Спосіб діагностики прихованих форм сифілісу

Спосіб діагностики прихованих форм сифілісу, що включає визначення в пробі сироватки крові показників стану імунної системи, який відрізняється тим, що як показники стану імунної системи визначають білкові фракції, а саме цитокіни ІЛ-1(3, ІЛ-6, ІФН-у, ФНП-а, одержані значення порівнюють з нормою і, якщо рівень ІЛ-1(3 підвищився в 10 разів та більше, рівень ІЛ-1Р знизився менш ніж в 1,5 рази, рівень ІФН-у підвищився менш ніж в 1,5 рази, а рівень ФНП-а підвищився більше ніж в 15 разів, реєструють сифіліс прихований ранній, а якщо підвищення рівня ІЛ-1Р реєструється більш ніж в 150 разів, рівень ІЛ-6 знижено більш ніж в 1,5 рази, рівень ІФН-у підвищився більш ніж в 1,5 рази, а рівень ФНП-а підвищився більш ніж в 100 разів та вище, то встановлюють діагноз прихований пізній сифіліс. Корисна модель відноситься до медицини, а саме до дерматовенерології, та може бути використаною для точного визначення прихованих форм сифілісу. Традиційно методи діагностики сифілісу поділяють на прямі, що спрямовані на виявлення збудника чи його антигенів, та непрямі - серологічні тести для визначення обстежуваних осіб антитіл, специфічних до трепонем. Для візуалізації трепонем і до сьогоднішнього дня використовують мікроскопію в темному полі зору клінічних зразків, що можуть містити трепонеми. Ідентифікацію збудника сифілісу проводять за характерними для нього морфологічним ознакам та рухливості, оскільки такий метод прийнятий для усіх видів "блідих" мікроорганізмів, що слабо заломлюють світло. [Дмитриев Г.А., Брагина Е.Е. Современные методы лабораторной диагностики сифилиса. Часть 1 // Вестник дерматовенерологии. -1996. - №2. - с.60-62]. Однак відсутність трепонем не виключає наявність сифілісу, і не завжди можна отримати матеріал для таких досліджень, особливо у випадках прихованого сифілісу, або попереднього лікування пацієнта [Gens M., Ledger W. Syphilis in pregnancy. // Sexually Transmitted Infection. - 2000. - V. 76, N 2. - P.73-79]. Сучасним досягненням при виявленні інфекційного агента є використання методу полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), суть якого полягає в багаторазовому збільшенні (ампліфікації) кількості специфічних послідовностей ДНК мікроорганізму в присутності посередників синтезу ДНКнуклеотидів, термостабільного ферменту ДНКполімерази та праймерів - невеликих синтетичних фрагментів спіральної ДНК завдовжки 20-30 нуклеотидів, що спрямовані на синтез високо консервативних послідовностей ДНК бактерій [Коляденко В.Г., Степаненко В.И., Мавров И.И. Лабораторная диагностика заболеваний, передающихся половым путем, методом полимеразной цепной реакции. Метод, рекоменд. - К., 1999. - 18с]. ПЛРдіагностика застосовується для лабораторної діагностики усіх форм сифілісу, включаючи прихований сифіліс. Однак, якщо частота виявлення нуклеїнових кислот Т. pallidum у плазмі крові при первинному і вторинному сифілісі складає 95% і 79% відповідно, то для раннього прихованого сифілісу частота виявлення склала лише 20%. А при пізньому схованому сифілісі ДНК і РНК T.pallidum у плазмі крові взагалі не виявляються. Крім того пряме визначення трепонем не завжди доступне в лабораторній практиці. Інший тип серологічних досліджень - специфічні (трепонемні) тести, що дозволяють виявляти антитіла, специфічні саме до Т. pallidum. До таких реакцій належать реакція зв'язування комплементу (РЗК) із трепонемним антигеном, реакція іммобілізації блідих трепонем (РІБТ, або PIT), реакція гемаглютинації, реакція непрямої імунофлюорес Ю СО ST 9395 ценції (РІФ), імуноблотинг та імуноферментний аналіз [Уніфікація лабораторних методів дослідження в діагностиці захворювань, що передаються статевим шляхом / Укладачі 1.1. Мавров, О.