Спосіб визначення н2s-продукуючої активності міокарда тварин

Реферат: Спосіб визначення Н2S-продукуючої активності міокарда тварин включає приготування інкубаційних сумішей, буферу з оптимальним значенням рН, додавання гомогенатів міокарда до інкубаційних середовищ, інкубацію, зупинку реакції охолодженням, зв'язування сульфіданіону додаванням розчину ацетату цинку, визначення кількості сульфід-аніону, модифікування базового інкубаційного середовища, визначення продукції H2S з сірковмісних амінокислот та з неорганічних аніонів сірки, розрахунок загальної H2S-продукуючої активності міокарда. UA 75683 U (12) UA 75683 U UA 75683 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Спосіб визначення H2S-продукуючої активності міокарда тварин належить до медицини, зокрема до біохімії. Він призначений для оцінки продукції гідроген сульфіду (H2S) в міокарді у нормі та при різних патологічних станах, а також для встановлення здатності фармакологічних засобів коригувати зміни Н2S-синтезуючої активності міокарда тварин. Спосіб визначення продукції H2S в печінці та нирках тварин є відомим і включає приготування інкубаційних сумішей, які містять субстрати, косубстрати та кофактори різних Н 2Sпродукуючих ензимів (цистеїн, гомоцистеїн, альфа-кетоглутарат, піридоксальфосфат), буферу з оптимальним значенням рН, додавання гомогенатів органів до інкубаційних сумішей, інкубацію при 37 °C, зупинку реакції охолодженням, зв'язування сульфід-аніону додаванням розчину ацетату цинку та визначення кількості сульфід-аніону спектрофотометричним методом за утворенням барвника метиленового синього в реакції з Ν,Ν-диметил-пара-фенілендіаміном в присутності іонів заліза [див. Утворення гідроген сульфіду в органах щурів / Н.В. Заічко, Н.О. Пентюк, А.В. Мельник, О.І. Штатько, І.І. Андрушко // Медична хімія.-2009. - Т.11, №4. - С. 7-13; Пат. України на корисну модель № 45018 U МПК (2009) G01N 33/00. Спосіб визначення продукції гідроген сульфіду в органах тварин / Заічко Н.В., Пентюк Н.О., Мельник А.В., Штатько О.І.; № u200904434; заявл. 05.05.2009; опубл. 26.10.2009; Бюл. № 20.- 2 с.]. Недоліками цього способу є те, що він призначений для оцінки продукції H2S з сірковмісних амінокислот у паренхіматозних органах і не враховує внесок в продукцію H2S альтернативного метаболічного шляху синтезу H2 S з тіосульфат-аніону (за участі тіосульфатдитіолсульфідтрансферази). Тому застосуванням відомого способу не вдається визначити загальну H2S-продукуючу активність міокарда та порівняти внесок шляхів синтезу H2S з сірковмісних амінокислот (за рахунок десульфурування цистеїну, конденсації цистеїну з гомоцистеїном, переамінування цистеїну з альфа-кетоглутаратом) та з неорганічних аніонів сірки (зокрема, тіосульфат-аніону). В той же час, розробка методу визначення H2S-продукуючої здатності міокарда дозволить поглибити розуміння біохімічних механізмів формування патології серця та розробити нові шляхи фармакотерапії серцево-судинних захворювань, спрямованих на корекцію того чи іншого метаболічного шляху утворення H2S. В основу корисної моделі "Спосіб визначення Н2S-продукуючої активності міокарда тварин" поставлена задача розробити спосіб визначення продукції H2S в міокарді експериментальних тварин, який давав би можливість оцінити не лише утворення H2S з сірковмісних амінокислот, а й з тіосульфат-аніону, порівняти внесок кожного з метаболічних шляхів в цей процес та встановити загальну Н2S-продукуючу активність міокарда. Поставлена задача вирішується тим, що до інкубаційного середовища 1, яке містить субстрат цистеїн, кофактор піридоксальфосфат та трис-буфер, додають косубстрати гомоцистеїн (середовище 2) або альфа-кетоглутарат (середовище 3), а у середовище 4 додають тіосульфат-аніон та дитіотреітол замість цистеїну та піридоксальфосфату, визначають продукцію H2S в міокарді при одночасному використанні чотирьох інкубаційних середовищ та отримують дані щодо швидкості утворення H2S в реакціях: 1) десульфурування цистеїну (середовище 1), 2) конденсації цистеїну та гомоцистеїну (середовище 2), 3) трансамінування цистеїну з альфа-кетоглутаратом (середовище 3), 4) відновлення тіосульфату (середовище 4). Застосування способу. З метою дослідження продукції H2S в міокарді тварин готують інкубаційне середовище 1, яке містить L-цистеїн 6,0 мМ, піридоксальфосфат 1,34 мМ, трисбуфер 0,08 Μ (ρΗ 8,5) в кінцевих концентраціях, ділять його на три частини і до одної частини додають D, L-гомоцистеїн в кінцевій концентрації 6,0 мМ (середовище 2), до другої частини додають альфа-кетоглутарат в кінцевій концентрації 1,6 мМ (середовище 3). Середовище 4 містить трис-буфер 0,08 Μ (ρΗ 8,5), тіосульфат натрію 0,2 мМ, дитіотреітол 2,3 мМ. В пробірки вносять інкубаційні середовища 1, 2, 3, 4 додають гомогенат міокарда, для попередження втрат H2S пробірки закривають плівкою "Parafilm" та інкубують при 37 °C. Контрольні