Спосіб визначення концентрації окремих класів імуноглобулінів у біологічних рідинах

1 Спосіб визначення концентрації окремих класів імуноглобулінів у біологічних рідинах шляхом проведення реакції "антиген-антитіло" в присутності стабілізатора - комплексу розчину поліетиленгліколю мол м 6000, який відрізняється тим, що біологічну рідину розводять фізіологічним розчином, реакцію "антиген-антитіло" проводять безпосередньо в лунках планшета, використовуючи 3% розчин поліетиленгліколю, концентрацію окремих класів імуноглобулінів визначають вимірюванням інтенсивності помутніння в планшетах при екстинцм 600 нм, а розрахунки концентрації імуноглобулінів здійснюють за калібрувальними графіками 2 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що біологічну рідину для визначення імуноглобулінів класу IgG розводять в 10 разів і калібрувальні графіки будують за допомогою стандартних розчинів з концентрацією імуноглобулінів від 0 до 2 мг/мл 3 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що біологічну рідину для визначення імуноглобулінів класу ІдА розводять в 5 разів і калібрувальні графіки будують за допомогою стандартних розчинів з концентрацією імуноглобулінів від 0 до 1,2мг/мл О Винахід відноситься до біологи, зокрема, імунологи, у тому числі до ветеринарної імунологи, а саме до способів визначення концентрації окремих класів імуноглобулінів у біологічних рідинах і може застосовуватись в імунологічних дослідженнях у галузі медицини і ветеринарної медицини в медичних та ветеринарних лабораторіях для виявлення специфічного зв'язку антиген-антитіло Заявлений винахід спрямований на спрощення відомого методу та підвищення його точності Відомий метод радіальної імунодифузп визначення концентрації імуноглобулінів за Манчіні (Mancmi G , Carbonaru А О , Heremans J F Immunochemical quantitation of antigen by single radial immunodiffusion // Immunochemistry -1965 -V 2, №2 -P 235-254), який передбачає використання моноспецифічних антисироваток і еталону з відомим вмістом антигена Розчин антигена поміщають в лунки вирізані рядами в пластині геля, куди попередньо внесена відповідна моноспецифічна антисироватка Антиген дифундує в гель і взаємодіючи із специфічними антитілами формує кільця преципітації, діаметр яких залежить від концентрації антигена в лунках За діаметром преципітатів з допомогою калібровочної кривої визначають концентрацію імуноглобулінів у дослідних рідинах Недоліком цього методу є те, що він потребує попередньої підготовки пластин з гелем, використовується для великої КІЛЬКОСТІ проб (біля 25-50), довготривалий (48-72 год), а результати не завжди стабільні Відомий також імуноферментний метод ELISA для КІЛЬКІСНОГО визначення клас-специфічних антитіл, в основі якого лежить реакція антигенантитіло Для проведення реакції використовується фермент - пероксидаза з хрону (Ю Н Федоров, ТА Феоктистова, С О Кадыров и др Количественное определение иммуноглобулина G в сыворотке крови свиней иммуноферментным методом //Бюл ВИЭВ -1985 -Вып 58 - С 36-38) Недоліком цього методу є довготривала підготовка і інкубація проб Відомий метод визначення імунних білків сироватки крові в реакції з сульфатом цинку дозволяє визначити вміст імунних глобулінів (Кондрахин И П , Курилов Н В , Малахов А Г и др Определение иммунных белков сыворотки крови по реакции помутнения с сульфатом цинка (цинк-сульфатный тест - ЦСТ) // В кн Клиническая лабораторная диагностика в ветеринарии -М -"Агропромиздат" 1 ГО О> (О 61937 -1985 -С 211-212) між антигеном та специфічними антитілами, а інтенсивність помутніння, що утворюється під час Недоліком цього методу є те, що в ньому виреакції пропорційна концентрації імуноглобулінів у значається сумарна КІЛЬКІСТЬ імуноглобулінів, а пробі і вимірюється на приладі