Спосіб визначення утилізації гідрогенсульфіду в органах тварин

Реферат: Спосіб визначення утилізації гідрогенсульфіду в органах тварин включає приготування інкубаційної суміші, що містить буфер з оптимальним значенням рН, додавання гомогенатів тканин до інкубаційної суміші, інкубацію при 37 °C, зупинку реакції охолодженням, зв'язування сульфід-аніону додаванням розчину ацетату цинку, визначення кількості сульфід-аніону спектрофотометричним методом за утворенням барвника метиленового синього в реакції з N,N-диметил-пара-фенілендіаміном в присутності іонів заліза. При цьому до інкубаційного середовища додають як субстрат донор H2S-Na2S і визначають швидкість зниження концентрації сульфід-аніону в середовищі. UA 87884 U (12) UA 87884 U UA 87884 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до медицини, зокрема, до біохімії, та призначена для оцінки обміну біологічно-активного метаболіту гідрогенсульфіду (H2S) в органах тварин у нормі та при різних патологічних станах, а також для встановлення здатності фармакологічних засобів впливати на обмін H2S в органах тварин. Спосіб визначення продукції H2S в органах тварин є відомим і включає приготування інкубаційних сумішей, які містять субстрати та кофактори ензимів синтезу H 2S, буферу з оптимальним значенням рН, додавання гомогенатів органів до інкубаційних сумішей, інкубацію при 37 °C, зупинку реакції охолодженням, зв'язування сульфід-аніону додаванням розчину ацетату цинку та визначення кількості сульфід-аніону спектрофотометричним методом за утворенням барвника метиленового синього в реакції з N,N-диметил-пара-фенілендіаміном в присутності іонів заліза [Утворення гідроген сульфіду в органах щурів / Н.В. Заічко, Н.О. Пентюк, А.В. Мельник, О.І. Штатько, І.І. Андрушко // Медична хімія. - 2009. - Т.11, №4. - С 7-13; пат. України на корисну модель № 45018 U, МПК (2009) G01N 33/00. Спосіб визначення продукції гідроген сульфіду в органах тварин / Заічко Н.В., Пентюк Н.О., Мельник А.В., Штатько О.І.; № u 200904434; заявл. 05.05.2009; опубл. 26.10.2009; бюл. № 20. - 2 с.] Недоліком цього способу є те, що він призначений для оцінки продукції H 2S з сірковмісних амінокислот і не враховує здатність тканин споживати екзогенний та ендогенний H2S. Тому застосуванням відомого способу не вдається комплексно оцінити вплив фізіологічних та патологічних чинників, а також фармакологічних засобів на обмін H 2S в тканинах. В той же час, розробка методу визначення утилізації H2S в органах щурів дозволить встановити нові біохімічні механізми формування різних патологічних станів, визначити ефективність лікарських засобів донорів H2S та розробити нові шляхи фармакотерапії, спрямовані на корекцію обміну H 2S. В основу корисної моделі поставлена задача розробити спосіб визначення утилізації H 2S в органах експериментальних тварин, який давав би можливість оцінити швидкість споживання екзогенного H2S різними тканинами. Поставлена задача вирішується тим, що до інкубаційного середовища, яке містить буфер з оптимальним значенням рН замість субстратів та коферментів ензимів синтезу H 2S, додають як субстрат донор H2S-Na2S і визначають швидкість зниження концентрації сульфід-аніону в середовищі в присутності гомогенатів тканин тварин спектрофотометричним методом за утворенням метиленового синього в реакції з N,N-диметил-пара-фенілендіаміном в присутності іонів заліза. Застосування способу. З метою дослідження утилізації H2S в тканинах тварин готують інкубаційне середовище, яке містить донор H2S - 0,312 мМ Na2S, 0,47 мМ Тріс-НСІ буфер (рН 7,4), додають постядерний супернатант гомогенату тканин, інкубують при 37 °C в стерильних герметизованих пластикових пробірках. Реакцію зупиняють