Спосіб інактивації вірусів при одержанні імуноглобуліну

1. Спосіб інактивації вірусів при одержанні імуноглобуліну, що включає очистку розчину імуноглобуліну, виділеного спиртовим фракціонуванням, який відрізняється тим, що при очистці розчин імуноглобуліну попередньо обробляють сольвент-детергентною сумішшю 0,05М ацетатного буферного розчину при pH 5,5, що містить 1% мас. три-н-бутилфосфа ту і 1% мас. полісорбату 80, і обробку ведуть шляхом перемішування суміші протягом 12...16 годин з наступним розбавленням 0,05 М ацетатним буферним розчином при pH 5,5, що містить 1% мас. октаноату натрію, 0,15М хлориду натрію і пропіленгліколь у концентрації 0,2г/л, оброблений імуноглобулін іммобілізують на сульфопропілкатіонітному сорбенті з розміром зерен 50мкм і сорбційною ємністю 55мг/см 3 та здійснюють двостадійне промивання за допомогою колонкової хроматографії з наступною елюцією, причому, на першій стадії промивання використовують 0,05М ацетатний буферний розчин при pH 5,5, що містить 1% мас. октаноату натрію, 0,15М хлориду натрію і пропіленгліколь у концентрації 0,2г/л, на др угій стадії промивання використовують 0,05М ацетатний буферний розчин при pH 5,5, а елюцію здійснюють 0,05М ацетатним буферним розчином при pH 5,5, що містить 0,2М хлориду натрію. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що на першій стадії промивання ведуть об'ємом, що відповідає 5-ти об'ємам сорбенту. 3. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що на другій стадії промивання ведуть об'ємом, що відповідає трьом об'ємам сорбенту. 4. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що на першій і другій стадіях промивання ведуть зі швидкістю 3 см/хв. UA (21) a200701571 (22) 14.02.2007 (24) 25.02.2009 (46) 25.02.2009, Бюл.№ 4, 2009 р. (72) КУРИЩУК КОСТЯНТИН ВАСИЛЬОВИЧ, UA, СКРИННИК МАКСИМ МИ ХАЙЛОВИЧ, UA, ДІДЕНКО НАТАЛІЯ ЮРІЇВНА, UA, С АМОЙЛЕНКО ВАДИМ АН АТОЛІЙОВИЧ, U A, КУРКІНА ОКСАН А ВІКТОРІВН А, U A (73) КУРИЩУК КОСТЯНТИН ВАСИЛЬОВИЧ, UA, СКРИННИК МАКСИМ МИ ХАЙЛОВИЧ, UA, ДІДЕНКО НАТАЛІЯ ЮРІЇВНА, U A (56) US B1 6686191, 03.02.2004. RU C1 2261112, 27.09.2005. Edwards CA et al.: “Tri(n-butil)phosphate/detergent treatment of licensed therapeutic and experimental blood derivatives” Vox Sang. 1987; 52(1-2):53-9. ABSTR ACT. Roberts P. “Resistance of vaccinia virus to inactivation by solvent/detergent treatment of blood products”. Biologacals. 2000 Mar;28(1):29-32. ABSTR ACT. US A1 2001/0051708, 13.12.2001. RU C2 2197500, 27.01..2003. Курищук К.В. та інш. Хроматографічна очистка імуноглобулінів G як один з етапів сольвент/детергентної інактивації вірусів у те хнологічній схемі виробництва білкових препаратів плазми”, Укр. журнал гематології та трансфузіології. №5(6). – 2006. – стр. 29-33. RU C1 2332247, 27.08.2008. RU C1 2086255, 10.08.1997. RU C1 2199343, 27.02.2003. RU A 2005128507, 20.01.2006. RU A 2001101454, 20.01.2003. Курищук К.В. та інш. Оцінка ефективності сольвент/детергентної інактивації вірусів, впровадженої у технологію виробництва препаратів імуноглобулінів на ЗАТ „БІОФАРМА”, Укр. журнал гематології та трансфузіології”. – 1(8). – 2007. – стр. 25-31. 2 (19) 1 3 85734 Винахід відноситься до медицини, а саме до інактивації вірусів у виробництві глобулінів, що відносяться до білків плазми крові, що приймають участь в імунних реакціях, і може бути використаний при виробництві лікарських препаратів, що містять імуноглобулін фракції G. Істотною проблемою, що існує при використанні лікарських препаратів, отриманих з біологічного матеріалу, є небезпека контамінації вірусами. Відомі методи інактивації вірусів, зокрема, теплова обробка, неприйнятні до такої біологічної сировини як глобулярні білки плазми крові, оскільки призводять до їх руйнування і втрати біологічної активності. Найбільш близьким є спосіб інактивації вірусів при одержанні імуноглобуліну, що включає очистку розчину імуноглобуліну, виділеного спиртовим фракціонуванням [RU, патент №2261112, кл. А61К 39/395 опубл. 