Спосіб одержання імуноглобуліну

1. Спосіб одержання імуноглобуліну, що включає фракціонування етиловим спиртом донорської плазми з отриманням осаду Б та очищення виділеного імуноглобуліну, який відрізняється тим, що осад Б розчиняють у 0,9%-ному розчині натрію хлориду при pH 5,15 і змішують з 2М ацетатним буферним розчином та з 53%-ним етиловим спиртом з наступним центрифугуванням 2 (19) 1 3 85741 Винахід відноситься до медицини, а саме до одержання імуноглобулінів - білків плазми крові, що приймають участь у імунних реакціях, і може бути використаний при виробництві лікарських препаратів. При виробництві імуноглобулінів велике значення приділяється стабільності та безпечності одержаної лікарської форми. Як правило, фракцію, що містить імуноглобулін G, одержують методом спиртового фракціонування за Коном різними концентраціями етилового спирту при певних електролітичних показниках розчину відповідної технологічної стадії. Одержання імуноглобуліну шляхом фракціонування етиловим спиртом з наступним очищенням розкрито у патентах RU, 2199343 (кл. А61К, 39/395, опубл. 27.02.2003) [1], RU, 2261112, (кл. А61К 39/395, опубл. 27.09.2005) [2] та інших. Найбільш близьким є спосіб одержання імуноглобуліну, що включає фракціонування етиловим спиртом донорської плазми з отриманням осаду Б та очищення виділеного імуноглобуліну [2]. Фракціонування етиловим спиртом проводять до виділення осаду Б, причому екстракцію спиртового осаду Б проводять у дванадцятикратному об'ємові дистильованої води, а при очистці додають хлорид натрію до кінцевої концентрації 0,9%, встановлюють рН від 4,0 до 5,0, потім додають хлороформ до 3,0% мас, витримують суміш протягом 14 годин при 0...3°С і центрифугують. Після центрифугування осад видаляють, проводять освітлюючу фільтрацію. Для осадження імуноглобуліну до фільтрату додають 50%-ний розчин поліетиленгліколю до кінцевої концентрації 12 або 26% етилового спирту, осад після центрифугування розчиняють у 0,3М гліцині, доводять до рН 4,6 і здійснюють освітляючу і стерилізуючу фільтрації. Недоліком відомого способу є низький рівень вилучення/інактивації вірусів при проведенні зазначеної обробки, що залишає його вірусонебезпечним. У зв'язку з цим відомий спосіб передбачає проведення додаткової інактивації вірусів при кімнатній температурі шляхом витримки протягом 20...25 днів, що негативно впливає на стабільність готового препарату. Задачею винаходу є удосконалення способу одержання імуноглобуліну, в якому за рахунок запропонованого фракціонування і очистки забезпечується висока ступінь очистки імуноглобуліну при підвищеній ефективності вилучення/інактивації вірусів, що забезпечує вірусобезпечність імуноглобуліну для лікарських препаратів та стабільність готового препарату. Це дозволяє підвищити термін зберігання лікарської форми до 3-х років. Запропонований спосіб є технологічним і легко контролюється. Поставлена задача вирішується запропонованим способом одержання імуноглобуліну, що включає фракціонування етиловим спиртом донорської плазми з отриманням осаду Б та очищення виділеного імуноглобуліну, в якому фракціонування проводять до виділення осаду В, а при очищенні виділений імуноглобулін у вигляді розчину осаду В обробляють сольвент-детергентною сумішшю, оброблений імуноглобулін іммобілізують та промивають на сульфопропілкатіонітному сор 4 бенті за допомогою колоночної хроматографії з наступною елюцією, і проводять ультрафільтрацію та стерилізуючу фільтрацію. Виділення