Композиція для визначення білка в біологічних рідинах

Композиція для визначення білка в біологічних рідинах, яка включає барвник пірогалоловий червоний та робочий розчин, яка відрізняється тим, що робочий розчин містить комплекс органічних кислот, при такому співвідношенні компонентів, мас. ч.: пірогалоловий червоний 0,02±0,01 метиловий спирт 0,06±0,01 натрію молібдат 0,03±0,01 бурштинова кислота 3,84±0,20 бензойна кислота 0,43±0,10 щавлева кислота 0,13±0,03 вода до 1 л розчину. (19) (21) a200912181 (22) 26.11.2009 (24) 11.04.2011 (46) 11.04.2011, Бюл.№ 7, 2011 р. (72) КОНДАКОВА ЛЮДМИЛА ВОЛОДИМИРІВНА, ТЬОРТИХ ВАЛЕНТИН АНТОЛІЙОВИЧ, ЯНИШПОЛЬСЬКИЙ ВІКТОР ВАСИЛЬОВИЧ, КЛІЩАР ІРИНА ВАСИЛІВНА (73) ІНСТИТУТ ХІМІЇ ПОВЕРХНІ ІМ. О.О. ЧУЙКА НАН УКРАЇНИ (56) Ким Ю.В., Потехин О.Е., Токар М.И., Шибанов А.Н. Что мы измеряем в моче сульфосалициловым методом? //Лабораторная медицина. - 2003. № 6. С. 94-98. 3 трихлороцтовою кислотою, аналіз триває 1 годину, не дозволяє визначити вміст білка в інших біологічних рідинах. Відома, вибрана як прототип, композиція на основі пірогаллолового червоного для визначення білка в сечі [2]. Ця композиція містить сукцинатний буфер (бурштинова кислота та NaOH), який забезпечує перебіг реакції в кислому середовищі при стабільному значенні рН. До недоліків цієї композиції відноситься те, що реакційну суміш потрібно готувати безпосередньо перед дослідженнями, необхідно використовувати детергенти для стабілізації реакційної суміші, а використання малого об'єму зразка для аналізу може вносити помилки в результати аналізу. В основу винаходу поставлене завдання розробити композицію, яка є універсальною для визначення загального білка в різних біологічних рідинах, усуває попереднє концентрування білка, підвищує чутливість аналізу. Поставлене завдання вирішується тим, що композиція для визначення білка в біологічних рідинах включає барвник пірогаллоловий червоний та робочий розчин. Згідно з винаходом, робочий розчин містить комплекс органічних кислот при такому співвідношенні компонентів, мас. ч.: Пірогаллоловий червоний 0,02±0,01 метиловий спирт 0,06±0,01 натрію молібдат 0,03±0,01 бурштинова кислота 3,84±0,20 бензойна кислота 0,43±0,10 щавлева кислота 0,13±0,03 вода - до 1 л розчину На основі пірогаллолового червоного створена композиція, придатна для визначення загального вмісту білків у мікрокількостях біологічних рідин. Визначення вмісту білка у різних біологічних рідинах засновано на реакції, що перебігає у кислому середовищі при стабільному значенні рН. Заявлений комплекс органічних кислот у водному розчині забезпечує підтримання визначеної кислотності (рН -2,6), яка не змінюється при додаванні значної кількості 6М розчину NaOH. При визначенні молібдат натрію і барвник пірогаллоловий червоний утворюють комплекс із молекулою білка. Молекули барвника у вільному стані не поглинають світло при довжині хвилі 600 нм, а утворюючи комплекс з білком поглинають в цій області спектра, причому зміна оптичної густини реакційної суміші при довжині хвилі 600 нм чітко корелює із концентрацією білка в дослідному зразку. Спорідненість пірогаллолового червоного до різних фракцій білка однакова, тому метод визначення білка на основі заявленої, композиції дозволяє вимірювати загальний вміст білка, що знаходиться у зразку. Заявлена композиція містить компоненти при оптимальному співвідношенні. Збільшення кількості компонентів робочого розчину понад оптимальну призводить до зменшення їх розчинності і до збільшення вартості аналізу, а зменшення - до зниження чутливості методу визначення білка в біологічній пробі. Із застосуванням розробленої композиції запропоновано тест-системи «Мікротест-білок» для визначення концентрації загального білка, які до 94165 4 зволяють визначати вміст білка в сечі, крові та спинномозковій рідині в діапазоні концентрацій 0,15-1.0 г/л з точністю ± 5 %. Час проведення одного аналізу - до 15 хвилин. «Мікротест-білок» забезпечує простий спосіб визначення білків (альбумінів, глобулінів, білку