Спосіб діагностики алергічної реакції

Спосіб діагностики алергічної реакції, що включає додавання до серії пробірок з дослідними зразками цитратної крові обстежуваного рівних об'ємних доз різних алергенів, інкубацію впродовж ЗО хвилин при кімнатній температурі, визначення стандартним способом кількості вивільненого в результаті цитолізу хімічного елемента, що є показником алергічного ушкодження клітин крові, і розрахунок різниці між цією кількістю і кількістю цього ж елемента, яка вивільнилась після аналогічної обробки контрольного зразка, який відрізняється тим, що в дослідних і контрольному зразках крові обстежуваного фотометричним способом визначають загальний фосфор і, коли різниця в кількості загального фосфору, що вивільнився, між принаймні одним з дослідних зразків і контрольним зразком перевищує 0,1 мг/л, діагностують алергічну реакцію. Корисна модель відноситься до медицини, зокрема до алергології і може бути використана для діагностики алергічної реакції на побутові, пилкові, епідермальні, харчові, промислові і лікарські алергени. Відомий спосіб діагностики алергічної реакції, заснований на внутріш-ньошкірному введенні алергенів [1]. Шкірні проби з алергенами залишаються найважливішим і простим методом діагностики алергії, однак їх специфічність є недостатньою та, крім того, існує ризик ускладнень. Відомий також спосіб діагностики алергічної реакції за показником ушкодження нейтрофілів (ППН) [2]. Спосіб ППН недостатньо специфічний, вимагає складних процедур гістохімічного фарбування і мікроскопії клітин. Останнім часом певного поширення здобув спосіб діагностики алергії, заснований на реакції бласттрансформації лімфоцитів (РБТЛ) з алергенами [3]. Однак цей тест недостатньо специфічний, вимагає складних процедур виділення лімфоцитів, їхнього тривалого культивування в стерильних умовах. Облік результатів проводиться недостатньо точним методом підрахунку пофарбованих клітин чи дорогим методом авторадіографії з використанням небезпечних для здоров'я радіоактивних ізотопів. Найближчим аналогом способу діагностики алергічної реакції, що заявляється, є спосіб, заснований на визначенні алергічної альтерації лейкоцитів [4]. Він здійснюється наступним чином. В дослідні і контрольну проби цитратної крові обстежуваного вносять, відповідно, рівні об'ємні дози різних алергенів та ізотонічного розчину натрію хлориду і визначають різницю в кількості калію, індикатора алергічного ушкодження клітин, що вивільняється з клітин крові під дією алергену в дослідних пробах і в контрольній пробі крові. Спосіб є технічно простим, не вимагає складних процедур виділення імунокомпетентних клітин, їхнього підрахунку, гістохімічного фарбування. Даний метод є спрощеним варіантом способу ППН. Однак чутливість і специфічність методу всетаки недостатні, в основному через вплив натрію, що заважає при визначенні калію в плазмі. Задачею корисної моделі, що заявляється, є вдосконалення способу діагностики алергічної реакції, зокрема спрощення без втрати точності, шляхом визначення рівня загального фосфору в пробі крові обстежуваного після інкубації її зі специфічним алергеном. Це забезпечує оцінку сумарної реакції на специфічний алерген всіх ланок імунітету (у тому числі і неспецифічного) без перешкод з боку інших аналітичних чинників. Технічний результат, що досягається корисною моделлю, буде полягати у спрощенні способу діагностики алергічної реакції без втрати його точності. СО 00 со О) о> 9383 Поставлене завдання вирішується тим, що у відомому способі діагностики алергічної реакції, що включає додавання до серії пробірок з дослідними зразками цитратної крові обстежуваного рівних об'ємних доз різних алергенів, інкубацію впродовж ЗО хвилин при кімнатній температурі, визначення стандартним способом кількості вивільненого в результаті цитолізу хімічного елемента, що є показником алергічного ушкодження клітин крові, і розрахунок різниці між цією кількістю і