Застосування спиртового екстракту хмелю як активної субстанції в фармацевтичних композиціях з протимікробною дією

Застосування спиртового екстракту хмелю як активної субстанції в складі фармацевтичних композицій з протимікробною дією. Винахід відноситься до хіміко-фармацевтичної галузі, зокрема, до комплексів біологічно активних речовин з рослинної сировини, а саме є засобом з антимікробною дією, який може бути використаний в якості активної субстанції при створенні відповідних фармацевтичних препаратів в різних лікарських формах. Високотехнологічні продукти переробки шишок хмелю (Humulus lupulus) все ширше застосовуються в броварництві замість традиційного використання первинної рослинної сировини. Найбільш популярним хмелепродуктом є вуглекислотний екстракт хмелю, однак показано, що фенольні речовини при цьому типі екстракції залишаються у відходах. Етанольний екстракт містить до 90% фенольних сполук первинної сировини, антиоксидантні властивості яких мають велике значення для якості пива (забезпечують стабільність багатьох якісних параметрів та підвищують терміни зберігання напою) [1, 2]. Специфікації продукту (згідно ТУ 10-04-06-0686 [3]): Густа сиропоподібна речовина темно зеленого кольору зі специфічним хмелевим запахом. Кондуктометричний показник гіркоти (12,0±0,3)% Масова доля сухих речовин - 60,0% Як і будь який інший рослинний екстракт, спиртовий екстракт хмелю представляє собою досить складну та багатокомпонентну суміш. Серед відомих біологічно активних речовин хмелю виділяють три основні групи [4]: - гіркі кислоти, що є похідними ацилфлороглюцидів, зокрема -кислоти (гумульон, когумульон та адгумульон) і -кислоти (лупульон та його похідні); - ефірні масла (відомо біля 100 компонентів, основними з яких є каріофіллен, -мірцен та гумулен); - пренілфлавоноїди, серед яких домінують ксантогумол та 8-преніларінгенін. Відомо також використання спиртового екстракту хмелю в фармацевтичних композиціях з седативною, спазмолітичною, знеболювальною, сечогінною та ранозагоювальною дією, що свідчить про прийнятні для таких композицій параметри токсичності та суттєвий потенціал в галузі комплексності терапевтичного впливу. Опублікованих результатів дослідження протимікробних властивостей спиртового екстракту (19) UA (11) 92274 (13) C2 (21) a200907813 (22) 24.07.2009 (24) 11.10.2010 (46) 11.10.2010, Бюл.№ 19, 2010 р. (72) КАЗМІРЧУК ВІКТОР ВОЛОДИМИРОВИЧ, ВОЛЯНСЬКИЙ ЮРІЙ ЛЕОНІДОВИЧ, ВОЛЯНСЬКИЙ АНДРІЙ ЮРІЙОВИЧ, ЛЯШЕНКО МИКОЛА ІВАНОВИЧ, СПИРИДОНОВ АНДРІЙ ВОЛОДИМИРОВИЧ, ВОРОПАЙ АНДРІЙ ЮРІЙОВИЧ, ВАЛЬЧУК СЕРГІЙ ІВАНОВИЧ, ШАТИЛО ЮЛІЯ ВІКТОРІВНА, ВОЛКОВ АНДРІЙ ОЛЕКСАНДРОВИЧ, КУЧМА ІРИНА ЮРІЇВНА, ЄВСЮКОВА ВІКТОРІЯ ЮРІЇВНА, СОРОКОУМОВА ЛЮДМИЛА КОСТЯНТИНІВНА, КОНЮХОВ ІГОР ВАСИЛЬОВИЧ, МАКАРЕНКО ВАЛЕНТИНА ДМИТРІВНА, АНДРЕЄВА ІРИНА ДМИТРІВНА, 3 хмелю в доступній літературі не виявлено, однак деякі публікації свідчать про наявність цього виду активності у різних речовин, виділених із хмелю та хмелепродуктів [3-6]. Відповідно до винаходу, що заявляється, новою сферою застосування спиртового екстракту хмелю є його використання в якості активної субстанції для створення фармацевтичних композицій з протимікробною дією. Біологічно активні субстанції рослинного походження користуються стабільним рівнем попиту в фармацевтичній промисловості, особливо в галузі