пристосованому вміст окремих класів імуноглобулінів визначити для вимірювання екстинцм у планшетах при 600 неможливо нм, наприклад колориметричний аналізатор імуНайбільш близьким рішенням по суті до заявноферментний - КАИ-Ц-01 леного винаходу є "Способ количественного определения иммуноглобулина в сыворотке крови чеПриклад визначення концентрації ig G в крові ловека (Патент RU2008688G01 N33/536) До Юмкл розчину Ід G додають 240мкл реагенту анти-lg G Контрольна проба замість розчину Відомий спосіб включає такі ознаки СПІЛЬНІ ІЗ Ід G містить Юмкл фізрозчину Через ЗОхв вимізаявником визначення концентрації імуноглобулірюють оптичну ЩІЛЬНІСТЬ проби на приладі принів шляхом проведення реакції антиген-антитіло в стосованому для вимірювання екстинцм у планшеприсутності стабілізатора комплексу - розчину полі тах при бООнм За отриманою екстинцією з етиленгліколю молекулярною масою 6000 Відодопомогою калібрувального графіка визначають мий спосіб розрахований на визначення концентконцентрацію імуноглобулінів класу G Для побурації імуноглобулінів у сироватці крові людини дови графіка використовують стандартні розчини, Реакцію преципітації з моно специфічною анти що містять від 0 до 2мг/мл імуноглобуліну G В сироваткою проводять в присутності 0,0013 М розописаних умовах отримано лінійну залежність інчину полі етиленгліколю з молекулярною масою тенсивності помутніння від концентрації Ig G в 6000 Спосіб дозволяє підвищити швидкість реакпробі (ВІД 0 ДО 2МГ/МЛ) Приклад калібрувального ції і скоротити час інкубації графіка приведено на Фіг 1 Для визначення конНедоліком способу є те, що він не забезпечує центрації Ig G в сироватці крові, останню розвовизначення концентрації окремих класів імуноглодять фізрозчином в 10 разів булінів у крові сільськогосподарських тварин (сви ней, овець, великої рогатої худоби) та в інших біологічних рідинах організму тварин (молоко, сеча) Заявлений нами спосіб усуває недоліки прототипу і забезпечує визначення концентрації окремих класів імуноглобулінів у сироватці крові і біологічних рідинах організму людини і сільськогосподарських тварин В основі винаходу поставлено завдання розробити ефективний спосіб визначення окремих класів імуноглобулінів в біологічних рідинах організму людини і сільськогосподарських тварин, який би скоротив час визначення, був простим у виконанні і підвищив точність визначення Поставлене завдання вирішується шляхом проведення реакції безпосередньо в лунці планшета в присутності поліетиленгліколю мол м 6000, 3%-оі концентрації, який стабілізує реакцію Приклад визначення концентрації ід А в крові До Юмкл розчину Ід А додають 240мкл реагенту анти-lg А Контрольна проба замість розчину Ід А містить Юмкл фізрозчину Через бОхв вимірюють оптичну ЩІЛЬНІСТЬ проби на спектроколориметрі "Spekol" при ДОВЖИНІ хвилі бООнм у кюветі з оптичним шляхом 2см За отриманою екстинцією з допомогою калібрувального графіка визначають концентрацію імуноглобулінів класу А Для побудови графіка використовують ВІДОМІ розчини, що містять від 0 до 1,2мг/мл імуноглобуліну А Приклад калібрувального графіка приведено на Фіг 2 В описаних умовах отримано лінійну залежність інтенсивності помутніння від концентрації Ід А в пробі (ВІД 0 ДО 1,2МГ/МЛ) ДЛЯ визначення концентрації Ід А в сироватці крові, останню розводять фізрозчином в 5 разів IgG л ІдОс ТШГ 20 00 Кокдєнтращя IgG (мкг/мя) Рис 1. Калібрувальна крива для визначення вмісту IgG в крові IgGn- IgG людини IgGc- IgG свині 61937 0 50 с т й Н ц і я 035 030 025 0.20 015 0ІО 0 05 0 200 400 60 goo юоо 1200 Кондагерація EgA (мг/мя) Рис.2. Калібрувальна крива дня визначення кондентращї IgA в крові і біологічних рідинах організму. Комп'ютерна верстка А Ярославцева Підписне Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119