осаду В проводять фракціонуванням, яке здійснюють таким чином. Осад Б розчиняють у 0,9%-ному розчині натрію хлориду при рН 5,15. Розчинений осад Б змішують з 2М ацетатним буферним розчином і 53%-ним етиловим спиртом з наступним центрифугуванням при температурі мінус (3...5)°С. Отриманий центрифугат змішують з гідрокарбонатом натрію при рН розчину 5,5 з наступним центрифугуванням при температурі мінус (3...5)°С. Далі отриманий центрифугат освітлюють, наприклад, фільтрацією, освітлений центрифуга т змішують з ацетатним буферним розчином при рН 5,4, 96%-ним (об/об) етиловим спиртом і бікарбонатом натрію при рН 7,2 з наступним центрифугуванням при температурі мінус (10...12)°С. При обробці імуноглобуліну у вигляді розчину осаду В як сольвент-детергентну суміш використовують 0,05М ацетатний буферний розчин при рН 5,5, що містить 1% мас. три-н-бутилфосфату і 1% мас. полісорбату 80. Обробку ведуть шля хом перемішування суміші протягом 12...16 годин з наступним розбавленням 0,05М ацетатним буферним розчином при рН 5,5, що містить 1% мас. октаноату натрію, 0,15М хлориду натрію і пропіленгліколь у концентрації 0,2г/л. Для іммобілізації імуноглобуліну використовують сульфопропілкатіонітний сорбент, що має розмір зерен 50мкм, і сорбційну ємність 55мг/см 3. Оброблений імуноглобулін, іммобілізований на сульфопропілкатіонітному сорбенті, промивають у дві стадії, причому, на першій стадії використовують 0,05М ацетатний буферний розчин при рН 5,5, що містить 1% мас. октаноату натрію, 0,15М хлориду натрію і пропіленгліколь у концентрації 0,2г/л, а на другій стадії використовують 0,05М ацетатний буферний розчин при рН 5,5. На першій стадії промивання ведуть об'ємом, що відповідає 5-ом об'ємам сорбенту, а на другій стадії промивання ведуть об'ємом, що відповідає трьом об'ємам сорбенту. Промивання ведуть зі швидкістю 3см/хв. Елюцію здійснюють 0,05М ацетатним буферним розчином при рН 5,5, що містить 0,2М хлориду натрію. Експериментально було встановлено, що виділення імуноглобуліну спиртовим фракціонуванням до осаду В, обробка виділеного напівфабрикату сольвент-детергентною сумішшю з наступною його іммобілізацією і промивкою на сульфопропілкатіонітному сорбенту - дозволили максимально і без руйнації виділити імуноглобулін G, очистити його від домішок, ефективно видалити віруси при їх наявності, і отримати лікарську форму підвищеної стабільності. Спосіб здійснюється таким чином. Донорську плазму піддають фракціонуванню етиловим спиртом до виділення осаду В. Фракціонування проводять таким чином. Донорську плазму змішують з 96%-ним (об/об) етиловим спиртом і центрифугують при температурі мінус 3°С. Одержаний центрифуга т змішують з 96%-ним (об/об) етиловим спиртом і центрифу 5 85741 гують при температурі мінус (10...12)°С. Отримують осад А. Осад А розчиняють у 5%-йому етиловому спирту, що містить 0,9% мас. натрію хлориду, перемішують і центрифугують при температурі мінус 8°С. Отримують осад Б. Осад Б розчиняють у 0,9%-ному розчині натрію хлориду при рН 5,15, змішують з 2М ацетатним буферним розчином і 53%-ним етиловим спиртом і центрифугують при температурі мінус (3...5)°С. Отриманий центрифугат змішують з гідрокарбонатом натрію при рН розчину 5,5 і центрифугують при температурі мінус (3...5)°С. Одержаний центрифугат освітлюють фільтрацією і змішують з ацетатним буферним розчином при рН 5,4, 96%-ним (об/об) етиловим спиртом та бікарбонатом натрію при рН 7,2. Одержану суміш центрифугують