виробництва антимікробних препаратів, що постійно потребує альтернативних варіантів у зв'язку з швидким розповсюдженням резистентності циркулюючих штамів мікроорганізмів до конвенційних засобів. В якості вихідного продукту зазвичай використовують натуральну рослинну сировину, при цьому суттєва кількість ресурсів витрачається на оптимізацію та стандартизацію технології її переробки, а отримані результати далеко не завжди виправдовують очікування. До типових аналогів в цій категорії можна віднести рослинні екстракти, захищені патентами №13236(UA) від 15.03.2006; №19508 (UA) від 15.12.2006; №64075 A (UA) від 16.02.2004; №27940 (UA) від 26.11.2007; №27986 (UA) 26.11.2007. Зокрема засіб, отриманий за способом, що розкритий в корисній моделі №27986 (UA) 26.11.2007 [5], є комплексом біологічно активних речовин лопуха великого з антибактерійною та імуностимулюючою активністю. В якості сировини використано листя і корені рослини. Склад отриманого препарату оцінювався за вмістом екстрактивних речовин та фенолів. При дослідженні протимікробної активності препарату в концентрації 200мкг/мл методом дифузії в агар (метод "колодязів") максимально виражений ефект (діаметр зони затримки росту 22,8мм) спостерігався по відношенню до клінічних штамів Staphylococcus epidermidis. Серед бактерій, що можуть мати патогенетичне значення в розвитку гнійно-запальних захворювань найбільш чутливими виявилися клінічні штами Staphylococcus aureus та Streptococcus pyogenes, - діаметри зон затримки росту 16,8 та 13,8мм відповідно. Ознаками, що збігаються з рішенням, яке заявляється, є використання в біологічно активних речовин рослинного походження, зокрема фенольних речовин з протимікробною активністю, одержаних шляхом спиртової екстракції з рослинної сировини. Основною причиною, що заважає отриманню бажаного технічного результату, є недостатньо високий рівень специфічної активності: концентрація препарату, використана при її дослідженні (200мкг/мл) не свідчить про наявність вираженого антибактерійного ефекту, співставимого з рівнем активності конвенційних протимікробних засобів. Таким чином, незважаючи на те, що екстракт готувався безпосередньо для використання в фармацевтичних композиціях с протимікробною дією, можливість створення такої композиції на його основі не можна вважати доведеною, оскільки ані 92274 4 спектр, ані рівень протимікробної дії не виглядають перспективно. Найближчим аналогом рішення, що заявляється є екстракт евкаліпту прутовидного (Encalypti viminalius), що використовується для виробництва рослинного протимікробного засобу хлорофіліпт [6]. Екстракт являє собою воскоподібну речовину темно-зеленого кольору з специфічним ароматом, що містить до 10% вологи, не є розчинним у воді, однак має добру розчинність в спирті, ефірі, хлороформі, бензолі, олеїновій кислоті та органічних маслах. За структурним складом це багатокомпонентна суміш органічних речовин, що містить хлорофіл "А" і хлорофіл "В", з якими асоціюється протимікробна активність хлорофіліпту. Цей фармацевтичний препарат випускається в формі 0,25% та 1% спиртового розчину екстракту густого, або 2% масляного розчину. Вміст активної речовини в 1% спиртовому розчині 10мг/мл. Хлорофіліпт виявляє надзвичайно високий (як для рослинного препарату) рівень антибактерійної активності по відношенню до