Спосіб діагностики інфекційного мононуклеозу у дітей, спричиненого герпес-вірусом iv типу

Спосіб діагностики інфекційного мононуклеозу у дітей, спричиненого герпес-вірусом IV типу, що включає відбір проби біологічного матеріалу, його дослідження та оцінку результатів, який відрізняється тим, що як біологічний матеріал застосову Ю Ю 00 ST 8955 великих пластівців аглютинату у капілярі, порядком чергування великих і дрібних, дрібних і ледь помітних пластівців аглютинату (або за їх відсутністю), як критеріїв позитивної чи негативної реакцій [4]. Використання реакції аглютинації в діагностиці інфекційного мононуклеозу, спричиненого ЕБВ, при 83% чутливості і 97% специфічності, сприяло виявленню гетерофільних антитіл до ЕБВ в сироватці крові, що в деякій мірі поліпшило точність кінцевого результату [5]. Проте, специфічність реакції у дітей віком до 10 років, становить близько 20%, що стримує об'єктивність кінцевого результату, а отримання біологічного аналізату інвазивним, нефізіологічним шляхами, болісними і травматичними за характером, ускладнює його використання в клініці дитячих захворювань. До основи корисної моделі поставлено задачу розробити такий спосіб діагностики інфекційного мононуклеозу у дітей, спричиненого герпесвірусом IV типу, який шляхом доопрацювання селекції біологічних аналізатів підвищує об'єктивність та спрощує відтворення при використанні. Вищезазначений технічний результат при здійсненні корисної моделі, що заявляється, досягається тим, що у відомому способі діагностики інфекційного мононуклеозу у дітей, спричиненого герпес-вірусом IV типу, що містить відбір проби біологічного матеріалу, його дослідження та оцінку результатів, у відповідності з корисною моделлю, як біологічний матеріал залучають сечу, до 0,2мл сечі додають по 0,1 мл етилендіамінтетраоцту та • меркаптоетанолу, а через 15 хвилин - 0,2мл N, бензоїл-О,І_-аргінін-р-нітроанілід, як синтетичний хромогенний субстрат, і 0,5мл 0,1М фосфатного буферу при рН6,0, витримують суміш при Т37°С, а через 1 годину додають 2мл розчину трихлороцтової кислоти, відокремлюють осад центрифугуванням, визначають оптичну густину надосадової рідини при довжині хвилі 383нм і товщині шару 1см у кюветі, а при оцінці результатів встановлюють кількість відщеплення р-нітроаніліну від N, бензоїл-О,і_-аргінін-р-нітроаніліду, усвідомлюють активність лізосомного цистеїнового катепсину В у сечі та по збільшенню його від норми діагностують інфекційний мононуклеоз. Пропоноване технічне рішення підвищує об'єктивність шуканого результату, спрощує відтворення при використанні за рахунок переважного використання сечі, як біологічного матеріалу, та дослідження в ній вмісту цистеїнового катепсину В. Доданням до 0,2мл сечі по 0,1 мл етилендіамінтетраоцту та -меркаптоетанолу, а через 15 хвилин - 0,2мл N, -бензоїл-0,і_-аргінін-р-нітроаніліду, як синтетичного субстрату, і 0,5мл 0,1М фосфатного буферу при рН6,0 і витримкою суміші при заданій експозиції й Т37° С забезпечують реакцію відокремлення р-нітроаніліну від N, -бензоїл-О,І_аргінін-р-нітроаніліду. Використання розчину трихлороцтової кислоти, у кількості 2мл зумовлює гальмування протеолітичних процесів. Центрифугування сприяє відокремленню осаду і подальше визначення оптичної густини надосадової рідини колориметричним шляхом при довжині хвилі 383нм й товщині шару 1см у кварцовій кюветі. Дослідження цистеїнового катепсину В, що потрапляє в сечу, збігається з спостереженнями реакції 4 гідролізу N, -бензоїл-0,і_-аргінін-р-нітроаніліду та кількісним визначенням відщепленого рнітроаніліну, як діагностичної ознаки активності ферменту. Використання кількісних значень відщепленого р-нітроаніліну від N, -бензоїл-D.Lаргінін-р-нітроаніліду дозволяє розрахувати активність лізосомного цистеїнового катепсину В у сечі. Оцінка аналізату зводиться до виявлення активності лізосомного цистеїнового катепсину В у сечі, як чинника запального процесу. Це зумовлює визначення первинної фази розвитку інфекційного процесу під час