при температурі мінус (10...12)°С. Одержують осад В. Виділений імуноглобулін піддають очищенню. Для цього осад В розчиняють у ацетатному буферному розчині. Розчин осаду В обробляють сольвент-детергентною сумішшю. Як сольвент використовують, наприклад, 0,05М ацетатний буферний розчин при рН 5,5, що містить 1% мас. три-нбутилфосфату і 1% мас. полісорбату 80. Суміш осаду В, сольвенту та детергенту перемішують протягом 12...16 годин при температурі 25°С. Далі розбавляють 0,05М ацетатним буферним розчином при рН 5,5, що містить 1% мас. октаноату натрію, 0,15М хлориду натрію і пропіленгліколь у концентрації 0,2г/л. Оброблений таким чином імуноглобулін за допомогою колоночної хроматографії при лінійній швидкості елюенту 1см/хв іммобілізують на сульфопропілкатіонітному сорбенті, що має сорбційну ємність 55мг/см 3 і зерна розміром 50мкм. Після завершення сорбції здійснюють промивання на сульфопропілкатіонітному сорбенті при лінійній швидкості елюенту 3см/хв. Промивання краще здійснювати двостадійне, при якому на першій стадії використовують ацетатний буферний розчин того самого складу, що і для розбавлення суміші: 0,05М ацетатний буферний розчин при рН 5,5, що містить 1% мас. октаноату натрію, 0,15М хлориду натрію і пропіленгліколь у концентрації 0,2г/л. Промивання ведуть об'ємом, що відповідає 5-ти об'ємам сорбенту. На другій стадії промивання використовують 0,05 М ацетатний буферний розчин при рН 5,5, і промивання ведуть об'ємом, що відповідає трьом об'ємам сорбенту. Елюцію імуноглобуліну здійснюють 0,05М ацетатним буферним розчином при рН 5,5, що містить 0,2М хлориду натрію. Елюат містить імуноглобулін G у концентрації 3,5...4%. Далі проводять ультрафільтрацію та стерилізуючу фільтрацію. Нижче наведені приклади, що демонструють спосіб одержання імуноглобуліну, але не обмежують його. Приклад 1 150л донорської плазми крові подають у реактор. Додають 96%-ний (об/об) етиловий спирт в кількості 13,8л. Суміш перемішують при температурі мінус 2°С протягом години, і центрифугують при температурі мінус 3°С. Одержаний центрифугат об'ємом 162л подають у реактор, додають 26л 96%-ного (об/об) етилового спирту. С уміш перемі 6 шують при температурі мінус 9°С протягом 2 годин і центрифугують при температурі мінус 12°С. Отримують 7,2кг осаду А, який розчиняють у 159л 5%-ного етилового спирту, що містить 0,9% мас. натрію хлориду. Розчин осаду А подають у реактор, перемішують при температурі мінус 9°С протягом 5 годин і центрифугують при температурі мінус 8°С. Отримують 72кг осаду Б, який розчиняють у 81л 0,9%-ного натрію хлориду при температурі 0°С у реакторі при рН 5,15, додають 970л 2М ацетатного буферного розчину, перемішують протягом 3-х годин. Далі додають 31л 53%-ного етилового спирту, перемішують у реакторі при температурі мінус 9°С протягом трьох годин і центрифугують при температурі мінус 5°С. Отримують 125л центрифугат у Б1. Центрифугат Б1 подають у реактор, додають 260мл 1М гідрокарбонату натрію при рН розчину 5,5, перемішують суміш протягом 2 годин при температурі мінус 4°С і центрифугують при температурі мінус 5°С. Одержаний центрифугат об'ємом 120л освітлюють фільтрацією. До освітленого центрифугату у реакторі додають 200мл ацетатного буферного розчину при рН 5,4 і температурі мінус 4°С, перемішують, і додають 23л 96%-ного (об/об) етилового спирту, перемішують протягом години, додають 730мл 2М бікарбонату натрію, розчин при рН 7,2 перемішують протягом 3-х годин і центрифугують при