Застосування вуглекислотного екстракту хмелю як активної субстанції в фармацевтичних композиціях з протимікробною дією

Застосування вуглекислотного екстракту хмелю як активної субстанції в складі фармацевтичних композицій з протимікробною дією. (19) (21) a200907812 (22) 24.07.2009 (24) 11.10.2010 (46) 11.10.2010, Бюл.№ 19, 2010 р. (72) КАЗМІРЧУК ВІКТОР ВОЛОДИМИРОВИЧ, ЛЯШЕНКО МИКОЛА ІВАНОВИЧ, СПИРИДОНОВ АНДРІЙ ВОЛОДИМИРОВИЧ, ВОРОПАЙ АНДРІЙ ЮРІЙОВИЧ, ШУЛЬГА НАТАЛІЯ МИКОЛАЇВНА, ШАТИЛО ЮЛІЯ ВІКТОРІВНА, ВОЛКОВ АНДРІЙ ОЛЕКСАНДРОВИЧ, КУЧМА ІРИНА ЮРІЇВНА, ЄВСЮКОВА ВІКТОРІЯ ЮРІЇВНА, ВОЛЯНСЬКИЙ ДМИТРО ЛЕОНІДОВИЧ, СОРОКОУМОВ ВАЛЕРІЙ ПАВЛОВИЧ, КОНЮХОВ ВАСИЛІЙ ІВАНОВИЧ, МАКАРЕНКО ВАЛЕНТИНА ДМИТРІВНА, ТОРЯ 2 3 швидким розповсюдженням резистентності циркулюючих штамів мікроорганізмів до конвенційних засобів. В якості вихідного продукту зазвичай використовують натуральну рослинну сировину, при цьому суттєва кількість ресурсів витрачається на пошук та стандартизацію оптимальної технології її переробки, а отримані результати далеко не завжди виправдовують очікування. До типових аналогів в цій категорії можна віднести рослинні екстракти, захищені патентами №13236(UA) від 15.03.2006; №19508 (UA) від 15.12.2006; №64075 A (UA) від 16.02.2004; №27940 (UA) від 26.11.2007; №27986 (UA) 26.11.2007. Зокрема засіб, отриманий за способом, що розкритий в корисній моделі № 27986 (UA) 26.11.2007 [8], є комплексом біологічно активних речовин лопуха великого з антимікробною та імуномодулюючою дією. В якості сировини використано листя і корені рослини. Склад отриманого препарату оцінювався за вмістом екстрактивних речовин та фенолів. При дослідженні протимікробної активності препарату в концентрації 200мкг/мл методом дифузії в агар (метод „колодязів") максимально виражений ефект (діаметр зони затримки росту 22,8 мм) спостерігався по відношенню до клінічних штамів Staphylococcus epidermidis. Серед бактерій, що можуть мати патогенетичне значення в розвитку гнійно-запальних захворювань найбільш чутливими виявилися клінічні штами Staphylococcus aureus та Streptococcus pyogenes - діаметри зон затримки росту 16,8 та 13,8 мм відповідно. Ознаками, що збігаються з ознаками рішення, яке заявляється, є використання біологічно активних речовин рослинного походження для створення фармацевтичної композиції з протимікробною активністю. Основною причиною, що заважає отриманню бажаного технічного результату, є недостатньо високий рівень специфічної активності: концентрація препарату (200мкг/мл), використана при дослідженні, не свідчить про наявність вираженого антибактерійного ефекту. Таким чином, незважаючи на те, що екстракт готувався безпосередньо для використання в фармацевтичних композиціях з протимікробною дією, можливість створення такої композиції на його основі не можна вважати доведеною. Найближчим аналогом рішення, що заявляється є екстракт евкаліпту прутовидного (Encalypti viminalius), що використовується для виробництва рослинного протимікробного засобу хлорофіліпт 19]. Екстракт представляє собою воскоподібну речовину темно-зеленого кольору з специфічним ароматом, що містить до 10 % вологи, не є розчинним у воді, однак має добру розчинність в спирті, ефірі, хлороформі, бензолі, олеїновій кислоті та органічних маслах. За хімічною структурою він представляє собою складну суміш органічних 92273 4 речовин, що містить хлорофіл "А" і хлорофіл "В", з якими асоціюється протимікробна активність хлорофіліпту. Цей фармацевтичний препарат випускається в формі 0,25 % та 1 % розчину в 96 % етанолі, або 2 % масляного розчину екстракту Eucalypti viminalius. Вміст активної