кількістю цього ж елементу, яка вивільнилась після аналогічної обробки контрольного зразка, згідно корисної моделі, в дослідних і контрольному зразках крові обстежуваного фотометричним способом визначають загальний фосфор і, коли різниця в кількості загального фосфору, що вивільнився, між принаймні одним з дослідних зразків і контрольним зразком перевищує 0,1мг/л, діагностують алергічну реакцію. Відмінною особливістю запропонованого способу є використання в якості показника алергічного ушкодження клітин крові рівня загального фосфору в пробі. Обґрунтуванням цього є та обставина, що вміст фосфору в клітинах крові в 3-5 разів вищий, ніж вміст калію (який використовується в способі-прототипі). Це значно підвищує чутливість способу. За доступними літературними даними такий спосіб діагностики алергічної реакції невідомий. Запропонований спосіб діагностики алергічної реакції здійснюється наступним чином. У дослідні і контрольну проби цитратної крові обстежуваного вносять, відповідно, рівні об'ємні дози різних алергенів і ізотонічного розчину натрію хлориду. Для цього, скажімо, 5 мл крові обстежуваного, отриманої пункцією ліктьової вени, виливають у градуйовану цен ірифужну пробірку з 0,5 мл 5% розчину тризаміщеного цитрату натрію. Отриману стабілізовану (цитратну) кров розливають по центрифужним пробіркам по 0,25мл і додають у кожну по 0,025мл алергену у розведенні 1 мкг/мл. У контрольну пробірку з кров'ю додають такий самий об'єм (0,025мл) 0,85° о розчину хлориду натрію. Всі проби крові інкубують при кімнатній температурі на протязі 30хв. Визначають кількість загального фосфору в кожній пробі, для чого використовують наступні реактиви: 10% розчин трихлороцтової кислоти; 57% розчин хлорної кислоти; 4% розчин молібдату амонію; 1% розчин аскорбінової кислоти, приготовлений перед використанням; основний стандартний розчин однозаміщеного фосфату калію (4,39грама речовини розчиняють у 1 літрі дистильованої води; у 1 мл такого розчину міститься 1 мг фосфору). Робочий стандартний розчин фосфату калію готують розведенням основного стандартного розчину в 100 разів (1 мл його містить 0,01 мг фосфору). Всі пробірки центрифугують при 1000об./хв., з кожної пробірки відбирають по 0,05мл плазми, яку поміщають в пробірки з 0,25 мл 57% хлорної кислоти. Потім суміш реагентів прогрівають на піщаній бані (при 180°С) до знебарвлення. Після цього в пробірки додають по 1,7мл дистильованої води, 0,25мл 4% розчину молібдату амонію, змішують і додають 0,25мл 1% аскорбінової кислоти. Через 20 хвилин проби колориметрують при довжині хвилі 750нм у 5-мм кюветі проти контролю суміші реагентів. Кількість загального фосфору в кожній пробі визначають з використанням робочого стандартного розчину фосфату натрію. Дослідження проводять з індивідуальними алергенами (волосся людини, перо, яйце куряче, молоко коров'яче і т.п.) та з 7 блоками алергенів. Блоки алергенів використовують з метою економії крові обстежуваного і складають з близьких за походженням алергенів. Так, блок квіткового пилка складався з 12 алергенів, змішаних у рівних кількостях: пилок лободи, амброзії, тимофіївки, дуба, ліщини, райграсу, кульбаби, пирію, полину, тополі, берези. Блок пилу складався з алергенів домашнього і бібліотечного пилу. Блок вовни - з алергенів вовни вівці і собаки. Блок цитрусових - з алергенів апельсина, лимона і мандарина. Блок круп - з алергенів пшениці, вівса і пшона. Блок риби - з алергенів хека, тріски і сайри. Блок м'яса з алергенів яловичини, свинини і баранини. Визначають різницю в кількості загального фосфору в дослідних і контрольній пробах. Позитивною реакцією на алерген вважають підвищення рівня загального фосфору на 0,1 мг/л у порівнянні з контролем при точності визначення 0,01 мг/л. Така різниця є тим гарантованим порогом, який дозволяє виявити навіть слабку алергічну реакцію Як контроль приймають рівень загального фосфору в пробі крові обстежуваного, підданій аналогічній