Спосіб оцінки токсичної дії свинцю у коропа лускатого

Реферат: UA 86573 U UA 86573 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до біології, ветеринарії та медицини, зокрема до методів оцінки токсичного впливу свинцю, і може бути використана в діагностичних установах та у лабораторіях референт-центрів. Із рівня техніки відомий ряд способів оцінки токсичного впливу свинцю на організм тварин [1]. Зокрема, для такої оцінки використовують печінкові ферменти [2], вміст продуктів перекисного окиснення ліпідів [3] та антиоксидантних ферментів [4]. Проте, недоліком цих способів є невисока чутливість, що не дозволяє однозначно стверджувати про токсичність іонів свинцю. В той же час білки теплового шоку, які являють собою один із найхарактерніших маркерів токсичної інтоксикації та загального стресу організму [5], взагалі не використовувалися для оцінки токсичного впливу важких металів у промислових риб, а, зокрема, коропа лускатого. Найбільш близьким до запропонованого способу є оцінка токсичного впливу цинку шляхом дослідження активності печінкових ферментів, зокрема, аспартат- та аланінамінотрансферази [2]. Недоліком даного способу є те, що на вищевказані ензими впливає ціла низка інших біогенних та абіогенних факторів, що значно підвищує ризик отримання недостовірних результатів. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити швидкий та ефективний метод оцінки токсичного впливу свинцю на організм коропа лускатого на основі детекції вмісту білка теплового шоку Hsp60. Технічний результат досягається шляхом використання методу точкової гібридизації для визначення рівня білка Hsp60 з використанням специфічних моноклональних антитіл. Поставлена задача вирішується тим, що в способі оцінки токсичного впливу іонів свинцю у коропа лускатого, що включає відбір зразків печінки, лізис та дослідження активності печінкових ферментів шляхом маркування з подальшою детекцією, згідно з корисною моделлю, як біологічний маркер використовують білок теплового шоку Hsp60. Визначення рівня білка теплового шоку Hsp60 дає можливість точно оцінити токсичний вплив іонів свинцю. Також вдається усунути недолік неспецифічної позитивної реакції, притаманний вищеописаному способу, який базується на дослідженні активності печінкових ферментів. Спосіб здійснюють таким чином. 1. Розморожену чи щойно відібрану тканину печінки лізують у десятикратному об'ємі буферу для лізування, рН 7,4 (15 % N-лаурилсаркозин, 20 мкМ фенілметилсульфонілфторид, 15 мкМ Nетилмалеїмід в 0,02 М натрій-фосфатному буфері). Далі відцентрифуговують зразки при 5 тис. g протягом 30 хв. при 4 °C. Вимірюють концентрацію білка у лізатах методом Лоурі. Для вирівнювання об'ємів та концентрацій загального білка розводять зразки буфером для розведення зразків, рН 7,4 (35 мМ Тріс-НСl, 100 мМ NaCl, 2,0 мМ KС1). 2. На нітроцелюлозну мембрану (Millipore) наносять лізат об'ємом 2 мкл із однаковим загальним вмістом білка. Для виявлення фонового свічення на мембрану наносять буфер для лізування та буфер для розведення зразків. 3. Блокують мембрану протягом 1 год. в 5 % розчині альбуміну. Після нанесення контрольних та дослідних зразків інкубують мембрану з моноклональними анти-Hsp60 антитілами (Sigma-Aldrich, США) - 1:5000 у ЗФРТ 120 хв., та поліклональними козячими антимишачими антитілами, кон'югованими з лужною фосфатазою (Sigma, США) - 1:5000 у ЗФРТ 60 хв. Здійснюють детекцію імунних комплексів з використанням комерційного розчину субстрату для лужної фосфатази - CDP-Star (Tropix, Велика Британія). Проводять візуалізацію за допомогою рентгенівської плівки ECL HyperFilm (Amersham, США) та набору для проявки плівок (Kodak). Для тестування ефективності запропонованого методу оцінки токсичності іонів свинцю було проведено дослідження вмісту білка Hsp60 в печінці коропа лускатого за дії іонів свинцю. Дослідження проводили у 4-ох групах зразків печінки: 1. Контрольній; 2. Першій дослідній - тварин інкубували 96 год. В водному середовищі з концентрацією іонів свинцю 0,2 мг/л; 3. Другій дослідній - тварин інкубували 96 год. В водному середовищі з концентрацією іонів свинцю 0,5 мг/л; 4. Третій дослідній - тварин інкубували 96 год. В водному середовищі з концентрацією іонів свинцю 5 мг/л; У печінці досліджуваних тварин було відмічено аналогічну до лейкоцитів картину, відповідно до якої усі застосовані концентрації іонів свинцю викликали вірогідне (р