Спосіб оцінки ефективності фасціоліцидів in vitro

Спосіб оцінки ефективності фасціоліцидів in vitro, який включає визначення життєздатності паразита на стадії ембріогонії - яєць гельмінта культивуванням в присутності різних доз досліджуваного антгельмінтика, в термостаті протягом періоду, необхідного для утворення личинок, який відрізняється тим, що яйця фасціол одержують із жовчі великої рогатої худоби, ураженої фасціольозом і вносять в розчини досліджуваних фасціоліцидів у формі водної суспензії, яку готують послідовним промиванням-осадженням до концентрації не меншої від 100 яєць/мл, культивування проб здійснюють в присутності поживного середовища в термостаті при t 20°C з періодичною аерацією за допомогою апарата Еверса 5 хвилин, через кожні 24 години, а диференційний підрахунок життєздатних мірацидіїв проводять на світлі через 16-18 діб після початку контакту яєць з оцінюваним фасціоліцидом, при цьому ефективною вважається доза препарату, що забезпечує 50 % загибель личинок. Корисна модель відноситься до галузі ветеринарної медицини, зокрема, ветеринарної паразитології, а саме до способів оцінки ефективності протипаразитарних препаратів. Корисна модель може бути застосована в установах ветеринарної медицини з різними формами власності при виборі засобів для ефективного лікування фасціольозу у сільськогосподарських тварин. Для лікування фасціольозу в сучасних умовах використовують різні антгельмінтні препарати, зокрема "Альбендазол", "Бровальзен", "Вальбазен", "Вермітан", "Авібазен" діючою речовиною яких є альбендазол, гексихол, чотирихлористий вуглець та ряд інших [Кузьмін А.А- Антгельминтики в ветеринарной медицине.-Харьков, 1998.- 146 а ] . Проте, ці препарати не діють на личинкові стадії трематод. Окремі з них мають несприятливий вплив на організм тварин, зокрема чотирихлористий вуглець, що вимагає дуже точного дозування. Тривале використання антгельмінтних препаратів, що містять ту саму діючу речовину, призводить до виникнення резистентності паразитів до цих сполук. Тому в таких випадках спостерігається зниження показників ефективності дегельмінтизації [Borgsteede F.H.M. Anthelmintik resistance in nematodes of farm animals in Europe. Паразитологія в Україні. Вчора, сьогодні, завтра: Мат.ювіл.конф. УНТП,... 16-17 травня 1995 p.- Київ, 1996.- С.127132, Borgsteede F.H.M, Dvojnos G.M., Kharchenko V.A. Benzimidazole Resistance m Cyatostomes of Horses in Ukraine // Veterinary Journal -1997.68. - P. 113-117]. Різні фасціоліциди, введені в організм хворої тварини здійснюють неоднакову дію на певні стадії розвитку фасціол. Так препарат "Комбітрем" [Деклараційний патент України №52516 А] діє на статевозрілих фасціол та їх личинки, триклабендазол - на статевозрілих і нестатевозрілих парафзитів. Відомі способи визначення ефективності антипаразитарних засобів in vivo: - порівняння кількості яєць до і після лікування тварин [Дахно І.С. Епізоотологія, етіотропна та імунокорегуюча терапія при фасціольозі і дикроцеліозі жуйних тварин // Автореф. дис. доктора, вет. наук. 03.00.18. / Харків 2001 .-36 с.]; - шляхом зараження вільних від інвазії груп тварин і лікування їх оцінюваним антипаразитарним препаратом [Амеха Т. Г. Фасциолез жвачных животных в Ефиопии // Дис. кандид. вет. наук: 16.00.11. / Киев, 2003.-139с] Зазначені способи складні і незручні для оцінки фасціоліцидів у зв'язку із біологією трематод. Відомий також спосіб визначення тесту розвитку личинок до статевозрілих гельмінтів [Small et Taylor, 1989 - цитовано по Черепанов А.А., Кармалиев Р.