температурі мінус 12°С. Отримують 1800г осаду В. Для перевірки ефективності вилучення вірусів при реалізації запропонованого способу використовували модельні віруси вірусної діареї ВРХ (BVD V), які були внесені до розбавленого після елюції розчину ферменту у кількості 2,5 log10 ТЦІД50/см 3 вір усу BVD V. Згідно до вимог GMP навмисне внесення будьякого вірусу у виробничі приміщення не допускається. Тому валідація проводилась у окремій лабораторії, обладнаній відповідним чином, з використанням моделі виробничого процесу. 1800г осаду В розчинили у 9л 0,05М ацетатного буферного розчину при рН 5,5 і температурі 4°С і подавали у реактор. До реактору за допомогою вакуум у подають 9л сольвент-детергентної суміші: 0,05М ацетатний буферний розчин при рН 5,5, що містить 1% мас. три-н-бутилфосфату і 1% мас. полісорбату 80. Суміш перемішують при температурі 25°С протягом 12 годин при швидкості обертання мішалки 80об/хв. Далі до ректору за допомогою вакууму подають 54л розчину, що містить: 0,05М ацетатний буферний розчин при рН 5,5, 1% мас. октаноату натрію, 0,15М хлориду натрію і пропіленгліколь у концентрації 0,2г/л. С уміш перемішують і пропускають через попередньо урівноважену хроматографічну колону діаметром 400мм, що містить 23л сульфопропілкатіонітного сорбенту, при об'ємній швидкості потоку 1200мл/хв (лінійна швидкість елюенту - 1см/хв). Сорбцію проводять біля 10 годин. Іммобілізований на сульфопропілкатіонітному сорбенті попередньо оброблений імуноглобулін піддають двостадійному промиванню. Для цього через колону пропускають 110л 0,05М ацетатного буферного розчину при рН 5,5, що містить 1% мас. октаноату натрію, 0,15М хлориду натрію і пропіленгліколь у концент 7 85741 рації 0,2г/л. Розчин пропускають при об'ємній швидкості 3600мл/хв (відповідає лінійній швидкості - 3см/хв), протягом 30 хвилин. Потім промивають 70л 0,05М ацетатного буферного розчину при рН 5,5 протягом 20 хвилин. Елюцію імуноглобуліну здійснювали 0,05М ацетатним буферним розчином при рН 5,5, що містить 0,2М хлориду натрію. Процес елюції тривав біля 60 хвилин. Елюат у кількості 34л збирали у стерильні 20-ти л скляні балони і проводили ультрафільтрацію. Титр вірусів після інактивації показав відсутність вірусів. Вихід цільового продукту - 98%. Фракційний склад одержаного напівфабрикату - сума мономеру і димеру імуноглобуліну - 96%, агрегати - менше 1%. Специфічна біологічна активність відповідає вимогам Європейської Фармакопеї. Чистота (метод електрофорезу на ацетатно-целюлозних плівках) - більше 99%. Домішки імуноглобулінів А і М - не виявлено. Одержаний продукт володіє низькою активністю активатору прекалакреїну та мінімальним вмістом анти-А і анти-Б гемаглютинінів, що свідчить про його нешкідливість. Титр інфекційності вірусу BVD V після інактивації показав відсутність інфекційності. Приклад 2 250л донорської плазми крові подають у реактор. Додають 96%-ний (об/об) етиловий спирт в кількості 23л. Суміш перемішують при температурі мінус 3°С протягом години, і центрифугують при температурі мінус 5°С. Одержаний центрифугат об'ємом 270л подають у реактор, додають 42л 96%-ного (об/об) етилового спирту. С уміш перемішують при температурі мінус 9°С протягом 2 годин і центрифугують при температурі мінус 10°С. Отримують 12кг осаду А, який розчиняють у 295л 5%-ного етилового спирту, що містить 0,9% мас. натрію хлориду. Розчин осаду А подають у реактор, перемішують при температурі мінус 9°С протягом 5 годин і центрифугують