Бенс-Джонса) з використанням мікролітрових кількостей зразків сечі, крові або спинномозкової рідини. В присутності білка червоний колір розчину «Мікротест-білок» змінюється на синьофіолетовий з максимумом поглинання біля 600 нм. Реєстрація цієї зміни кольору за допомогою спектрофотометра чи фотоелектроколориметра дозволяє проводити кількісне визначення білка. Вимірювання поглинання світла можна проводити і при 590 нм. Суть винаходу пояснюється прикладом виконання. Приклад. В мірній колбі на 1 л в 600 мл дистильованої води (при температурі приміщення) розчиняють такі реактиви: 0,03 г натрію молібдату, 3,84 г бурштинової кислоти, 0,13 г щавлевої кислоти, 0,43 г бензойної кислоти. 0,02 г індикатора пірогаллолового червоного розчиняють в 0,06 г метанолу, потім додають 8 мл дистильованої води. Змішують приготовлені розчини в мірній колбі та доводять об'єм дистильованою водою до 1 л. Приготовлений таким чином розчин «Мікротест-білок» є повністю готовою до використання рідиною та не потребує розведень чи інших підготовчих операцій. Стандартні розчини білків для побудови калібрувальних графіків готують в залежності від потреб. Хід визначення. При температурі середовища (20±5) °С, атмосферному тиску 84,0-106,7 кПа (600,0-800,7 мм рт. ст.), відносній вологості 30-80 % у пробірку вносять зразки сечі, спинномозкової рідини чи крові в кількості 200 мкл. Для контролю використовують дистильовану воду. Доливають в кожну пробірку по 5 мл розчину «Мікротест-білок» і перемішують. Реакційну суміш залишають при температурі приміщення і через 10-15 хвилин вимірюють поглинання зразків на спектрофотометрі при довжині хвилі 600 нм. Концентрацію білка у невідомому зразку можна визначити, знаходячи поглинання зразка на стандартному графіку і зчитуючи відповідну концентрацію білка, або можна розрахувати за допомогою наступної формули: концентрація білка (г/л) = поглинання зразка/поглинання стандартного розчину x концентрація стандартного розчину (г/л). Побудова калібрувального графіка для визначення білка за допомогою розчину «Мікротестбілок». Реактиви: 1. Альбумін бичачий, ДФУ 100, Перше видання. 2. Альбуміну людського розчин, ДФУ 1002400, Перше видання. 3. Вода дистильована, ДФУ 1095504, Перше видання. 4. «Мікротест-білок». 5. Хлористий натрій. 5 94165 6 Побудова калібрувального графіка: 1. Приготувати 0,9 %-ний розчин хлористого натрію. 2. Приготувати початковий розчин білка (альбумін людський або альбумін бичачий) концентра цією 1,5 мг/мл в дистильованій воді або в 0,9 %ному хлористому натрію. 3. Зробити ряд розведень одержаного розчину за табл. 1. До 5 мл розчину «Мікротест-білок» додати 200 мкл отриманих розчинів. Для контролю - 200 мкл дистильованої води. Перемішати, витримати при температурі приміщення 10-15 хвилин і провести вимірювання. У табл. 2 наведені основні характеристики методу визначення білка на основі заявленої композиції у порівнянні з прототипом. Як видно із табл. 2, запропонована композиція має великі переваги, у порівнянні з прототипом. Вона не потребує попереднього концентрування білка, чутливість способу у декілька разів вища, ніж у прототипу, що дозволяє визначати білки у мікрокількостях зразка (200 мкл). Крім того, відому композицію необхідно готувати безпосередньо перед дослідженням, а термін зберігання запропонованої композиції близько року, що скорочує час аналізу. Запропонована композиція є універсальною та дозволяє визначити наявність та вміст білка у різ них біологічних рідинах: крові, сечі, спинномозковій рідині тощо. Таким чином, здійснення заявленого винаходу дозволяє одержати необхідний технічний результат. Джерела інформації 1. Лабораторные методы исследования в клинике / Под ред. В. В. Меньшикова. - М.: Медицина, 1987. - 368 с. 2. Ким Ю.В., Потехин О.Е., Токар М.И., Шибанов А.Н. Что мы измеряем в моче сульфосалициловым методом? //Лабораторная медицина. 2003. - №6. С. 94-98. 7 Комп’ютерна верстка І. Скворцова 94165 8 Підписне Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601