активності цистеїнового катепсину В на фоні ЕБВ та її відокремлення від дій решти відомих інфекційних агентів. Кількісні значення реагентів й інших технологічних параметрів обрані оптимально для більш об'єктивного виходу шуканого результату. Тож, сукупність ознак корисної моделі процесу при досягненні заявленого технічного результату є суттєвою і відповідає критерію "новизна", оскільки не випливає з рівня техніки даного напряму явним чином. Для здійснення корисної моделі, що пропонується залучають: спектрофотометр, наприклад СФ-26 ("ЛОМО", Російська Федерація), центрифугу, р-меркаптоетанол ( -ME), етилендіамінтетраоцет (ЕДТО), N, -бензоїл-О,І_-аргінін-р-нітроанілід (BAPNA, "FluKa", Швейцарія), як синтетичний хромогенний субстрат, і трихлороцтову кислоту (ТХО). Сутність корисної моделі. До 0,2мл сечі додають по 0,1мл ЕДТО та 0,1 мл -ME та витримують на протязі 15 хвилин при Т37°С. Далі до цієї суміші додають 0,2мл BAPNA, як синтетичний хромогенний субстрат, та 0,5мл 0,1 М фосфатного буферу при рН6,0 і витримують 1 годину при Т37°С. Реакцію зупиняють доданням 2мл розчину ТХО. На протязі 20 хвилин осад відокремлюють центрифугуванням і визначають оптичну густину надосадової рідини за допомогою спектрофотометра СФ26, при довжині хвилі 383нм в кюветі і товщині шару біля 1см. Надалі знаходять кількість відщепленого р-нітроаніліну від BAPNA, усвідомлюють активність лізосомного цистеїнового катепсину В (у мікромолях за 1 хвилину на 1 мг білка) та по збільшенню його від норми діагностують інфекційний мононуклеоз. Вміст загальної кількості білка визначають за методом Бредфорда [6]. Контрольні проби відрізняються від досліджуваних доданою до сечі кількістю ТХО. Експериментальні дослідження, що здійснені при доопрацюванні пропонованого об'єкта доводять, що за вищезазначених умов визначення цистеїнового катепсину В у сечі має 100% специфічність і 45% інформативність (таблиця 1). У наданому вигляді властивості способу дозволяють майже у 45% випадків відокремлювати інфекційний мононуклеоз, що викликаний ЕБВ, від гострих інфекційних захворювань іншої етіології, з вірогідністю понад 90% (таблиця 2). Залучення сечі, як біологічного матеріалу, отриманої неінвазивним нетравматичним шляхом, з контролюванням активності цистеїнового катепсину В суттєво спрощує відтворення способу. У свою чергу, нові властивості пропонованого технічного рішення забезпечують своєчасність та ефективність терапевтичного втручання. 8955 Приклад. Історія хвороби №4732. Дитина Я. Ігор, 5 років поступив до міської клінічної лікарні №21 ім.проф. Є.Г. Полкової М.Дніпропетровська 16.09.04. з попереднім діагнозом: Лакунарна ангіна. Мати дитини висловлювала скарги на загальну слабкість, дратівливість, біль в горлі, припухлість на шиї. За даними анамнезу стало відомо, що дитина захворіла гостро, близько тижня потому, коли виникла нежить. На другу добу захворювання хлопчика оглянув дільничний педіатр, який встановив діагноз ГРВІ і призначив амбулаторне лікування амоксіциліном. В динаміці стан дитини погіршився - виник висип, посилився біль в горлі та значно збільшились лімфовузли на шиї. Це примусило батьків знову викликати дільничного педіатра, який направив хлопчика до лікарні. Під час опитування було з'ясоване, що дитина на диспансерному обліку з приводу будь-яких захворювань не перебувала. Ознак як медикаментозної, так і харчової алергії не помічено. Також стало відомим, що дитина не перебувала в контакті з хворим на будь-які інфекційні захворювання, та протягом минулого місяця за межи М.