Спосіб отримання тіамінпірофосфокінази

Реферат: UA 80387 U UA 80387 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі отримання ферментів і може бути використана для отримання тіамінпірофосфокінази (КФ 2.7.6.2) з сировини тваринного походження на підприємствах хімічної та хіміко-фармацевтичної промисловості. Отриманий за пропонованим методом препарат тіамінпірофосфокінази може бути використаний для створення біотехнологічного процесу здобуття тіамінтрифосфата. Досягнутий рівень в даній галузі ілюструється наступними прикладами. На даний час використовують коштовний спосіб отримання тіамінпірофосфокінази із насіння сої Glycine max [Molin W. Т., Fites R. С. Isolation and characterization of Thiamin Pyrophosphotransterase from Glycine max Seedlings. - Plant Physiol. - 1980. - Vol. 66. - P. 308 312]. Боби сої пророщують 48 годин, потім висушують за кімнатних умов, стерилізують з 10 % хлоролом протягом 1 хв., гомогенізують в буфері, який містить 50 мМ Трис-HCL (рН 7,6), 10 мМ β-меркаптоетанолу та 1,0 мМ ЕДТА. Гомогенат тіамінпірофосфокінази центрифугують 20 хв. при 20 000 g, потім отриманий супернатант, що містить тіамінпірофосфокіназу хроматофокусірують на колонці на Сефадексе G-25 і колонці на Сефадексе G-150 та елюїрують буфером, який містить 50 мМ Трис-HCL (рН 7,6) і 10 мМ β-меркаптоетанолу Недоліками відомого способу є додаткове пророщування бобів сої, використання комерційних Трис-HCL, β-меркаптоетанолу, ЕДТА та Сефадексу G-25 і Сефадексу G-150, що призводить до збільшення трудомісткості процесу та подорожчання тіамінпірофосфокінази (1 г β-меркаптоетанолу коштує понад 450 євро, 1 г Сефадекса G-150 коштує 150 євро). Відомий спосіб отримання тіамінпірофосфокінази з пивних дріжджів [Воскобоев А. И., Островский Ю. М., Черникевич И. П. Очистка и характеристика тиаминпирофосфокиназы из пивних дрожжей. Биоорганическая химия. - 1975. - Т. 1., № 10. - С. 1489-1496]. Спосіб полягає в тому, що півні дріжджі автолізують при 37 °С протягом 3 годин, потім центрифугують при 105 000 g протягом 60 хв. Надосадкову рідину прогрівають при 50 °С протягом 10 хв., потім охолоджують та повторно центрифугують при 105 000 g протягом 60 хв. Надосадкову рідину, яка містить тіамінпірофосфокіназу фракціонують охолодженим ацетоном та сульфатом амонію при 50-60 % насиченні. Отриманий осад діалізують проти 0,01 Μ тріс-HCL буфера рН 7,3 при + 4 °С протягом 12 годин, після чого ферментний препарат центрифугують при 20 000 g протягом 20 хв. Отриману надосадкову рідину хроматографують на сефадексі G-25 і DEAE-сефадексі А50 з елюцією 0,01 Μ тріс-HCL буфером рН 7,3. Вихід ферменту становить 17 %. Даний спосіб обрано в якості прототипу. Недоліками відомого способу є невисокий процент виходу ферменту (17 %) та многостадійність способу, що передбачає тривалість процесу (5-6 діб). В основу корисної моделі поставлена задача: створити спосіб отримання тіамінпірофосфокінази з технічним ефектом, який полягає в спрощенні трудомісткості процесу і збільшені виходу ферменту. Поставлена задача досягається способом отримання тіамінпірофосфокінази, який полягає в тому, що з сировини, яка містить тіамінпірофосфокіназу її екстрагують, і додатково очищують від домішок, і який відрізняється тим, що як сировину використовують тканину тваринного походження - міометрій тварин. Загальними ознаками прототипу та способу, який пропонується, є те, що в обох випадках тіамінпірофосфокіназу екстрагують дистильованою водою з осаду, який був отриманий після фракціонування, потім тіамінпірофосфокіназу додатково очищають від білкових та небілкових домішок. Відмінними ознаками способу, який пропонується, є те, що як сировину для виділення тіамінпірофосфокінази використовують не пивні дріжджі, а тканину міометрія тварин. Запропонований спосіб отримання тіамінпірофосфокінази реалізується наступним чином. Тканину міометрія тварин (наприклад великої рогатої худоби) гомогенізують в дистильованій воді у співвідношенні 1:10, потім гомогенат центрифугують при 12000 g протягом 45 хв., потім осад ресуспендують дистильованою водою у співвідношенні 1:5, екстрагують та повторно центрифугують при 12000 g протягом 45 хв., після чого осади об'єднують і висушують при кімнатній температурі. Із отриманих осадів готують екстракт в дистильованій воді у співвідношенні 1:10, який очищають від білкових та небілкових домішок відомими способами. Пропонований спосіб отримання тіамінпірофосфокінази багаторазово випробувався в лабораторії біохімії ОНУ імені І. І. Мечникова з доброю відтворюваністю результатів. Результати досліджень з найкращою відтворюваністю результатів наведені в таблиці 1, в якій відображено активність та % виходу тіамінпірофосфокінази з пивних дріжджів танемалігнізованої і пухлинних тканин міометрія. 1 UA 80387 U Таблиця 1 Міометрій (М±m, n=7) Пивні дріжджі ПА 240 Немалігнізована тканина % виходу ПА % виходу 17,0 844,4± 82,1 27,3 Доброякісна пухлина ПА 482,6±44,9 % виходу 39,27 Злоякісна пухлина ПА 501,4±48,2 % виходу 31,4 Примітка: ПА - питома активність тіамінпірофосфокінази в пмоль тіаміну на 1 мг білка за 1хв. 5 10 15 20 Як видно з даних, наведених в таблиці 1, в тканині міометрію активність тіамінпірофосфокінази в 1,8-3,5 рази вище, ніж в пивних дріжджах. Отримані результати, щодо активності ферменту та відсотку виходу свідчать про те, що тканина міометрію є більш перспективною для виділення тіамінпірофосфокінази. Таким чином, запропонований спосіб у порівнянні з прототипом забезпечує отримання препарату тіамінпірофосфокінази з 39 % виходу при незначних матеріальних витратах (150-230 грн.), трудоємкості та малостадійності процесу. Спосіб, що пропонується, надається промисловим підприємствам для промислового використання. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб отримання тіамінпірофосфокінази, який полягає в тому, що з сировини, яка містить тіамінпірофосфокіназу її екстрагують, і додатково очищують від домішок, який відрізняється тим, що як сировину використовують тканину тваринного походження - міометрій тварин. Комп’ютерна верстка А. Крулевський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2