П. Белозоров, Л.С. Тацька та ін. - X.: Факт, 2000. 120с] Для діагностики сифілісу широко використовуються серологічні дослідження. Серед методів даного напрямку виділені неспецифічні (нетрепонемні) реакції, що, як правило, використовують при скринінгових дослідженнях і специфічні (трепонемні), та які необхідні для підтвердження результатів попередніх тестів. У якості скринінгових неспецифічних тестів використовують реакцію зв'язування комплементу (РЗК) і реакцію мікропреципітації (МР) у якісному і кількісному варіантах, що створюють так називаний комплекс серологічних реакцій [Тацкая Л.С. Серологическая диагностика сифилиса в Украине: тенденции и перспектива развития // Журн. дерматол, и венерол. - 2000. - №1(9). - с.63-65]. РЗК та МР характеризуються недостатньою чутливістю (особливо на початкових стадіях сифілісу), необхідністю індивідуального зчитування результатів кожного дослідження мікроскопічно або візуально, що призводить до суб'єктивного оцінювання, а також значній кількості хибнопозитивних результатів. Причиною останнього є неспецифічна перехресна реактивність кардіоліпіна з ДНК, обумовлена полімерною структурою і сильним зарядом молекул ДНК і можливістю їхнього зв'язування з різними компонентами нормальної сироватки і так званий синдром фосфоліпідних антитіл - аутоіммунний процес, коли створюються антитіла до власних фосфоліпідів [Мавров Г.И., Бондаренко Г.М., Мамедли М.М. Современные особенности сифилиса: лабораторная диагностика в новых условиях. // Журнал дерматологии и венерологии. - 1998. - №2. - с.812]. В основі реакції іммобілізації трепонем (PIT) полягає виявлення зниження рухливості блідих трепонем під впливом сироватки крові хворих на сифіліс. Оскільки за антиген у реакції беруть завись блідих трепонем, отриманих з тканин при сифілітичному орбіті кролів, то специфічність тесту дуже висока, однак саме через труднощі приготування препарату PIT витіснена реакцією непрямої імунофлюоресценції [Уніфікація лабораторних методів дослідження в діагностиці захворювань, що передаються статевим шляхом / Укладачі 1.1. Мавров, О.П. Белозоров, Л.С. Тацька та ін. - X.: Факт, 2000.-120 с ] . Принцип методу РІФ состоїть у використанні люмінесцентного варіанту реакції антиген-антитіло для серодіагностики сифілісу. Антиген з патогенних блідих трепонем поєднується з протитрепонемними антитілами сироватки крові хворого на сифіліс, які, в свою чергу, поєднуються з антитілами люмінесцентної сироватки тварин, імунізованих проти глобулінів людини. Недоліком РІФ є необхідність індивідуального зчитування кожного результату, технічна складність, що обумовлює обмеження використання. Сифіліс діагностують також методом імуноблотингу. В імуноблоті зі зразками сироваток, а по тім з кон'югатом інкубують нітроцелюлозні стрічки, які є антигенними репліками електрофореграми лізату T.pallidum. Результатом аналізу є зафарбування окремих плям (смуг), що відповідають імуногенам з певною молекулярною масою. Для методів РІФ, імуноблотингу та деяких інших специфічних тестів характерним є можливість реєстрації явища пролонгованої персистенції серопозитивності протягом тривалого часу що спостерігаються в деяких осіб, навіть після повноцінної терапії [Пономаренко Н.М., Спивак М.