Staphylococcus aureus, у тому числі антибіотикорезистентних штамів )мінімальна бактеріостатична концентрація складає 3,67,8мкг/мл). Ознаками, що збігаються з ознаками рішення, яке заявляється є використання біологічно активних речовин рослинного екстракту для створення фармацевтичної композиції з антимікробною активністю. Крім того, для доведення можливості застосування екстракту хмелю для створення такої композиції відтворено аналогічну лікарську форму (1% розчин в 96% етанолі). Причиною, що заважає отриманню бажаного технічного результату є досить тривалий термін застосування препарату (більш, ніж 30 років), що для антибактерійного засобу зазвичай супроводжується зниженням клінічної ефективності. Крім того, в Україні відсутня відповідна сировинна база, що зумовлює залежність виробництва від імпорту. В основу винаходу поставлено задачу довести можливість застосування комплексу біологічно активних речовин спиртового екстракту хмелю, що використовується при виробництві пива, в якості активної субстанції при створенні протимікробних фармацевтичних препаратів. Поставлене завдання вирішується шляхом створення фармацевтично-придатної композиції на основі спиртового екстракту хмелю, та оцінки рівня специфічної антимікробної активності у відношенні широкого спектру збудників інфекційних та гнійно-запальних захворювань. Композиція виготовлена у формі 1% розчину у 96% етиловому спирті з вмістом активної речовини 10мг/мл. При дослідженні специфічної активності в якості препарату порівняння використано хлорофіліпт у формі з аналогічним розчинником та вмістом активної субстанції (екстракту густого Encalypti viminalius). Контроль - розчин спирту етилового у концентрації, аналогічній концентрації в досліджуваних лікарських формах. Протимікробну дію густого спиртового екстракту з шишок хмелю перевіряли методом дифузії в агар (метод "колодязів"). Оцінено чутливість наступних тест-штамів мікроорганізмів: S. aureus 5 92274 ATCC 25923, S.aureus 6538-Р, S.epidermidis № 16589, S.haemolyticus № 16590, S.pneumoniae ATCC 49619, E. coli ATCC 25922, B.cereus ATCC 10702, B.subtilis ATCC 6633, K.pneumoniae K7NCTC9127, C.perfringens 28, C.difficile 258, Peptostreptococcus spp, C. albicans ATCC 885-653, Aspergillius niger. Мікробне навантаження становило - 106 КУО/ мл. 6 Наведені в таблиці результати дослідження свідчать про наявність у 1 % спиртового розчину спиртового екстракту хмелю рівня протимікробної активності, зіставимого з рівнем активності 1% хлорофіліпту, що підтверджує можливість здійснення корисної моделі. Таблиця Протимікробна активність спиртового екстракту хмелю № Штами мікроорганізмів 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. S.aureus ATCC 25923 S.epidermidis № 16589 S.haemolyticus № 16590 S. pneumoniae ATCC 49619 E.coli ATCC 25922 P. aeruginosa ATCC 27853 B. cereus ATCC 10702 B.subtilis ATCC 6633 K.pneumoniae ATCC 9127 Peptostreptococcus spp C.perfringens BP6K 28 тип А C.difficile 258 C.albicans ATCC 885-653 Aspergillus niger Діаметри зон затримки росту, мм (M±m) досліджувана компохлорофіліпт Контроль зиція (33,3±0,4) (10,0±0,1) * (18,2±0,2) (11,3±0,1) * (17,1±0,2) (7,6±0,1) * (22,9±0,2) (6,5±0,1) * (18,1±0,1) (10,2±0,1) * (16,5±0,2) (3,7±0,1) * (20,3±0,2) (17,3±0,1) * (12,2±0,4) (11,8±0,1) * (23,1±0,2) (19,9±0,1) * (24,5±0,3) (8,6±1,2) * (31,0±0,1) (8,6±1,2) * (24,8±0,2) (8,6±1,2) * (28,8±0,2) (16,2±0,3) * (30,5±0,5) (8,6±1,2) * * - зони