27.09.2005]. Очистка за відомим способом передбачає обробку розчину, що містить розбавлений 12-ма об'ємами води для ін'єкцій екстракт спиртового осаду Б (III фракція Кона) і хлорид натрію, хлороформом, який додають до 3% мас, при рН 4,0...5,0. Суміш витримують протягом 14 годин при 0...3°С, центрифугують, осад видаляють, і проводять освітлюючу фільтрацію. Недоліком відомого способу є низький рівень вилучення/інактивації вірусів при проведені зазначеної обробки, що залишає його вірусонебезпечним. У зв'язку з цим відомий спосіб передбачає проведення додаткової інактивації вірусів при кімнатній температурі шляхом витримки протягом 20...25 днів. Задачею винаходу є удосконалення способу інактивації вірусів при одержанні імуноглобуліну, в якому за рахунок запропонованої обробки і умов її проведення підвищується ефективність вилучення/інактивації вірусів, що забезпечує вірусобезпечність імуноглобуліну для лікарських препаратів. Запропонований спосіб є технологічним і легко контролюється. Поставлена задача вирішується запропонованим способом інактивації вірусів при одержанні імуноглобуліну, що включає очистку розчину імуноглобуліну, виділеного спиртовим фракціонуванням, в якому при очистці розчин імуноглобуліну попередньо обробляють сольвент - детергентною сумішшю, оброблений імуноглобулін іммобілізують на сульфопропілкатіонітному сорбенті і здійснюють двостадійне промивання за допомогою колоночної хроматографії з наступною елюцією. На першій стадії промивання використовують ацетатний буферний розчин, що містить октаноат натрію, хлорид натрію і пропіленгліколь, наприклад, 0,05М ацетатний буферний розчин при рН 5,5, що містить 1% мас. октаноату натрію, 0,15М хлориду натрію і пропіленгліколь у концентрації 0,2г/л, і промивання ведуть об'ємом, що відповідає 5-ом об'ємам сорбенту. На другій стадії промивання використовують ацетатний буферний розчин, наприклад, 0,05М ацетатний буферний розчин при рН 5,5 і промивання ведуть об'ємом, що відповідає трьом об'ємам сорбенту. Краще, на першій і другій стадіях промивання проводити зі швидкістю 3см/хв. 4 Як сольвент - детергентну суміш використовують 0,05М ацетатний буферний розчин при рН 5,5, що містить 1% мас. три-н-бутилфосфату і 1% мас. полісорбату 80. Обробку ведуть шляхом перемішування сольвент - детергентної суміші і розчину імуноглобуліну протягом 12...16 годин з наступним розбавленням 0,05М ацетатним буферним розчином при рН 5,5, що містить 1% мас. октаноату натрію, 0,15М хлориду натрію і пропіленгліколь у концентрації 0,2г/л. Для іммобілізації імуноглобуліну використовують сульфопропілкатіонітний сорбент, що має розмір зерен 50мкм, і сорбційну ємність 55мг/см 3. Елюцію обробленого і промитого імуноглобуліну здійснюють 0,05М ацетатним буферним розчином при рН 5,5, що містить 0,2М хлориду натрію. Експериментально було встановлено, що попередня сольвент - детергентна обробка розчину імуноглобуліну, виділеного спиртовим фракціонуванням, з наступною його іммобілізацією на сульфопропілкатіонітному сорбенті і промивкою певним ацетатним буферним розчином, призводять до підвищення ефективності вилучення/інактивації вірусів, що забезпечує вірусобезпечність препаратів імуноглобуліну. Спосіб здійснюється таким чином. Імуноглобулін, виділений спиртовим фракціонуванням за методом Кона (розчин осаду «В») розчиняють, у ацетатному буферному розчині. 3%ний розчин імуноглобуліну обробляють сольвент детергентною сумішшю. Ця стадія технологічного процесу включає експозицію імуноглобуліну розчином, що містить сольвент і детергент. Як сольвент використовують, наприклад, три-нбутилфосфат, як детергент - октоксинол 10, полісорбат 80, (3-пропіоллактон та інші поверхнево активні речовини. Змішування проводять в реакторі. Наприклад, 0,05М ацетатний буферний розчин при рН 5,5, що містить 1% мас. три-нбутилфосфату і 1% мас. полісорбату 80, змішують з розчином імуноглобуліну. С уміш перемішують протягом 12...16 годин при температурі 25°С. Далі суміш розбавляють 0,05М ацетатним буферним розчином при рН 5,5, що містить 1% мас. октаноату натрію, 0,15М хлориду натрію і пропіленгліколь у концентрації 0,2г/л. Оброблений таким чином імуноглобулін за допомогою колоночної хроматографії при лінійній швидкості елюенту 1см/хв іммобілізують на сульфопропілкатіонітному сорбенті, що має сорбційну ємність 55мг/см 3 і зерна розміром 50мкм. Після завершення сорбції здійснюють двостадійне промивання попередньо обробленого імуноглобуліну, іммобілізованого на