Спосіб виявлення антигенпрезетуючих клітин в паракортикальній зоні лімфатичного вузла

Реферат: Спосіб виявлення антигенпрезентуючих клітин в паракортикальній зоні лімфатичного вузла здійснюється шляхом препарування лімфатичного вузла, підготовки гістологічних препаратів та мікроскопії. Проводять лектингістохімічне дослідження з лектином виноградного слимака. UA 85720 U (12) UA 85720 U UA 85720 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медицини, а саме гістології, анатомії, імунології, і може бути використана для виявлення антигенпрезентуючих клітин в гістологічних препаратах. На сьогодні встановлено існування шести типів антигенпрезентуючих клітин у клітинному складі лімфатичного вузла, які відрізняються топографією, антигенним фенотипом і функціональними властивостями. Тому виникає необхідність дослідження окремих типів антигенпрезентуючих клітин в структурі лімфатичного вузла для розуміння формування різних видів імунної відповіді в периферичних лімфоїдних органах, а саме одного із типів антигенпрезентуючих клітин в паракортикальній тимусзалежній зоні лімфатичного вузла. Найбільш близьким за технічною суттю та результатом, що досягається, є спосіб, який полягає у виявлені антигенпрезентуючих клітин паракортикальної зони лімфатичного вузла в гістологічних заморожених препаратах гістохімічним методом Вахштейна-Мейзеля, який полягає у препаруванні вузла, фіксації даного органа фізичним способом - у рідкому азоті, підготовці гістологічних препаратів на мікротомі із замороженням, інкубації отриманих зрізів з ферментом АТФ-азою, реакцією продуктів інкубації з нітратом свинцю, проявом продуктів реакції сульфідом амонію, зануренням препарату у гліцерин-желатин, мікроскопією (Lennert K., Kaiserling E., Muller-Hermelink H.K. T-associated plasma cells // Lancet. - 1975. - № i. - P. 10311032. Спільною суттєвою ознакою прототипу і корисної моделі, що заявляється, є така: - препарування лімфатичного вузла; - підготовка гістологічних препаратів; - мікроскопія. Цей спосіб є недостатньо ефективним, тому що він обмежує можливості виявлення антигенпрезентуючих клітин на заморожених гістологічних зрізах, так як нарізається обмежена кількість гістологічних зрізів з одного органа внаслідок великої товщини зрізів, більше 10 мкм; необхідна підтримка постійного температурного режиму в лабораторії для постановки гістохімічної реакції із застосуванням ферменту АТФ-ази; використовується для візуалізації гістохімічної реакції токсичний сульфід амонію, крім того виникає потреба в значних матеріальних витратах - наявність рідкого азоту для фіксації біологічного матеріалу, багатогодинна робота мікротому із замороженням. Тому виникла необхідність у розробці нового способу по виявленню антигенпрезентуючих клітин в паракортикальній тимусзалежній зоні лімфатичного вузла. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалення способу виявлення антигенпрезентуючих клітин в паракортикальній зоні лімфатичного вузла в гістологічних препаратах шляхом використання методу лектинової гістохімії з лектином виноградного слимака, що забезпечить підвищення ефективності високоспецифічного виявлення цих клітин. Поставлена задача вирішується тим, що у способі, який полягає у препаруванні лімфатичного вузла, підготовці гістологічних препаратів, мікроскопії, новим є те, що проводять лектингістохімічне дослідження з лектином виноградного слимака. Застосовується хімічна фіксація біологічного матеріалу, виготовлення парафінових зрізів і постановка лектингістохімічної реакції з лектином виноградного слимака. Як ми доводимо, достовірність методу підтверджується внаслідок збігу топографії і морфології антигенпрезентуючих клітин в тимусзалежній зоні лімфатичного вузла при застосуванні гістохімічного методу Вахштейна-Мейзеля по виявленню АТФ-ази в цитоплазмі антигенпрезентуючих клітин і лектингістохімічного методу по виявленню нашарувань часточок бензидину на поверхні цитоплазматичної мембрани антигенпрезентуючих клітин після інкубації гістологічних зрізів в кон'югаті лектин виноградного слимака - пероксидаза хрону. Антигенпрезентуючі клітини розташовуються в тимусзалежній паракортикальній зоні лімфатичного вузла, на межі коркового і мозкового шарів, утворюючи ланцюжок клітин в один