обробці, але без додавання алергенів. Отже, в якості показника алергічного ушкодження клітин крові використано рівень загального фосфору в пробі. Обгрунтуванням цього може бути та обставина, що вміст фосфору в клітинах крові в 3-5 разів вищий, ніж вміст калію. Фосфор знаходиться в складі нуклеїнових кислот, фосфоліпідів, макроергічних сполук (АТФ, креатинфосфат). Метод визначення фосфору є досить чутливим - не менш ніж 0,01 мг/л при вмісті в плазмі крові 10-100мг/л. Крім того, розпад фосфорних сполук починається ще до повного руйнування клітин. Алергічна реакція призводить до ушкодження перш за все мембран клітин, до складу яких входять фосфоліпіди. При цьому у плазму крові надходять фосфорні сполуки, а сама клітина не обов'язково руйнується, тому що мембрана клітини здатна відновлюватися. Це значно підвищує чутливість способу. Приклад конкретного втілення 1 Хвора І. звернулася зі скаргами на висипання і сверблячку шкіри. Обстежена в алерголога: шкірні проби позитивні на алергени побутового і бібліотечного пилу, вовни вівці; слабопозитивні на алерген пилка. Проведено лабораторне обстеження: тести з алергенами ППН і ППН із калієм були негативні; РБТЛ з алергеном побутового пилу на 0,5% вище контролю. Тест на загальний фосфор за запропонованою методикою був позитивним на алергени пилка, пилу, вовни, пера. Одержані наступні результати реакції на алергени (в мг/л): контроль - 417; пилок (12 алергенів) - 552; пил (2 алергени) - 630; вовна (2 алергени) - 420; перо - 675; волосся людини - 209; 9383 крупа (3 алергени) - 281; риба (3 алергени) - 338; молоко коров'яче - 234; яйце куряче - 202; м'ясо (З алергени) - 190. З приведених результатів видно, що максимальна реакція відзначалася на алерген пера. З огляду на полівалентну сенсибілізацію хворої було проведено неспецифічну гіпосенсибілізацію з позитивним ефектом. Отже, запропонований спосіб виявив більше алергенів, більш безпечним для хворої способом, і дозволив кількісно порівняти реакцію на різні алергени. Конкретний приклад втілення 2 Хвора Г. звернулася зі скаргами на приступи задухи, хворіє бронхіальною астмою 2 роки. Лабораторне обстеження: запропонованим способом виявлена сенсибілізація до алергенів пилка, пилу, вовни, волоса, яйця, молока і м'яса, причому максимальна реакція - на алерген вовни. Одержані наступні результати реакції на алергени (в мг/л): контроль - 221; пилок (12 алергенів) -642; пил (2 алергени) - 636; вовна (2 алергени) - 648; перо - 190; волосся людини - 623; крупа (З алергени) - 161; риба (3 алергени) - 183; молоко коров'яче - 315; яйце куряче - 353; м'ясо (З алергени) 580. Через полівалентну сенсибілізацію подальше уточнення конкретних алергенів у блоках не проводилося. За допомогою інших лабораторних тестів додаткової інформації Комп'ютерна верстка М. Клюкін отримано не було: Спосіб ППН із калієм дав слабку реакцію тільки на алерген пилу (12,4%). Отже, запропонований спосіб виявив набагато більше алергенів, тобто був більш інформативним, і дозволив кількісно порівняти реакцію на різні алергени. За період з 2002-2004 pp. запропонований спосіб діагностики алергічної реакції було апробовано в Науково-дослідному центрі фітотерапії в м. Херсоні з позитивними результатами. Спосіб виявляв набагато більше алергенів, ніж відомі способи, тобто був більш інформативним, дозволяв кількісно порівняти реакцію на різні алергени та був досить простим у виконанні. Література: 1. Новіков Д.К., "Довідник по клінічній імунології і алергології", Мінськ, Білорусь, 1987, стор. 163. 2. Фрадкін В.А., "Алергодіагностика in vitro", M., Медицина, 1975, стор. 27. 3. Фрадкін В.А., "Алергодіагностика in vitro", M., Медицина, 1975, стор. 83. 4. Морозов В.Л., Адамбеков Д.А., Альджамбаєва И.Ш., Сокуренко Л.С., "Спосіб визначення алергічної альтерації лейкоцитів", Лабораторна справа, 1989, №5, стор. 68-70. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул. Глазунова, 1, м. Київ - 4 2 , 01601