сульфопропілкатіонітному сорбенті при лінійній швидкості елюенту 3см/хв. На першій стадії промивання використовують ацетатний буферний розчин того самого складу, що і для розбавлення суміші: 0,05М ацетатний буферний розчин при рН 5,5, що містить 1% мас. октаноату натрію, 0,15М хлориду натрію і пропіленгліколь у концентрації 0,2г/л. Промивання ведуть об'ємом, що відповідає 5-ти об'ємам сорбенту. На другій стадії промивання використовують 0,05М ацетатний буферний розчин при рН 5,5, 5 85734 6 Промивання ведуть об'ємом, що відповідає 3-ом використовували модельні віруси псевдосказу об'ємам сорбенту. (PRV). Елюцію імуноглобуліну здійснюють 0,05М аце3г осаду «В» імуноглобуліну людини, виділетатним буферним розчином при рН 5,5, що містить ного спиртовим фракціонуванням за методом Ко0,2М хлориду натрію. на, розчинили у 15мл 0,05М ацетатного буферного Елюат містить імуноглобулін G у концентрації розчину при рН 5,5 і температурі 4°С. 3,5...4%. В 3%-ний розчин імуноглобуліну вносили ³7,33 Нижче наведені приклади, що демонструють log10 ТЦІД50/см 3 вірусу PR V. ефективність способу інактивації вірусів при одерДо ємності, що містить 15мл 3%-ного розчину жанні імуноглобуліну, але не обмежують його. Згіімуноглобуліну з вірусом PRV додали 15мл сольдно до вимог GMP, навмисне внесення будь-якого вент - детергентної суміші: 0,05М ацетатний бувірусу у виробничі приміщення не допускається. ферний розчин при рН 5,5, що містить 1% мас. Тому валідація проводилась у окремій лаборатотри-н-бутилфосфату і 1% мас. полісорбату 80. рії, обладнаній відповідним чином, з використанСуміш перемішують при температурі 25°С протяням моделі виробничого процесу (приклади 1-6). гом 14 годин при швидкості обертання мішалки Приклад 1 80об/хв. Далі до ємності додають 90мл розчину, Для демонстрації ефективності вилученщо містить: 0,05М ацетатний буферний розчин при ня/інактивації вірусів запропонованим способом рН 5,5, 1% мас. октаноату натрію, 0,15М хлориду використовували модельні віруси вірусної діареї натрію і пропіленгліколь у концентрації 0,2г/л. СуВРХ (BVD V). міш перемішують і пропускають через попередньо 3г осаду «В» імуноглобуліну людини, виділеурівноважену хроматографічну колонку діаметром ного спиртовим фракціонуванням за методом Ко15мм, що містить 23см 3 сульфопропілкатіонітного на, розчинили у 15мл 0,05М ацетатного буферного сорбенту, при об'ємній швидкості потоку 1,7мл/хв розчину при рН 5,5 і температурі 4°С. (лінійна швидкість елюенту - 1см/хв). Сорбцію В 3%-ний розчин імуноглобуліну вносили 6,45 проводять біля 70хв. Іммобілізований на сульфоп3 log10 ТЦІД50/см вірусу BVD V. ропілкатіонітному сорбенті попередньо оброблеДо ємності, що містить 15мл 3%-ного розчину ний імуноглобулін піддають двостадійному промиімуноглобуліну з вірусом BVDV додали 15мл сольванню. Для цього через колонку пропускають вент - детергентної суміші: 0,05М ацетатний бу110мл 0,05М ацетатного буферного розчину при ферний розчин при рН 5,5, що містить 1% мас. рН 5,5, що містить 1% мас. октаноату натрію, три-н-бутилфосфату і 1% мас. полісорбату 80. 0,15М хлориду натрію і пропіленгліколь у концентСуміш перемішують при температурі 25°С протярації 0,2г/л. Розчин пропускають при об'ємній гом 12 годин при швидкості обертання мішалки швидкості 5мл/хв (відповідає лінійній швидкості 80об/хв. Далі до ємності додають 90мл розчину, 3см/хв), протягом 20 хвилин. Потім промивають що містить: 0,05М ацетатний буферний розчин при 70мл 0,05М ацетатного буферного розчину при рН рН 5,5, 1% мас. октаноату натрію, 0,15М хлориду 5,5 протягом 15 хвилин. натрію і пропіленгліколь у концентрації 0,2г/л. СуЕлюцію імуноглобуліну здійснювали 0,05М міш перемішують і пропускають через попередньо ацетатним буферним розчином при рН 5,5, що урівноважену хроматографічну колонку діаметром містить 0,2М хлориду натрію. Процес елюції три15мм, що містить 23см сульфопропілкатіонітного вав біля 50 хвилин. Елюат у кількості 34мл збирасорбенту, при об'ємній швидкості потоку 1,7мл/хв ли у стерильний посуд і проводили ультрафільт(лінійна швидкість елюенту - 1см/хв). Сорбцію рацію. проводять біля 70хв. Іммобілізований на сульфопТитр інфекційності вірусу PR V після інактивації ропілкатіонітному сорбенті попередньо оброблестановив