ряд. Частіше клітини розташовуються навколо просвіту судин, утворюючи осередки з трьох клітин. Клітини розташовуються одна від одної на відстані 20-25 мкм. Клітини контактують між собою за рахунок відростків пальцеподібної форми, яких налічується від 4 до 7, довжиною до 15 мкм. Клітини мають неправильну форму. Розміри соми клітин - 25-35 мкм. В тілі клітин контурується ядро неправильної форми. Постановка лектингістохімічної реакції з лектином виноградного слимака для виявлення антигенпрезентуючих клітин в паракортикальній зоні лімфатичного вузла в парафінових гістологічних препаратах дозволить збільшити потік досліджуваного матеріалу за рахунок економії часу, зменшення матеріальних і енергетичних затрат на виконання поставленої задачі, що дозволить підвищити інформативність стосовно морфо-функціонального стану антигенпрезентуючих клітин і зменшить помилки при підрахунку цих клітин в гістологічних препаратах, так як виникає можливість аналізувати серійні гістологічні зрізі товщиною в 5 мкм, 1 UA 85720 U 5 10 15 20 25 30 на відміну від заморожених зрізів товщиною 10 і більше мкм, що особливо актуально при досліджені антигенпрезентуючих клітин, лінійні параметри яких сягають 60 мкм і більше. Запропонований спосіб дозволяє високоспецифічно диференціювати антигенпрезентуючі клітин в тимусзалежній паракортикальній зоні лімфатичного вузла. Новий спосіб дозволяє на більш тривалий строк заархівувати дослідний матеріал у формі парафінових блоків і парафінових гістологічних зрізів, дозволяє збільшити об'єм досліджуваного матеріалу, знизити матеріальні витрати на отримання результатів дослідження і тим самим підвищити достовірність виявлення та ідентифікації антигенпрезентуючих клітин в тимусзалежній паракортикальній зоні лімфатичного вузла. Таким чином, сукупність вищезазначених позитивних моментів дозволить підвищити ефективність виявлення антигенпрезентуючих клітин в гістологічних парафінових препаратах і більш досконало вивчати будову лімфоїдної тканини. Спосіб здійснюють таким чином. Проводять препаровку лімфатичного вузла. Для лектингістохімічного дослідження тканину фіксують хімічним способом в розчини Буєна. Шматочки зневоднюють в висхідній батареї спиртів, починаючі з 40 %. Проводять заливку шматочків тканини у парафін. Отримують парафінові зрізи товщиною 5 мкм на ротаційному мікротомі. Підготовлюють гістологічні зрізи, проводять блокування ендогенної пероксидази. Гістохімічне визначення рецепторів до лектину виноградного слимака проводять з використанням прямої реакції з кон'югатом - лектин і перокидаза хрону. Рецептори до лектину виявляють по відкладанню часточок бензидину на поверхні цитоплазматичної мембрани клітин. Зрізи дегідратують і занурюють у канадський бальзам. Мікроскопують. Морфометричне дослідження тіла клітин, ядра, відростків проводять за допомогою окуляр-мікрометра при імерсійному збільшенні мікроскопу. Приклад. Після фіксації шматочків медіастинального лімфатичного вузла щурів в рідині Буєна, їх зневоднюють у висхідній батареї спиртів, отримують парафінові зрізи товщиною 5 мкм та виготовляють гістологічні препарати. Лектингістохімічне визначення рецепторів до лектину виноградного слимака проводять з використанням прямої реакції з кон'югатом лектину виноградного слимака і пероксидази хрону. Рецептори до лектину виявляють по відкладанню часточок бензидину на поверхні цитоплазматичної мембрани. Антигенпрезентуючі клітини розмірами до 25 мкм, неправильної форми, темно-коричневого кольору мають світле ядро пелюсткоподібної форми, а також звивисті відростки довжиною до 15-20 мкм. Антигенпрезентуючі клітини розташовуються в паракортикальній Т-залежній зоні однорядним ланцюжком. Інтенсивність бензидинових відкладень на поверхні цитоплазматичної мембрани вказує на морфо-функціональний стан антигенпрезентуючих клітин. 35 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 40 Спосіб виявлення антигенпрезентуючих клітин в паракортикальній зоні лімфатичного вузла, що здійснюється шляхом препарування лімфатичного вузла, підготовки гістологічних препаратів та мікроскопії, який відрізняється тим, що проводять лектингістохімічне дослідження з лектином виноградного слимака. Комп’ютерна верстка М. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2