Дніпропетровська не виїздила. При надходженні до шпиталю - стан середнього ступеню тяжкості за рахунок інтоксикації. Дитина свідома, сон та апетит не порушені. Спостерігається фебрильна лихоманка (38,5°С). Шкіра та слизові оболонки, які видно, бліді, вологі, вільні від висипу. Периферичні лімфовузли в області шиї збільшені в розмірах, трохи болючі на дотик. При огляді ротоглотки виявлено помірну гіперемію слизової оболонки задньої стінки глотки та мигдаликів, на поверхні яких спостерігається гнійне нашарування. Хлопчик відмічає болючість при ковтанні, при цьому порушень фонації немає. Носове дихання значно порушено, храпливе. Ознак порушень функції органів дихання немає, при порівняльний перкусії і аускультації патологічних симптомів не визначено. Частота дихання 20 разів на хвилину. Границі серця у межах вікової норми, тони серця ритмічні та гучні, частота серцевих скорочень 85 вдарів на хвилину. Живіт звичайної форми, доступний усім видам пальпації, безболісний. Печінка виступає до 4 см з-під реберної дуги, селезінка до 2см від ребра. Стул один раз на добу, сечовиділення не порушено. Додаткові лабораторні дослідження не виявили в аналізі крові (від 16.09.04) атипових мононуклеарів (Таблиця 3), гетерофільний тест був негативним (1:26), печінковий комплекс без патологічних змін. Для швидкого уточнення причини захворювання у дитини була залучена сеча. Застосування цієї біологічної рідини дозволило запобігти надлишкову травматизацію, зменшуючи ризик ускладнень та економічні витрати. Досить малий обсяг аналізату не мав впливу на якість результатів дослідження. До 0,2мл сечі додавали по 0,1 мл етилендіамінтетраоцту та -меркаптоетанолу, через 15 хвилин - по 0,2мл N, -бензоїл-О,І_-аргінін-р-нітроаніліду і 0,5мл 0,1М фосфатного буферу при рН6,0. Отриману суміш витримували 1 годину в термостаті при Т37°С. До суміші реагентів надалі додавали 2мл розчину трихлороцтової кислоти. Осад і відокремлювали центрифугуванням. У прозорій надосадовій рідині визначали оптичну густину за допомогою спектрофотометра СФ-26 при довжині хвилі 383нм у кюветі й товщині шару біля 1 см. Надалі знаходили кількість відщепленого р-нітроаніліну від N, бензоїл-О,І_-аргінін-р-нітроаніліду, усвідомлювали активність лізосомного цистеїнового катепсину В у сечі. Загальну кількість білка визначали за Бредфордом [6]. Активність лізосомного цистеїнового катепсину В у сечі хлопчика, що дорівнювала 0,003мг/л, перевищувала норму і становила ознаку запалення, дозволила виявити наявність інфекційного мононуклеозу. Контрольні проби відрізняли від досліджуваних доданням до сечі ТХО. Результати повторних досліджень не визначили наявності діагностичного рівня атипових мононуклеарів в крові (Таблиця 3), бо відсутність в ній віроцитів та негативний результат гетерофільного тесту стримують визначення інфекційного мононуклеозу у ранньому віці дітей [3], проте тетерофільний тест став позитивним (1:56). Це дало змогу, хоча і запізно, затвердити діагноз на інфекційний мононуклеоз. Тож, орієнтування на присутність в сечі катепсину В надало можливість високовірогідно діагностувати інфекційний мононуклеоз, раніше ніж з'являються інші підтверджуючи лабораторні дані (віроцитоз, позитивний результат гетерофільного тесту), що сприяє призначенню адекватної терапії і, як слідство, зменшенню ускладнень перебігу захворювання. Наведений приклад інформує про можливість використання пропонованого об'єкта в клініці дитячих захворювань. Його запровадження допоможе об'єктивізувати діагностичні уявлення, щодо відокремлення інфекційного мононуклеозу, викликаного ЕБВ, від інших форм гострих інфекційних захворювань у дітей, та суттєво спростити відтворення у порівнянні з прототипом. Технічний результат, що досягається, зумовлений доопрацюванням селекції біологічних аналізатів. Отже, розроблене рішення задачі відповідає умові "промислова придатність", що по сукупності вище наданих тверджень дозволяє кваліфікувати його корисною моделлю України. Таблиця 1 Частота визначення активності цистеїнового катепсину В у сечі здорових та хворих на інфекційний мононуклеоз дітей Здорові(п=35) Норма,% Підвищення, % 35(100) 0 Інфекційний мононуклеоз (п=45) 25 20 (45) 8955 Таблиця 2 Частота визначення цистеїнового катепсину В у сечі дітей, хворих на інфекційний мононуклеоз та інші гострі інфекційні захворювання Критерії оцінки Норма, % Підвищення, % Інфекційний мононуклеоз (п=45) 25 20(45) Гострі інфекційні захворювання (п=10) 9(90) 1 = 4,1Р