С. Методические рекомендации. ВИГИС 1991 г-19 с ] . Спосіб розрахований на визначення ефективності препаратів проти стронгілятозів жуйних тварин і полягає в культивуванні личинок третьої стадії стронгілят харчового тракту до розвитку т |Ч« ST 7771 дорослих особин в середовищі, що містить антгеЛЬМІНТИКИ Спосіб не може бути використаний для визначення ефективності фасцюліцидів, оскільки трематоди (фасцюла) і стронплщи мають різну біологічну будову і характер розвитку та паразитування Найбільш близьким по суті до способу, що заявляється є спосіб визначення резистентності гельмінтів до антгельмінтиків [Черепанов А А , Кармалиев Р С Методические рекомендации ВИГИС 1991 г - 1 9 с ] Відомий спосіб включає використання в якості обєкта досліджень яйця гельмінтів, які вносять в розчини різних доз антгельмінтика, і після культивування визначають відсоток загиблих яєць та личинок, що вийшли з яєць Недоліком способу є те, що він розрахований на визначення ефективності антгельмінтиків, що спрямовані проти стронплід або нематод і не враховує особливості біологи фасцюл, а тому не може використовуватись для визначення ефективності проти трематод, які паразитують в жовчних ходах » отримати яйця для дослідження фасцюліцндів складно Заявлений нами спосіб усуває недоліки прототипу і забезпечує об'єктивну оцінку ефективності фасцюдіцндів В основу корисної моделі покладено завдання розробити зручний у застосуванні, швидкий у виконанні та економічно вигідний спосіб оцінки ефективності фасцюліцидів in vitro Технічний результат досягають тим, що яйця фасцюл відбирають із жовчі великої рогатої худоби, ураженої фасцюльозом, і вносять в досліджувані розчини фасцюліцидів у формі водної суспензії, яку готують послідовним промиваннямосадженням, досягаючи концентрації не менше 100яєць/мл, а диференційНий підрахунок життєздатних мірацидіїв здійснюють на СВІТЛІ через 1618 діб після початку контакту яєць з препаратом, при цьому ефективною вважають дозу препарату, що забезпечує загибель 50% личинок Даний спосіб дав позитивний результат і с ефективним для визначення впливу фасцюліцидів на розвиток яєць трематод, оскільки культивування яєць трематод триває 16-18 днів при t 20°С Періодична аерація середовищ за допомогою апарату Еверса протягом 5 хвилин, через кожні 24 години культивування оскільки для нормального розвитку мірацидіїв потрібен кисень У зв'язку із вище зазначеним, отримані за заявленим способом дані результатів досліджень дають ВІДПОВІДНІ показники про вплив препаратів за різних доз на розвиток мірацидіїв, що свідчить про ефективність даного способу При проведенні патентно-інформаційного пошуку заявником і авторами виявлено технічне рішення, що містить ряд суттєвих ознак, спільних із заявленим способом [Черепанов А А , Кармалиев Р С Методические рекомендации ВИГИС 1991 г1 9 с ] визначення життєздатності паразита на стадії ембрюгонп - яєць гельмінта культивуванням в присутності різних доз досліджуваного антгельмінтика в термостаті протягом періоду, необхідного для утворення личинок Однак наявність зазначених спільних з прото типом ознак, недостатня для одержання технічного результату, який забезпечує заявлений спосіб Технічних рішень, які б за сукупністю ознак повністю співпадали із заявленим - не виявлено Це дозволяє зробити висновок про ВІДПОВІДНІСТЬ заявленого технічного рішення критерію корисної моделі - "новизна" В патентній і науково-технічній інформації не знайдено технічних рішень, в яких були б описані ВІДОМОСТІ про ознаки, що відрізняють заявлений спосіб від прототипу і забезпечують досягнення технічного результату яйця фасцюл одержують із жовчі великої рогатої худоби, ураженої фасцюльозом і вносять в розчини досліджуваних фасцюліцидів у формі водної суспензії, яку готують послідовним промиванням осадженням до концентрації не менше 100яєць/мл, культивування проб здійснюють в присутності поживного середовища в термостаті при t 20°C з періодичною аерацією за допомогою апарату Еверса 5 хвилин, через кожні 24 години, а диференційний підрахунок життєздатних