речовини в 1 % спиртовому розчині 10 мг/мл. Хлорофіліпт виявляє високий рівень антибактерійної активності по відношенню до Staphylococcus aureus, у тому числі по відношенню до антибіотикорезистентних штамів, (мінімальна бактеріостатична концентрація складає 3,6-7,8мкг/мл). Ознаками, що збігаються з ознаками рішення, яке заявляється, є використання біологічно активних речовин рослинного екстракту для створення фармацевтичної композиції з антимікробною активністю. Крім того, для доведення можливості застосування екстракту хмелю при створенні такої композиції, відтворено аналогічну лікарську форму (1 % розчин в 96 % етанолі). Причиною, що заважає отриманню бажаного технічного результату є досить тривалий термін застосування препарату (більш, ніж 30 років), що для антибактерійного засобу зазвичай супроводжується зниженням клінічної ефективності. Крім того, в Україні відсутня відповідна сировинна база, що зумовлює залежність виробництва від імпорту. В основу корисної моделі поставлено задачу довести можливість застосування комплексу біологічно активних речовин стандартного вуглекислотного екстракту хмелю, що використовується для виробництва пива, за новим призначенням, а саме в якості активної субстанції для створення протимікробних фармацевтичних препаратів. Поставлене завдання вирішується шляхом створення фармацевтично-придатної композиції на основі густого вуглекислотного екстракту хмелю та оцінки рівня антибактерійної активності у відношенні широкого спектру збудників інфекційних та гнійно-запальних захворювань. Композиція виготовлена у формі 1 % розчину в 96 % етанолі. Вміст екстракту складе 10 мг/мл. При дослідженні специфічної активності в якості препарату порівняння використано хлорофіліпт у формі з аналогічним розчинником та вмістом активної речовини (екстракту густого Eucalypti viminalius). Протимікробну активність СО2 екстракту хмелю оцінювали методом дифузії в агар (метод «колодязів»). В дослідах використовували наступні тест-штами мікроорганізмів: S. aureus ATCC 25923, S.aureus 6538-P, S.epidermidis №16589, S.haemolyticus №16590, S.pneumoniae ATCC 49619, E.coli ATCC 25922, B.cereus ATCC 10702, B.subtilis ATCC 6633, K.pneumoniae K-7NCTC9127, C.perfringens 28, C.difficile 258, Peptostreptococcus spp, С albicans ATCC 885-653, Aspergillius niger. Мікробне навантаження становило - 106КУО/мл. Результати досліджень представлені в таблиці. 5 92273 6 Таблиця. Протимікробна активність вуглекислотного екстракту з шишок хмелю за методом колодязів № 1 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. Штами мікроорганізмів 2 S.aureus ATCC 25923 S.epidermidis №16589 S.haemolyticus №16590 S. pneumoniae ATCC 49619 E.coli ATCC 25922 P. aeruginosa ATCC 27853 B.cereus ATCC 10702 B.subtilis ATCC 6633 K.pneumoniae ATCC 9127 Peptostreptococcus spp C.perfringensBP6K28 тип А C.albicans ATCC 885-653 Aspergillus niger Діаметри зон затримки росту, мм (M±m) досліджувана композиція хлорофіліпт 3 4 (34,3±0,4) (10,0±0,1) (19,2±0,2) (11,3±0,1) (18,1±0,2) (7,6±0,1) (23,9±0,2) (6,5±0,1) (19,1±0,1) (10,2±0,1) (16,4±0,2) (3,7±0,1) (28,3±0,2) (17,3±0,1) (15,2±0,4) (11,8±0,1) (27,1±0,2) (19,9±0,1) (22,5±0,5) (8,6±1,2) (18,0±0,1) (8,6±1,2) (29,1±0,2) (16,2±0,3) (24,6±0,5) (8,6±1,2) Контроль 5 * * * * * * * * * * * * * * - зони затримки росту немає Наведені дані свідчать про наявність у 1 % спиртового розчину вуглекислотного екстракту хмелю рівня протимікробної активності, співставимого з рівнем активності 1 % хлорофіліпту, що підтверджує можливість здійснення корисної моделі. Відомості щодо властивостей, які обумовлюють можливість нового