3 6,0-6,5 впровадженню у виробництво [1, 2]. Умови глиZnSO4 4H2O 10-11 бинного вирощування калюсних тканин відпрацьоFeSO4 7H2O 27-28 вано лише для порівняно низькопродуктивної кліNa2 ЕДТА 37-38 тинної лінії А раувольфії зміїної, калюсні тканини Тіамін 0,8-1,2 продуктивніших штамів у рідкому живильному сеСахароза 25000 редовищі ростуть погано, або й зовсім не ростуть і pH до автоклавування 5,8-6,2, через короткий проміжок часу вирощування гинуть в якому калюсну тканину вирощують в глибинній [1]. культурі протягом 20-35 діб. У основу пропонованої корисної моделі постаОсобливістю пропонованого процесу є і те, що влено задачу створення такого процесу вирощукультуру тканин на агаризованому середовищі 5С вання калюсної культури тканин раувольфії зміїної вирощують не менше 5 пасажів, а потім перено(високопродуктивного штаму К-27 раувольфії зміїсять в рідке живильне середовище Рж, де вироної), який би забезпечив прискорення накопичення щують калюсну тканину у вигляді глибинної кульаймаліну в біомасі, забезпечив би його підвищетури протягом 20-35 діб. ний вихід за рахунок вирощування в рідкому живиПропонований процес включає двоетапне вильному середовищі спрощеного складу. рощування калюсної культури раувольфії зміїної, Зазначена задача вирішується пропонованим де першим етапом є вирощування на агаризовапроцесом, який, як і відомий процес вирощування ному середовищі спеціального складу 5С за [3] без культури калюсних тканин раувольфії зміїної регуляторів росту, а другим етапом - вирощування Rainvolfia serpentina Benth. - продуцента аймаліну, калюсної тканини в рідкому живильному середовключає вирощування біомаси культивованих клівищі без регуляторів росту Рж за [4] з деякими тин на живильних середовищах, позбавлених ремодифікаціями на шейкерах (гойдалках) або в біогуляторів росту, а, відповідно до пропозиції, вирореакторах (ферментерах). щування біомаси культивованих клітин раувольфії Процес ілюструється наступними прикладами зміїної Rauwolfia serpentina Benth. виконують прита таблицею: наймні один пасаж (цикл вирощування) на тверПриклад 1. Штам К-27 раувольфії зміїної видому живильному середовищі 5С наступного рощується в колекції у вигляді калюсної тканини складу, мг/л: на агаризованому живильному середовищі 10С NH4NO3 400-600 наступного складу, мг/л: KNO3 1000-1200 NH4NO3 2300-2600 Са(NO3)2 4Н2О 800-1000 KNO3 250-350 KСl 60-80 Са(NO3)2 4Н2О 800-1000 MgSO4 7H2O 400-600 KСl 50-90 NH4H2PO4 500-700 MgSO4 7H2O 1200-1400 (NH4)2HPO4 50-150 NH4H2PO4 100-300 (NH4)2SO4 200-400 (NH4)2HPO4 250-350 KJ 0,8-0,9 (NH4)2SO4 200-400 Na2MoO4 2H2O 0,2-0,3 KJ 0,8-0,9 CuSO4 5H2O 0,02-0,03 Na2MoO4 2H2O 0,2-0,3 CoCL2 6H2O 0,02-0,03 CuSO4 5H2O 0,02-0,03 MnSO4 5H2O 21-23 CoCL2 6H2O 0,08-0,12 Н3ВО3 6,0-6,5 MnSO4 5H2O 21-23 ZnSO4 4H2O 10-11 Н3ВО3 10-12 FeSO4 7H2O 27-28 ZnSO4 4H2O 10-11 Na2 ЕДТА 37-38 FeSO4 7H2O 27-28 Тіамін 0,8-1,2 Na2 ЕДТА 37-38 Сахароза 50000 Тіамін 4-6 Агар 0,6-0,8% Сахароза 100000 pH до автоклавування 5,8-6,2 Агар 0,6-0,8% 5 14450 6 pH до автоклавування 5,8-6,2 Приготовлене рідке середовище розливають Першим етапом вирощування за розробленим по 50мл в колби Ерленмейера об'ємом 250-300мл, процесом є перенесення калюсної тканин штаму стерилізують і в кожну з них в асептичних умовах К-27 на інше агаризоване живильне середовище вносять 5-6г живої біомаси калюсної тканини, по5С за [3] без регуляторів росту наступного складу, передньо вирощеної на середовищі 5С. Колби з мг/л: висадженими експлантами ставлять на шейкери NH4NO3 400-600 (гойдалки) з циклом коливань 50-60обертів/хв. і KNO3 1000-1200 вирощують протягом 25-35 діб. Отриману калюсну тканину збирають, видаляють з неї залишки живиСа(NO3)2 4Н2О 800-1000 льного середовища, висушують до стану повітряKСl 60-80 но-сухої біомаси при температурі 54-55 С і визнаMgSO4 7H2O 400-600 чають у ній вміст аймаліну. NH4H2PO4 500-700 Швидкість накопичення аймаліну в сухій біо(NH4)2HPO4 80-110 масі калюсної тканини штаму К-27 раувольфії змії(NH4)2SO4 200-400 ної за її вирощування двоетапним процесом, друKJ 0,8-0,9 гим етапом якого є глибинне вирощування в Na2MoO4 2H2O 0,2-0,3 рідкому живильному середовищі Рж спеціального CuSO4 5H2O 0,02-0,03 складу зростає вдвічі-втричі порівняно з відомим CoCL2 6H2O 0,02-0,03 способом вирощування на агаризованому середоMnSO4 5H2O 21-23 вищі 10С. За рахунок цього термін вирощування Н3ВО3 6,0-6,5 калюсної тканини, яка накопичує 1% аймаліну і ZnSO4 4H2O 10-11 більше