Я. Сучасні методи лабораторної діагностики сифілісу // Імунологія та алергологія. - 2004. - №2. - с.8-12]. Найбільш перспективним напрямком в діагностиці сифілісу є метод імуноферментного аналізу (ІФА), який дозволяє аналізувати в зразках сироваток рівень антитіл визначеного класу до T.pallidum або до окремих антигенів, які у свою чергу одержують за допомогою дезінтеграції клітин трепонем, генно-інженерними способами і хімічним синтезом. В основу методу ІФА покладена властивість сироваткових антитіл утворювати комплекс з антигеном, сорбованим на твердій фазі (стінки лунок полі стиролового планшету) і каталітичні властивості ферментів, які є складовою частиною кон'югату, що зв'язує утворений комплекс. При внесенні розчину проявника в лунки розвивається ферментативна реакція, за якої інтенсивність забарвлення прямо пропорційна кількості специфічних антитіл зв'язаних зі зразка дослідженої сироватки. У конкурентному ІФА в реакційній суміші відбувається змагання за місця зв'язування з антигеном між специфічними антитілами, які містяться в зразку сироватки, та людськими глобулінами, що присутні в кон'югаті. У цьому випадку інтенсивність забарвлення, виражена величиною оптичної густини, обернено пропорційна позитивності результату. ІФА типу захоплення використовують головним чином для аналізу в зразках сироваток рівню трепонемоспецифічних імуноглобулінів. До складу імуносорбенту входять антитіла, специфічні до даного класу імуноглобулінів людини, та кон'югат трепонемних антигенів з ферментом. Для діагностики ранніх і прихованих форм сифілісу, а також для диференціювання помилкових-позитивних реакцій на сифіліс використовують метод ІФА для визначення антитіл Ig M і Ід G, що дозволяють виявляти захворювання на ранніх стадіях і попереджати помилкову діагностику сифілітичної інфекції, що протікає латентно [Тацкая Л.С. Использование фракций иммуноглобулинов классов М и G у лиц с ложной позитивностью серореакций на сифилис // Журнал дерматовенерологии и косметологии им. Н.А. Торсуева. - 2004. -№1 -2(8).-с. 179-180]. Метод ІФА, заснований на визначенні антитіл імуноглобулінів, є найбільш близьким до того, що заявляється, по технічній дії та результату, який може бути досягнений, тому його обрано в якості прототипу. На сьогоднішній день він є найбільш точним способом діагностики прихованих форм сифілісу. Основним недоліком прототипу є його недостатня точність, яка обумовлена неадекватною реакцією імунної системи на сифілітичну інфекцію. 9395 Показники чутливості Ig M, Ig G - ІФА варіюють і складають 78-93% при первинному, 51-85% при вторинному і 24,3-64% при ранньому прихованому сифілісі, що може бути обумовлено індивідуальними особливостями експресії Ig M і Ід G у пацієнтів з різним імунним статусом на різних стадіях сифілітичної інфекції У зв'язку вищевикладеним в основу корисної моделі покладено підвищення точності діагностики прихованих форм сифілісу Задача, яка поставлена в основу корисної моделі, вирішують тим, що у способі діагностики прихованих форм сифілісу, що включає визначення в пробі сироватки крові показників стану імунної системи, згідно з корисною моделлю, в якості таких показників в крові визначають фракції білка, а саме цитокіни ІЛ- 1р, ІЛ-6, ІФН у, ФНП- а , порівнюють одержані значення з нормою, і якщо у порівнянні до норми рівень ІЛ- "/ підвищився в 10 ІЗ разів та більше, рівень ІЛ-6 знизився менш ніж в 1,5 рази, рівень ІФН у підвищився менш ніж в 1,5 рази, а рівень ФНП а підвищився більше ніж в 15 разів, то реєструється сифіліс прихований ранній, а якщо підвищення рівня ІЛ ір реєструється більше ніж в 150 разів, рівень ІЛ-6 знижено більш ніж в 1,5 рази, рівень ІФН - у підвищився більше, ніж в 1,5 рази, а рівень ФНП а підвищився більше ніж в 100 разів та вище, встановлюється діагноз прихований ПІЗНІЙ сифіліс Технічний результат корисної моделі полягає в тому, що підвищується точність за рахунок того, що розроблений лабораторний критерій являється специфічним для прихованого сифілісу за рахунок