охолодженням пробірок на льоду, додають 1 % розчин ацетату цинку і визначають концентрацію сульфід-аніону в середовищі спектрофотометричним методом за утворенням метиленового синього в реакції з N,N-диметил-пара-фенілендіаміном в присутності іонів заліза. Конкретний приклад застосування способу. Для дослідження беруть білого лабораторного щура-самця (№ 1) масою 220 г, проводять евтаназію шляхом дислокації шийних хребців, виділяють органи тварини, промивають їх охолодженим ізотонічним 1,15 % розчином калію хлориду. Наважки тканин подрібнюють ножицями, гомогенізують при 3000 об./хв. (тефлон-скло) для печінки та нирок в середовищі 1,15 % розчину калію хлориду, для міокарду, аорти, мозку - в середовищі 0,25 М сахарози, 0,01 М Трис (рН 7,4) у співвідношенні 1:5 (маса/об'єм). Гомогенати центрифугують 30 хв. при 600 g, відбирають аліквоти постядерного супернатанту в мікропробірки Eppendorf. Всі процедури проводять при температурі 4-6 °C. До 1,0 мл інкубаційного середовища, що містить 312 мкМ Na2S, 0,47 мМ Тріс-НСІ буферу (рН 7,4) в кінцевих концентраціях, додають 0,1 мл постядерного супернатанту гомогенату тканини (кількість білка - 1-2 мг), інкубують 30 хв. при 37 °C в стерильних герметизованих пластикових пробірках типу Eppendorf. Контрольні проби інкубують без гомогенату, який додають лише після зупинки реакції. Дослідження проводять в трьох паралельних пробах. Реакцію зупиняють охолодженням пробірок на льоду, після чого додають 0,5 мл 1 % розчину ацетату цинку для зв'язування сульфід-аніону, 0,5 мл 20 мМ розчину N,Nдиметил-пара-фенілендіаміну в 7,2 М НСl, 0,4 мл 30 мМ розчину FeCl3 на 1,2 М НСl. Пробірки витримують 20 хв. при 18-25 °C, потім додають 1 мл 20 % трихлороцтової кислоти, центрифугують 10 хв. при 1500 g. Вимірюють абсорбцію надосадової рідини на фотометричному обладнанні при довжині хвилі 670 нм. Швидкість утилізації H2S визначають за зниженням концентрації сульфід-аніону в інкубаційному середовищі, яку розраховують за 1 UA 87884 U калібрувальним графіком. Стандартом є водні розчини Na 2S х 9Н2О з концентраціями 31,2-3120 мкМ, які обробляють як дослідні проби. Результати наведені в таблиці. Таблиця Конкретний приклад застосування способу визначення утилізації H2S в тканинах щура (М±m, n=3) Тканина Міокард Нирки Печінка Мозок Калібрувальна проба, 312 mkM H2S 5 А1 (абсорбція А2 (абсорбція контролю) досліду) А1-А2 0,285±0,003 0,170±0,001 0,371±0,008 0,145±0,005 0,152±0,003 0,040±0,004 0,085±0,005 0,088±0,002 0,133±0,002 0,130±0,005 0,286±0,005 0,057±0,005 0,352±0,002 % зниження за 30 хв. 46,7 76,4 77,1 39,3 Швидкість утилізації . H2S, нмоль /хв мг протеїну 0,682±0,007 0,669±0,021 1,46±0,016 0,294±0,026 3,31 0,337±0,004 0,015±0,002 Таким чином, запропонований спосіб визначення утилізації H2S в тканинах тварин є простим у виконанні і дозволяє оцінити здатність різних органів метаболізувати екзогенний H 2S. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 10 15 Спосіб визначення утилізації гідрогенсульфіду в органах тварин, який включає приготування інкубаційної суміші, що містить буфер з оптимальним значенням рН, додавання гомогенатів тканин до інкубаційної суміші, інкубацію при 37 °C, зупинку реакції охолодженням, зв'язування сульфід-аніону додаванням розчину ацетату цинку, визначення кількості сульфід-аніону спектрофотометричним методом за утворенням барвника метиленового синього в реакції з N,Nдиметил-пара-фенілендіаміном в присутності іонів заліза, який відрізняється тим, що до інкубаційного середовища додають як субстрат донор H 2S-Na2S і визначають швидкість зниження концентрації сульфід-аніону в середовищі. Комп’ютерна верстка А. Крулевський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2