Спосіб визначення концентрації циркулюючих імунних комплексів в біологічних рідинах

Спосіб визначення концентрацій циркулюючих імунних комплексів в біологічних рідинах методом імуноферментного твердофазного C1q-зв'язуван 34136 В основу винаходу поставлено задачу удосконалення твердофазного методу визначення циркулюючих імунних комплексів по C1q-зв'-язуванню, зниження неспецифічного фону і підвищення чутливості шляхом вибіркової інгибіції реакції кон’югату з твердофазним C1q без впливу на реакцію C1q-імунні комплекси. Задача, яку покладено в основу винаходу, вирішується тим, що у відомому способі визначення концентрації циркулюючих імунних комплексів в біологічних рідинах методом імуноферментного твердофазного C1q-зв'язування, що включає фіксацію C1q на твердій фазі, зв'язування імунних комплексів з C1q, фіксованим на твердий фазі, відмивання речовин, що не зв'язались, обробку розчином кон'югату фермент-антитіла проти імуноглобулінів, відмивання, інкубацію з субстратнобуферною сумішшю і реєстрацію результатів реакції, згідно з винаходом, інкубацію з кон'югатом антитіло-фермент проводять в середовищі з високою іонною силою, яка перевищує в 3,5-10 разів показники сироватки. За основу рішення було взято виявлену нами властивість реакції між імунними комплексами і Clq, фіксованим на поверхні полістиролового планшету. Вона полягає в швидкому формуванні після взаємодії досить прочних зв'язків імунних комплексів з твердою фазою, які не чутливі до дисоціюючої дії розчинів з високою іонною силою. Таким чином, проведення реакції C1q-імунні комплекси в середовищі з високою іонною силою пригнічує реакцію зв'язування імунних комплексів і високомолекулярних кон'югатів антитіло-фермент з C1q, але не впливає на долю вже зв'язаних з твердою фазою імунних комплексів і не викликає їх переходу в розчин. Виходячи з отриманих результатів, для досягнення поставленої задачі іонну силу розчину, в якому проводиться друга стадія методу - взаємодія кон'югату з фіксованими на твердій фазі імунними комплексами, було підвищено в декілька разів. Як показали перевірочні експерименти, помітне зменшення небажаної взаємодії твердофазного C1q з кон'югатом виявляється при підвищенні іонної сили вже в 3,5 рази. Показники взаємодії суттєво не змінюються при підвищенні іонної сили в 10 разів. Не було при цьому помічено також небажаного звільнення імунних комплексів, що зв'язались з твердою фазою на попередньому етапі реакції. При дальшому підвищенні іонної сили розчину результати реакції дещо зменшуються. На основі отриманих результатів було визначено діапазон підвищення іонної сили розчину порівняно з сироваткою на другій стадію методу - в 3,5-10 разів. Найбільш придатним засобом підвищення іонної сили розчину можна вважати підвищення концентрації хлориду натрію відповідно в 3,5-10 раз порівняно з фізіологічним розчином. Спосіб здійснюється так. Проводиться: 1) Фіксація C1q на твердій фазі - поверхні лунок пластикових планшетів. 2) Інкубація розчиненої в 40 разів сироватки в лунках планшету. 3) Відмивання лунок від сироватки. 4) Інкубація в лунках кон'югату антитіло-фермент в розчині хлориду натрію з іонної силою, що перевищує іонну силу фізіологічного розчину в 3,5-10 разів. 5) Відмивання лунок від кон'югату. 6) Інкубація в лунках субстратно-буферної суміші. 7) Визначення оптичної густини розчину в лунках і підрахування результатів. Приклад 1. (Здійснення способу). Здійснювали визначення циркулюючих імунних комплексів в сироватці, як стандарт використовували агрегований IgG людини. Проводили: 1) Фіксацію C1q на твердій фазі - поверхні лунок пластикових планшетів. 2) Інкубацію розчиненої в 40 разів сироватки в лунках планшету. 3) Відмивали лунки від сироватки. 4) Розчинювали кон’югат антитіло-пероксидаза в 0,6 М хлориді натрію із 0,01 М фосфатним буфером з рН 7,2, проводили його інкубацію в лунках планшету. 5) Відмивали планшет від кон'югату. 6) Вносили в лунки субстратно-буферну суміш. 7) Після інкубації визначали оптичну густину розчину в лунках і підраховували результатів. Порівняно зі стандартним методом отримано зниження рівня фону з 0,320 до 0,143 і підвищення чутливості визначення з 7 мкг/мл до 1,5 мкг/мл. __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2001 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 50 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 2