Штам escherichia coli k12 „inv” sbа – продуцент рекомбінантної неактивної субодиниці а дифтерійного токсину corynebacterium diphtheriae, гібридизованої з полігістидиновим тагом

Штам Escherichia coli K12 "inv" sbA як продуцент рекомбінантної неактивної субодиниці А дифтерійного токсину Corynebacterium diphtheriae, гібридизованої з полігістидиновим тагом, амінокислотна послідовність якої MASMTGGQQMGRGSGADD VVDSSKSFVMENFSS YHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGN YDDDWKGF YSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGL TKVL ALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTDESIK RFGDGASR VVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALS VELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRLEHH HHHH. UA (21) a200701085 (22) 02.02.2007 (24) 10.10.2008 (46) 10.10.2008, Бюл.№ 19, 2008 р. (72) КОМІС АРЕНКО СЕРГІЙ ВАСИЛЬОВИЧ, UA, КОЛИБО ДЕНИС ВОЛОДИМИРОВИЧ, U A, РОМАНЮК СВІТЛАН А ІВАНІВН А, U A, КАБЕРНЮК АНДРІЙ АРКАДІЙОВИЧ, U A, ОЛІЙНИК ОЛЕНА СЕРГІЇВНА, U A, РЕДЧУК ТАРАС АН АТОЛІЙОВИЧ, U A (73) ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ІМ. О.В. ПАЛЛАДІН А НАЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ Н АУК УКРАЇНИ, U A (56) US 4950740, 21.08.1990 US 4830962, 16.05.1989 WO01/11960, 22.02.2001 Diane Leong, Kenneth D. Coleman, and John R. Murphy "Cloned Diphtheria Toxin Fragment A Is Expressed from the tox Promoter and Exported to the Periplasm by the SecA Apparatus of Escherichia coli K12", J. Biol. Chem., Vol.258, No. 24, issue of December 25, pp. 15016-15020, 1983. WILLIAM R. BISH AI, ATSUSHI MIYANOHAR A, JOHN R. MURPHY "Cloning and Expression in Escherichia coli of Three Fragments of Diphthera C2 2 (19) 1 3 84356 тний білок позбавлений цілого ряду важливих антигенних детермінант, властивих субодиниці А. Відома система для отримання рекомбінантних фрагментів дифтерійного токсину на основі штаму Escherichia coli [4]. Така система дозволяє отримувати субодиницю А дифтерійного токсину, але суттєвим її недоліком є індукція експресії, що відбувається при швидкому нагріванні бактеріальної культури до 60°C протягом 45 секунд та експресія цільового продукту, що відбувається при температурі 42°C, такі умови надзвичайно складно забезпечити при експресії в великих об'ємах. Також в даному патенті немає відомостей про можливість афінного очищення цільового продукту, що має важливе значення для отримання електрофоретично чистої субодиниці А. В основу винаходу поставлена задача одержати штам - продуцент рекомбінантної неактивної субодиниці А дифтерійного токсину шляхом використання генноінженерних методів, який дозволив би одержувати продукт, придатний для імунохімічних досліджень як антиген Corynebacterium diphtheriae з мінімальними затратами часу, ресурсів, з високим виходом цільового продукту та можливістю виділення методом металафінної хроматографії в електрофоретично чистому вигляді. Поставлена задача вирішується шляхом одержання штаму - продуцента рекомбінантної неактивної субодиниці А дифтерійного токсину на основі штаму Escherichia coli Rosetta(DE3) (Novagen, #71400) шляхом трансформації штаму прототипу генетичною конструкцією, що забезпечує експресію нуклеотидної послідовності частини гену дифтерійного токсину (Фіг.1), яка кодує амінокислотну послідовність довжиною 190 залишків, що є неактивною субодиницею А ди фтерійного токсину та полігістидиновий таг, який забезпечує можливість металафінного виділення рекомбінантної субодиниці. На Фіг.2 представлена амінокислотна послідовність рекомбінантної субодиниці А, що продукується штамом Escherichia coli K12 "inv" sbA. Ha Фіг.3 наведено амінокислотну послідовність, що відповідає амінокислотній послідовності дифтерійного токсину згідно [5]. В результаті роботи з застосуванням генноінженерних підходів штам Escherichia coli Rosetta(DE3) набув здатності продукувати рекомбінантну неактивну субодиницю А дифтерійного