його КІЛЬКІСНИХ значень, які одержані експериментальним шляхом Для визначення цих КІЛЬКІСНИХ значень порівнювались достовірна КІЛЬКІСТЬ ЦИТОКІНІВ в сиро ватці крові хворих на приховані форми сифілісу (прихований ранній та прихований ПІЗНІЙ) З сироватками крові хворих на активні форми сифілісу (первинний, вторинний, вторинний рецидивний) та сироватками здорових осіб Це порівняння дало змогу визначити достовірні ВІДМІНИ рівня ЦИТОКІНІВ ІЛ 1р, ІЛ-6, ІФН- у, ФНП- а Спосіб виконувався наступним чином При надходженні хворого до стаціонару, в якого відсутні КЛІНІЧНІ прояви сифілісу, його обстеження включає діагностичні серологічні методи дослідження - МРП, РВ, РІФ Визначені титри серологічних реакцій трактують як серологічні коливання, також, або мова йде про приховані форми сифілісу, та треба відрізнити ранню форму від пізньої Методом ІФА визначають вміст М, G Для уточнення діагнозу, щоб відрізнити імунологічні коливання від справжнього сифілісу, ранню від пізньої форми прихованого сифілісу, та призначити адекватну терапію досліджують вміст ЦИТОКІНІВ Комп'ютерна верстка В Мацело 6 ІЛ - 1р, ІЛ-6, ІФН - у, ФНП - а в сироватці крові методом ІФА По отриманих даних, згідно з вмістом ЦИТОКІНІВ у порівнянні до норми, можна точно встановити діагноз Якщо рівень ІЛ 13 ( підвищився в 10 разів та більше, рівень ІЛ-6 знизився менш ніж в 1,5 рази, рівень ІФН у підвищився менш ніж в 1,5 рази, а рівень ФНП а підвищився більше ніж в 15 разів, то реєструється сифіліс прихований ранній, а якщо підвищення рівня ІЛ- 1Р реєструється більше ніж в 150 разів, рівень ІЛ-6 знижено більш ніж в 1,5 рази, рівень ІФН у підвищився більше, ніж в 1,5 рази, а рівень ФНП- а підвищився більше ніж в 100 разів та вище, встановлюється діагноз прихований ПІЗНІЙ сифіліс Ефективність способу ілюструє наступний приклад його КЛІНІЧНОГО використання Приклад Хворий Н , 1973р, направлений на госпіталізацію до стаціонару Скарг не пред'являє Пацієнта виявлено при проведенні профілактичного медичного обстеження при працевлаштуванні Обстеження в ШВД за місцем проживання МРП - слабо-позитивна, РВ - негативна Обстеження через 10 днів МРП - слабопозитивна, РВ слабо-позитивна, РІФ - слабо-позитивна Повторне обстеження через 2 тижня МРП - слабопозитивна, РВ - негативна Діагноз Серологічні коливання9 Прихований сифіліс9 Появлення висипів на шкірі та слизових оболонках протягом кількох МІСЯЦІВ не відзначав Протягом року хворів на ангіну та бронхіт, вслід чого приймав антибіотики На хвороби, що передаються статевим шляхом протягом кількох років не обстежувався Біля ДВОХ років назад, точніше - не пам'ятає, мав випадковий статевий контакт (даних про партнера не має) При об'єктивному огляді шкірні покрови та слизові оболонки ВІЛЬНІ ВІД специфічних висипів Серцево-судинна, нервова, лімфатична та ІНШІ системи в нормі Результати лабораторних досліджень МРП слабо-позитивна, РВ - слабопозитивна, РІФ - слабо-позитивна ІдМ-0,37г/л (норма - 0,63г/л), IgG12,7г/л (норма - 9,27г/л) КЛІНІЧНИЙ, біохімічний аналізи крові - в нормі 9 Діагноз сифіліс прихований ранній Сифіліс прихований ПІЗНІЙ 9 Додатково призначено визначення вмісту ЦИТОКІНІВ ІЛ - 1р, ІЛ-6, ІФН - у, ФНП а в сироватці крові Результати обстеження ІЛ ір - 422,1 пкг/мл -перевищує норму майже в 150 разів, ІЛ-6 - 40,1 пкг/мл - нижче норми в 1,6 рази, ІФН- у - 158,7 пкг/мл - перевищує норму в 1,7 рази, ФНП а 543,4 пкг/мл - вище норми в 133 рази Діагноз, сифіліс прихований ПІЗНІЙ. Підписне Тираж 26 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул Урицького, 45, м Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут промислової власності , вул Глазунова, 1, м Київ - 4 2 , 01601