проби інкубують без гомогенату, який додають лише після зупинки реакції. Зупиняють реакцію охолодженням пробірок на льоду, після чого додають 1 % розчин ацетату цинку для зв'язування сульфіданіону, 20 мМ розчин Ν,Ν-диметил-пара-фенілендіаміну в 7,2М НСl, 30 мМ розчин FeCl3 на 1,2М НСl. Пробірки витримують 20 хв. при 18-25 °C, потім додають 20 % трихлороцтову кислоту, центрифугують 10 хв. при 1500 g. Вимірюють величину абсорбції надосадової рідини на фотометричному обладнанні при довжині хвилі 670 нм проти контрольної проби, яку обробляють як дослідні проби за винятком того, що гомогенат вносять в середовище після інкубації та охолодження. Продукція H2S при використанні середовища 1 відбувається за рахунок десульфурування цистеїну (результат 1), середовища 2 - за рахунок десульфурування цистеїну та гомоцистеїну (результат 2), середовища 3 - за рахунок десульфурування та переамінування цистеїну (результат 3), середовища 4 - за рахунок відновлення тіосульфатаніону (результат 4). Продукція H2S за рахунок конденсації цистеїну з гомоцистеїном 1 UA 75683 U 5 10 15 20 визначається шляхом віднімання від результату 2 результату 1 (2-1), а за рахунок переамінування цистеїну -шляхом віднімання від результату 3 результату 1 (3-1). Загальна H2Sпродукуюча активність міокарда розраховується як сума результатів 1, (2-1), (3-1) та 4. Конкретний приклад застосування способу. До 0,5 мл інкубаційних середовищ 1, 2, 3, 4 додали по 0,2 мл постядерного супернатанту гомогенату міокарда (кількість білка - 2 мг), інкубували 60 хв. при 37 °C в пробірках, закритих плівкою "Parafilm". Контрольні проби інкубували без гомогенату, який додали лише після зупинки реакції. Реакцію зупинили охолодженням пробірок на льоду, після чого додали 0,5 мл 1 % розчину ацетату цинку для зв'язування сульфід-аніону, 0,5 мл 20 мМ розчину Ν,Ν-диметил-пара-фенілендіаміну в 7,2М НСl, 0,4 мл 30 мМ розчину FeCl3 на 1,2М НСl. Пробірки витримали 20 хв. при 18-25 °C, потім додали 1 мл 20 % трихлороцтової кислоти, центрифугували 10 хв. при 1500 g. Виміряли абсорбцію надосадової рідини на фотометричному обладнанні при довжині хвилі 670 нм в кюветі з довжиною оптичного шляху 0,5 см проти контрольної проби. Кількість утвореного H2S розрахували за калібрувальною пробою, в яку замість супернатанту додали 0,1 мл 312 мМ розчину Na2S  9Н2О і обробили як дослідні проби. Для приготування постядерного супернатанту міокарда одразу після виділення серце перфузували холодним 1,15 % розчином калію хлориду, гомогенізували при 3000 об/хв. (тефлон-скло) в середовищі 1,15 % калію хлориду у співвідношенні 1:4, гомогенат центрифугували при 600 g та 4 °C упродовж 30 хвилин. Результати та приклад розрахунку наведені в таблиці. Таблиця Конкретний приклад застосування способу визначення продукції H2S в міокарді тварини (щура) Інкубаційне середовище Середовище 1 Шлях утворення H2S Десульфурування цистеїну Десульфурування цистеїну та Середовище 2 гомоцистеїну Конденсація цистеїну з Розрахунок гомоцистеїном Десульфурування цистеїну та його Середовище 3 переамінування з альфакетоглутаратом Переамінування цистеїну з альфаРозрахунок кетоглутаратом Середовище 4 Відновлення тіосульфату Розрахунок загальної Н2S-продукуючої активності міокарда 25 Продукція H2S, нмоль/хв. на 1 мг білка 0,23 (результат 1) 0,28 (результат 2) 0,28-0,23=0,05 0,75 (результат 3) 0,75-0,23=0,52 1,20 (результат 4) 0,23+0,05+0,52+1,20=2,00 Таким чином, запропонований спосіб визначення продукції H2S в міокарді тварин є простим у виконанні і дозволяє одночасно визначити внесок різних шляхів в продукцію H2S з сірковмісних амінокислот та неорганічних аніонів сірки (тіосульфату), а також розрахувати загальну H2S-продукуючу активність міокарда. 2 UA 75683 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 15 Спосіб визначення Н2S-продукуючої активності міокарда тварин, який включає приготування інкубаційних сумішей, що містять субстрати, косубстрати та кофактори різних H2S-продукуючих ензимів (цистеїн, гомоцистеїн, альфа-кетоглутарат, піридоксальфосфат), буферу з оптимальним значенням рН, додавання гомогенатів міокарда до інкубаційних середовищ, інкубацію при 37 °С, зупинку реакції охолодженням, зв'язування сульфід-аніону додаванням розчину ацетату цинку, визначення кількості сульфід-аніону спектрофотометричним методом за утворенням барвника метиленового синього в реакції з Ν,Ν-диметил-пара-фенілендіаміном в присутності іонів заліза, який відрізняється тим, що базове інкубаційне середовище модифікують включенням тіосульфату та дитіотреітолу замість цистеїну та піридоксальфосфату і визначають продукцію H2S з сірковмісних амінокислот та з неорганічних аніонів сірки (за рахунок відновлення тіосульфату), з наступним розрахунком загальної H2Sпродукуючої активності міокарда. Комп’ютерна верстка Л.Литвиненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3