токсину. Культурально-морфологічні характеристики. Культура Escherichia соlі K12 "inv" sbA добре росте на рідких поживних середовищах на основі дріжджового екстракту та гідролізату казеїну. На поживних середовищах за температури 37°C час відтворення в log-фазі для E. соlі становить близько 22 хвилин. Фізіолого-біохімічні характеристики. Оптимальна для росту температура складає 30-37°C та рН близько 7,0. Маркерні характеристики. Штам Escherichia соlі K12 "inv" sbA є хлорамфенікол- та канаміцин-резистентним. Біотехнологічна характеристика. Штам Escherichia соlі K12 "inv" sbA продукує рекомбінантну неактивну субодиницю А дифтерій 4 ного токсину гібридизовану з полігістидиновим тагом, що спрощує процедуру виділення білка у чистому вигляді, методом металафінної хроматографії. Штам-продуцент було одержано шляхом трансформації вихідного штаму Escherichia coli Rosetta(DE3) плазмідним вектором із послідовністю, що кодує ділянку гену субодиниці А дифтерійного токсину. Для створення експресійної конструкції проводять ампліфікацію нуклеотидної послідовності, що кодує субодиницю А з геномної ДНК C.diphtheriae штам NCTC 10648. Ампліфікацію проводять методом полімеразної ланцюгової реакції з використанням двох пар олігонуклеотидних праймерів Sencel, Antisencel, Sence2, Antisence2 наведених на Фіг.4. За допомогою першої пари праймерів ампліфікують нуклеотидну послідовність, що кодує субодиницю А. Для забезпечення правильної орієнтації при вбудовуванні ампліфікованої частини гену дифтерійного токсину в експресійний вектор, до другої пари олігонуклеотидних праймерів вводять нуклеотидні послідовності, що є сайтами рестрикції ендонуклеаз ВаmHI та Xhol. Для проведення реакції об'єднання в експресійну конструкцію нуклеотидної послідовності, що кодує субодиницю А, та плазмідного вектора (що містить послідовність, яка кодує полігістидиновий таг) продукт ампліфікації та вектор гідролізують ендонуклеазами ВаmHI та Xhol та об'єднують за допомогою Т4 ДНК лігази. Всі процедури, що були вищевказані проводять як описано у T.Moniatis [6]. Для створення експресійної конструкції, яку було описано вище потрібно використовувати плазмідний вектор, що може забезпечити експресію в клітинах Escherichia coli та мати в своїй полілінкерній ділянці сайти ендонуклеаз ВаmHI та Xhol. B якості таких векторів можуть бути використані вектори рЕТ-21а (Novagen, #69740-3), рЕТ-23а (Novagen, #69745-3). Одержаною генетичною конструкцією за допомогою метода електропорації трансформували клітини Escherichia coli Rosetta(DE3). Штампрототип Escherichia coli Rosetta(DE3) має такі характеристики: F-ompT hsdSB(rB-m B-) gal dcm lacYl(DE3) pRARE6(Cm R). Продуктивність одержаного штаму складає близько 15мг цільового білка на 1л клітинної суспензії. Продукт може бути виділений у електрофоретично чистому ви гляді методом металафінної хроматографії (електрофореграму, на якій показано чистоту виділення цільового продукту, наведено на Фіг.5). Таким чином, одержано штам-продуцент рекомбінантної неактивної субодиниці А дифтерійного токсину, що може бути використано як антиген Corynebacterium diphtheriae при розробці діагностичної тест-системи для виявлення антитіл до окремих субодиниць дифтерійного токсину в сироватці крові та в крові людини. Список посилань: 1. US, 4950740, 1990.08.21. 2. UA, 14846 А, 18.02.1997. 3. UA, 14805 А, 18.02.1997. 4. CA, 1327329, 1994.03.01. 5 84356 5. Lawrence Greenfield, Michael J. Bjorn, Glenn Horn, Darlene Fong, Gregory A. Buck, R. John Collier, and Donald A. Kaplan. Nucleotide Sequence of the Structural Gene for Diphtheria Toxin Carried by 6 Corynebacteriophage B // PNAS. - 1983. - Vol.80, N 22. - P.6853-6857. 6. Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T. // Molecular cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (Second edition). -1989. - 1. 7 Комп’ютерна в ерстка Т. Чепелев а 84356 8 Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601