при температурі мінус 9°С. Отримують 72кг осаду Б, який розчиняють у 134л 0,9%-ного натрію хлориду при температурі 1°С у реакторі при рН 5,15, додають 1600л 2М ацетатного буферного розчину, перемішують протягом 3-х годин. Далі додають 52л 53%-ного етилового спирту, перемішують у реакторі при температурі мінус 9°С протягом трьох годин і центрифугують при температурі мінус 3°С. Отримують 210л центрифугат у Б1 Центрифуга т Б1 подають у реактор, додають 420мл 1М гідрокарбонату натрію при рН розчину 5,5, перемішують суміш протягом 2 годин при температурі мінус 3°С і центрифугують при температурі мінус 3°С. Одержаний центрифугат об'ємом 200л освітлюють фільтрацією. До освітленого центрифугату у реакторі додають 1000мл ацетатного буферного розчину Комп’ютерна в ерстка В. Клюкін 8 при рН 5,2 і температурі мінус 5°С, перемішують, і додають 37л 96%-ного (об/об) етилового спирту, перемішують протягом години, додають 1200мл 2М бікарбонату натрію, розчин при рН 7,2 перемішують протягом 3-х годин і центрифугують при температурі мінус 10°С. Отримують 3000г осаду В. 3000г осаду В розчинили у 15л 0,05М ацетатного буферного розчину при рН 5,5 і температурі 4°С і подали у реактор. До реактору за допомогою вакуум у подають 15л сольвент-детергентної суміші: 0,05М ацетатний буферний розчин при рН 5,5, що містить 1% мас. три-н-бутилфосфату і 1% мас. полісорбату 80. Суміш перемішують при температурі 25°С протягом 12 годин при швидкості обертання мішалки 80об/хв. Далі до ректору за допомогою вакууму подають 90л розчину, що містить: 0,05М ацетатний буферний розчин при рН 5,5, 1% мас. октаноату натрію, 0,15М хлориду натрію і пропіленгліколь у концентрації 0,2г/л. С уміш перемішують і пропускають через попередньо урівноважену хроматографічну колону діаметром 400мм, що містить 23л сульфопропілкатіонітного сорбенту, при об'ємній швидкості потоку 1200мл/хв (лінійна швидкість елюенту - 1см/хв). Сорбцію проводять біля 10 годин. Іммобілізований на сульфопропілкатіонітному сорбенті попередньо оброблений імуноглобулін піддають двостадійному промиванню. Для цього через колону пропускають 110л 0,05М ацетатного буферного розчину при рН 5,5, що містить 1% мас. октаноату натрію, 0,15М хлориду натрію і пропіленгліколь у концентрації 0,2г/л. Розчин пропускають при об'ємній швидкості 3600мл/хв (відповідає лінійній швидкості - 3см/хв), протягом 37 хвилин. Потім промивають 70л 0,05М ацетатного буферного розчину при рН 5,5 протягом 23 хвилин. Елюцію імуноглобуліну здійснювали 0,05М ацетатним буферним розчином при рН 5,5, що містить 0,2М хлориду натрію. Процес елюції тривав біля 60 хвилин. Елюат у кількості 34л збирали у стерильні 20-ти л скляні балони і проводили ультрафільтрацію. Вихід цільового продукту - 98,3%. Фракційний склад одержаного напівфабрикату - сума мономеру і димеру імуноглобуліну - 95%, агрегати - менше 1%. Специфічна біологічна активність відповідає вимогам Європейської Фармакопеї. Чистота (метод електрофорезу на ацетатно-целюлозних плівках) - більше 99%. Домішки імуноглобулінів А і М - не виявлено. Одержаний продукт володіє низькою активністю активатору прекалакреїну та мінімальним вмістом анти-А і анти-Б гемаглютинінів, що свідчить про його нешкідливість. Титр вірусів після інактивації - відсутність вірусів. Таким чином, запропонований спосіб забезпечує вірусобезпечність імуноглобуліну для лікарських препаратів та стабільність готового препарату. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601