застосування вуглекислотного екстракту хмелю. Наведений в специфікації продукту перелік речовин відображує лише частину складу екстракту, що характеризує якісні параметри, важливі в броварництві. Як і будь-який інший рослинний екстракт, він являє собою досить складну та багатокомпонентну суміш. Виділяють три основні групи біологічно активних речовин хмелю: - гіркі кислоти похідні ацилфлороглюцидів, зокрема -кислоти (гумульон, когумульон та адгумульон) і ( -кислоти (лупульон та його похідні); - ефірні масла (відомо біля 100 компонентів, основними з яких є каріофіллен, ( -мірцен та гумулен); - пренілфлавоноїди, серед яких домінують ксантогумол та 8-преніларінгенін. У гірких кислот хмелю виявлено найбільшу кількість біологічних ефектів [3], в тому числі і антимікробну активність по відношенню до Listeria monocytogenes, Clostridium botulinum, Clostridium aminophilum, Clostridium sticklandii, Propionibacterium acnes, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus pyogenes, Kocuria rhizophila, Peptostreptococcus anaerobius, Helicobacter pylori [4-7]. Оскільки саме при вуглекислотній екстракції досягається максимальний вміст гірких кислот та їх похідних, суттєва частина специфічної активності, що спостерігається, може бути зумовлена саме цім компонентом. Крім того, цілком імовірна наявність в СО2 екстракті і інших речовин з антимікробною дією та/або здатністю потенціювати активність гірких кислот. Перелік посилань: 1. Вуглекислотний екстракт хмелю [Електронний ресурс]. Режим доступу:URL:http://www.barthhaasgroup.eom/cmsdk./cont ent/bhg/products/co2extractru.pdf]. 2. Hougee S. Selective inhibition of COX-2 by a standardized CO2 extract of Humulus lupulus in vitro and its activity in a mouse model of zymosan-induced arthritis./ Hougee S, Faber J, Sanders A, Berg WB, Garssen J, Smit HF, Hoijer MA. //Planta Med.- 2006.Feb; V72(3).- P.228-233. 3. Van Cleemput M. Hop (Humulus lupulus)Derived Bitter Acids as Multipotent Bioactive Compounds. //Van Cleemput M, Cattoor K, et al. //J Nat Prod. -2009. - May 28. [Epub ahead of print]. 4. Antilisterial Activity of Hops Beta Acids in Broth with or Without Other Antimicrobials /С. Shen, J.N. Sofos //Journal of Food Science.-V 73.- Issue 9.- P. M438 - M442. 5. Yamaguchi N. In vitro evaluation of antibacterial, anticollagenase, and antioxidant activities of hop components (Humulus lupulus) addressing acne vulgaris. //Yamaguchi N, SatohYamaguchi K, Ono M. // Phytomedicine. -2009.- V16.N4. P.369-376. 6. Simpson WJ. Factors affecting antibacterial activity of hop compounds and their derivatives. Simpson WJ, Smith AR. //J Appl Bacteriol. -1992.V.72. N4.-P.327-334. 7. Ohsugi, M. 1997. Antibacterial activity of traditional medicines and an active constituent lupulone from H. lupulus against Helicobacter pylori. //Journal of Traditional Medicines.-1997.-N 14.-P.186191. 8. Патент №27986 (UA) МПК (2006): A61K36/28, A61K125/00, A61K127/00 Спосіб одержання засобу з антимікробною та імуностимулюючою активністю. Заявник: Національний фармацевтичний університет, UA. Винахідники: 7 92273 Опрошанська Т.В., Хворост О.П., Дикий І.Л. Заявка № U200706257; дата подання 06.06.2007. Дата публікації: 26.11.2007. 9. Патент №5242 (SU) МПК (2006): А61К36/61 Спосіб одержання хлорофіліпту Заявник: Харків Комп’ютерна верстка В. Мацело 8 ський науково-дослідний інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечнікова. Винахідники: Надтока В.Л.; Божко H.T. (UA); Гришко О.Я. (UA) Заявка №2753048/SU; дата подання 16.04.1979. Дата публікації: 28.12.1994. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601