мірацидіїв проводять на світлі через 16-18 діб після початку контакту яєць з оцінюваним фасцюліцидом, при цьому ефективною вважається доза препарату, що забезпечує 50% загибель личинок Отже, заявлене технічне рішення не випливає явним чином з рівня техніки, що дозволяє зробити висновок про ВІДПОВІДНІСТЬ його критерію корисної моделі - "винахідницький рівень" Заявлений спосіб належить до галузі ветеринарної медицини, зокрема, ветеринарної паразитологи, а саме до способів оцінки ефективності протипаразитарних препаратів Корисна модель може бути застосований в установах ветеринарної медицини з різними формами власності при виборі засобів для ефективного лікування фасцюльозу у сільськогосподарських тварин, а тому відповідає критерію корисної моделі "промислова придатність" Таким чином, заявлене технічне рішення є новим, промислово придатним, має винахідницький рівень, тобто відповідає всім умовам патентоспроможності корисної моделі ВІДПОВІДНО до статті 7 розділу II "Закону України про охорону прав на винаходи і корисні моделі" № 1771 -111,2000р Реалізацію заявленого способу здійснюють таким чином Жовч від забитої, хворої на фасцюльоз великої рогатої худоби, відбирають у термоси В лабораторії жовч відстоюють 10-15 хвилин, зливають надосад, доливають воду до початкового рівня Процедуру повторюють до повного просвітлення верхнього шару рідини Залишають осад із невеликою кількістю води (25-50мл) Готують маточний розчин антгельмінтика, до прикладу "Бронтел 10 %", в концентрації 2,5мкг/мл, а з нього готують серію розведень з вмістом фасцюліциду 1,2, 0,6, 0,3, 0,1, 0,07 і 0,03мкг/мл Тест ставлять в чашках Петрі У 6 стерильних чашок вносять по 2мл антгельмінтика у вказаних концентраціях Ще в одну чашку вносять суспензію яєць паразита без препарату у КІЛЬКОСТІ 4мл, вона служить контролем 7771 У всі чашки Петрі вносять по 2мл суспензії яєць гельмінта, в якій міститься не менше 100-150 яєць в 1мл. Яйця гельмінтів культивують в розчинах фасціоліциду 16-18 днів у термостаті при 20°С. Вихід мірацидіїв спостерігають на світлі. Диференційний підрахунок відсотку личинок, які вийшли, по відношенні до контролю, проводять на 100 яєць. Для достовірності дослід проводять у п'яти повторностях. Ефективність заявленого способу і його переваги перед прототипом підтверджені прикладом конкретного виконання: Дослідження проводили в лабораторії" кафедри паразитології ЛНАВМ ім. С.З.Гжицького на прикладі визначення ефективності клозантел - синтетичного препарату "Бронтел 10%" дія якого обумовлюється згубним впливом на статевозрілих фасціол. Для цього препарат розводили у відповідності до терапевтичної дози. Із нього готували серію розведень з вмістом: 1,2; 0,6; 0,3; 0,1; 0,07 і 0,03мкг/мл. У 6 стерильних чашок Петрі (5мл) вносили по 2мл розчину антгельмінтика у вказаних розведеннях. В кожну чашку вносили по 2мл суспензії яєць гельмінта (в 1мл не менше 150 яєць). Ще в одну чашку вносили суспензію яєць без препарату, яка послужила контролем. Культивування проб здійснюють в термостаті при t 20°C з періодичною аерацією за допомогою апарату Еверса 5 хвилин, через кожні 24 години. Вихід мірацидіїв (на 100 яєць) спостерігають на світлі через 16-18 днів. Стосовно впливу фасціоліциду виявлено, що в середовищах з високим вмістом препарату міра 6 цидії при виході були малоактивними або знерухомлювались вже через 5-10 хвилин, а при вищій концентрації (1,2мкг/мл) відразу втрачали рухову активність. Несформованими вважались ті личинки, які не розвинулись із зародку в яйці. В залежності від дози фасціоліциду в середовищі, по різному варіював і відсоток виходу мірацидіїв. Отримані результати представлені у таблиці 1. В контролі показник виходу мірацидіїв становив 93,6%. В середовищі з вмістом антгельмінтика 1,2мкг/мл становив - 6,2% (Р