суттєво скорочується - до 20-35 діб, тобто, FeSO4 7H2O 27-28 практично, втричі. Порівняльні дані динаміки накоNa2 ЕДТА 37-38 пичення аймаліну в біомасі за її вирощування згідТіамін 0,8-1,2 но розробленого та відомого способів наведені в Сахароза 50000 таблиці. Агар 0,6-0,8% Приклад 2. Агаризоване живильне середовиpH до автоклавування 5,8-6,2 ще 5С готують за прикладом 1. Калюсну тканину Приготовлене середовище розливають по штаму К-27 раувольфії зміїної вирощують на цьо50мл у колби Ерленмейера об'ємом 250мл, стериму середовищі не менше п'яти (до 10-12) пасажів лізують в автоклаві гарячою парою при 1атм 15-20 за тривалості пасажу 35-45 діб. Після цього тканихвилин. Для пересадки використовують охололе ну переносять в рідке живильне середовище Рж і середовище. вирощують згідно прикладу 1. Швидкість накопиУ колби в асептичних умовах вносять 5-6 грам чення аймаліну зростає і порівняно з відомим проживої біомаси калюсної тканини 30-45-добового цесом вміст аймаліну в сухій біомасі на 20-35 добу віку, яка виросла на колекційному середовищі 10С. росту підвищується у 3-4 рази, сягаючи 1,8% (табКолби з висадженими на середовищі 5С експланлиця). тами ставлять у термостатоване темне приміщенІнші процеси (способи) вирощування у глибиння (t =25-28 C, відносна вологість повітря - 70ній культурі в різних за складом середовищах, у 80%). тому числі пряме перенесення калюсної тканини Через 30-45 діб калюс переносять в рідке жиштаму К-27 із агаризованого середовища 10С в вильне середовище Рж (другий етап вирощуванрідке середовище Рж позитивного ефекту не даня) наступного складу, мг/л: ють. NH4NO3 200-400 Висновок. Запропонований процес вирощуKNO3 1000-1200 вання калюсної тканини штаму К-27 раувольфії Са(NO3)2 4Н2О 800-1000 зміїної на спрощених за складом живильних сереKСl 60-80 довищах без регуляторів росту, спочатку на агариMgSO4 7H2O 400-600 зованому середовищі 5С, а потім у рідкому живиNH4H2PO4 250-290 льному середовищі Рж на шейкерах, у 2-4 рази (NH4)2HPO4 20-30 підвищує швидкість накопичення аймаліну в сухій (NH4)2SO4 150-250 біомасі. Це дозволяє: 1) удвічі - втричі скоротити KJ 0,8-0,9 термін вирощування калюсної тканини до збору Na2MoO4 2H2O 0,2-0,3 врожаю (з 70-90 діб за відомим способом до 20-35 CuSO4 5H2O 0,02-0,03 діб за розробленим способом) та 2) зменшити CoCL2 6H2O 0,02-0,03 трудові та матеріальні витрати при отриманні айMnSO4 5H2O 21-23 маліну внаслідок вирощування калюсних тканин на Н3ВО3 6,0-6,5 простіших за складом живильних середовищах на ZnSO4 4H2O 10-11 шейкерах або у ферментерах у вигляді глибинної культури та значного скорочення об'ємів виробниFeSO4 7H2O 27-28 цтва внаслідок швидкого накопичення аймаліну в Na2 ЕДТА 37-38 біомасі. Тіамін 0,8-1,2 Сахароза 25000 pH до автоклавування 5,8-6,2 7 14450 8 Таблиця Динаміка накопичення аймаліну в сухій біомасі культури тканин штаму К-27 раувольфії зміїної за його вирощування згідно відомого та розробленого процесів (середнє з трьох дослідів по 5 повторностей у кожному) Доба росту Відомий процес, вміст аймаліну, % 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 60 0,40 0,39 0,35 0,32 0,40 0,48 0,61 0,73 0,85 0,92 0,98 Розроблений процес за прикладом Розроблений процес за прикладом 1 2 вміст аймаліну, ефект стимуля- Вміст аймаліну, Ефект стимуля% ції, % % ції, % 0,41 102,5 0,58 145,0 0,49 125,6 0,62 159,0 0,69 197,1 0,84 240,0 1,00 312,5 1,12 350,0 1,08 270,0 1,59 397,5 1,08 225,0 1,75 364,6 1,12 183,6 1,81 296,7 1,01 138,4 1,83 250,7 1,07 125,9 1,78 209,4 1,12 121,7 1,75 190,2 1,15 117,4 1,79 182,7 Джерела інформації: 1. Кунах В.А. Біотехнологія лікарських рослин. Генетичні та фізіолого-біохімічні основи. К.: Логос, - 2005. - 720с. 2. Деклараційний патент України №42150А, МПК6 C12N5/04. Штам культивованих клітин раувольфії зміїної Raitwolfia serpentina Benth. - продуцент аймаліну // Кунах В.А., Можилевська Л.П., Алпатова Л.К., Кацан В.А., Адонін B.I. - Опубл. 15.10.2001, Бюл. №9. 3. Патент України №10338А, МПК6 C12N5/00, Комп’ютерна верстка А. Крижанівський C12N 5/02. Живильне середовище для одержання і вирощування калюсних тканин рослин // Кунах В.А., Алпатова Л.К., Можилевська Л.П. - Опубл. 25.12.96, Бюл. №4. 4. И.Е. Каухова, А.Г. Воллосович, В.А. Цыганков. Выбор питательной среды для глубинного культивирования тканей раувольфии змеиной (Raicwolfia serpentina Benth.) // Растительные ресурсы, 1981, т. 17, №2, с.217-224. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601