Спосіб визначення продукції гідроген сульфіду в органах тварин

Спосіб визначення продукції гідроген сульфіду в органах тварин, що включає приготування інкубаційного середовища, основними компонентами 3 45018 редовищ. Це дає можливість визначити продукцію гідроген сульфіду 1) за рахунок десульфурування цистеїну (середовище 1), 2) за рахунок десульфурування цистеїну та його конденсації з гомоцистеїном (середовище 2), 3) за рахунок десульфурування цистеїну та його переамінування з альфакетоглутаратом (середовище 3). Результат 1 характеризує продукцію гідроген сульфіду виключно з цистеїну, різниця між результатом 2 та результатом 1 характеризує продукцію гідроген сульфіду за рахунок конденсації цистеїну з гомоцистеїном, а різниця між результатом З та результатом 1 характеризує продукцію гідроген сульфіду шляхом переамінування цистеїну з альфа-кетоглутаратом. Для визначення продукції гідроген сульфіду в органах тварин готують інкубаційне середовище 1, яке містить піридоксальфосфат 0,67мМ, L-цистеїн 3,3мМ, трис-буфер 0,083М (рН 8,5) в кінцевих концентраціях, ділять його на три частини і до одної частини додають D,L-гомоцистеїн в кінцевій концентрації 3,3мМ (середовище 2), до другої частини додають альфа-кетоглутарат в кінцевій концентрації 0,825мМ (середовище 3). Вносять в пробірки інкубаційні середовища 1, 2, 3, додають гомогенат органу, для попередження втрат гідроген сульфіду пробірки закривають плівкою "Раrаfilm", інкубують пробірки при 37°С. Контрольні проби інкубують без гомогенату, який додають лише після зупинки реакції. Зупиняють реакцію охолодженням пробірок на льоду, після чого додають 1% розчин ацетату цинку для зв'язування сульфід-аніону, 20мМ розчин N,N-диметил-пара-фенілендіаміну в 7,2М НСl, 30мМ розчин FeCl3 на 1,2М НСl. Пробірки витримують 20хв. при 18-25°С, потім додають 20% трихлороцтову кислоту, центрифугують 10хв. при 1500g. Вимірюють оптичну щільність надосадової рідини на фотометричному обладнанні при дов 4 жині хвилі 670нм проти контрольної проби, яку обробляють як дослідні проби за винятком того, що гомогенат вносять в середовище після інкубації та охолодження. Продукція гідроген сульфіду з цистеїну - результат 1, отриманий при використанні середовища 1, продукція гідроген сульфіду з цистеїну та гомоцистеїну - результат 2 (середовище 2), продукція гідроген сульфіду з цистеїну за участю альфа-кетоглутарату - результат 3 (середовища 3). Результат 2 - результат 1 = продукція гідроген сульфіду за рахунок конденсації цистеїну з гомо цистеїном, результат 3 - результат 1 = продукція гідроген сульфіду при переамінуванні цистеїну. До 0,5мл інкубаційних середовищ 1, 2 та 3, додають по 0,1мл гомогенату печінки (кількість білка 1мг), інкубують 30хв. при 37°С в пробірках, закритих плівкою "Parafilm". Контрольні проби інкубують без гомогенату, який додають лише після зупинки реакції. Реакцію зупиняють охолодженням пробірок на льоду, після чого додають 0,5мл 1% розчину ацетату цинку для зв'язування сульфіданіону, 0,5мл 20мМ розчину N,N-диметил-парафенілендіаміну в 7,2М НСl, 0,4мл 30мМ розчину FeCl3 на 1,2М НСl. Пробірки витримують 20хв. при 18-25°С, потім додають 1мл 20% трихлороцтової кислоти, центрифугують 10хв. при 1500g. Вимірюють оптичну щільність надосадової рідини на фотометричному обладнанні при довжині хвилі 670нм в кюветі з довжиною оптичного шляху 0,5см проти контрольної проби. Кількість утвореного гідроген сульфіду розраховують за калібрувальною пробою, в яку замість гомогенату додають 0,1мл 312мМ розчину Na2S x 9H2O і обробляють як дослідні проби. Результати та приклад розрахунку наведені в таблиці. Таблиця Конкретний приклад застосування способу визначення продукції гідроген сульфіду в печінці щура Інкубаційне середовище Шлях утворення гідроген сульфіду Продукція гідроген сульфіду, нмоль/хв/ мг білка Середовище №1 Десульфурування цистеїну 3,52 (результат 1) Середовище №2 Десульфурування цистеїну 5,85 (результат 2) та гомоцистеїну Розрахунок Конденсація цистеїну 5,85-3,52=2,33 з гомоцистеїном Середовище №3 Десульфурування цистеїну 5,68 (результат 3) та його пере амінування з альфа-кетоглутаратом Розрахунок Переамінування цистеїну 5,68-3,52=2,41 з альфа-кетоглутаратом Таким чином, запропонований спосіб визначення продукції гідроген сульфіду в органах тварин є простим у виконанні і дозволяє одночасно Комп’ютерна верстка О. Рябко визначити внесок різних шляхів в продукцію гідроген сульфіду з цистеїну та гомоцистеїну. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул.Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601