затримки росту немає Відомості щодо властивостей, які обумовлюють можливість нового застосування спиртового екстракту хмелю. Як було зазначено вище, саме при етанольній екстракції досягається максимальний вміст фенольних сполук, до яких належать пренілфлавоноїди хмелю. Ксантогумол (хмелевий поліфенол ряду халконів), як показано [7] має суттєвий антиінфекційний потенціал та виявляє антибактерійну активність по відношенню Staphylococcus aureus and Streptococcus mutans, антивірусну активність по відношенню до цитомегаловірусу, вірусу простого герпесу (1 та 2 типи); фунгістатичну активність по відношенню до Trichophyton; здатність пригнічувати розмноження Plasmodium falciparum та збудників кокцидіозу (Е. acervulina, E. maxima, and E. Tenella). Відповідно, суттєва частина специфічної активності, що забезпечує можливість здійснення корисної моделі, може бути зумовлена саме цім компонентом. До присутніх в екстракті біологічно активних речовин з доведеними протимікробними властивостями належать і гірки кислоти [8]. Крім того, як і будь який інший екстракт з рослинної сировини, спиртовий екстракт хмелю, представляє собою достатньо складну для аналізу багатокомпонентну суміш, в який можлива наявність і інших речовин з бажаним видом специфічної активності та/або здатністю потенціювати дію компонентів з доведеними протимікробними властивостями. Перелік посилань: 1. Кунце В., Мит Г. Технология солода и пива: пер. с нем.. -СПб., Изд-во «Профессия», 2001. 912 с. 2. Biendl, M. et al.: Investigations into the production of a xan-thohumol-enriched hop products.// World Brewing Congress, Poster P-30, Orlando, USA, 2000. 3. Экстракт хмеля. Технические условия : ТУ 10-04-06-06-86. - [Действителен с 01.09.1986].Госагропром СССР, 1986, - 14 с. - (Стандарты ССССР).- Текст:рос. 4. De Cooman L, Everaert E, De Keukeleire D. Quantitative analysis of hop acids, essential oils, and flavonoids as a clue to the identification of hop varieties. Phytochem Anal . 1998;9:145-150. 5. Патент№ 27986 (UA) МПК(2006): A61K36/28, A61K125/00, A61K127/00 СПОСІБ ОДЕРЖАННЯ ЗАСОБУ З АНТИМІКРОБНОЮ ТА ІМУНОСТИМУЛЮЮЧОЮ АКТИВНІСТЮ. Заявник: НАЦІОНАЛЬНИЙ ФАРМАЦЕВТИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ, UA. Винахідники: ОПРОШАНСЬКА Т.В., ХВОРОСТ О.П., ДИКИЙ І.Л. Заявка № u200706257; дата подання 06.06.2007. Дата публікації: 26.11.2007. 6. Патент №5242 (SU) МПК (2006): А61К 36/61 СПОСІБ ОДЕРЖАННЯ ХЛОРОФІЛІПТУ Заявник: ХАРКІВСЬКИЙ НАУКОВО-ДОСЛІДНИЙ ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ ТА ІМУНОЛОГІЇ ЇМ.І.І.МЕЧНІКОВА. Винахідники: НАДТОКА В.Л.; БОЖКО H.Г. (UA); 7 92274 ГРИШКО О.Я. (UA) Заявка № 2753048/SU; дата подання 16.04.1979. Дата публікації: 28.12.1994. 7. Gerhäuser С.Broad spectrum anti-infective potential of xanthohumol from hop (Humulus lupulus L.) in comparison with activities of other hop Комп’ютерна верстка Н. Лиcенко 8 constituents and xanthohumol metabolites. .// Моl Nutr Food Res. 2005 Sep;49(9):827-31. 8. Van Cleemput M. Hop (Humulus lupulus)Derived Bitter Acids as Multipotent Bioactive Compounds. //Van Cleemput M, Cattoor K, et al. // J Nat Prod. -2009.- May 28. [Epub ahead of print]. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601