Штам bacillus subtilis – антагоніст фітопатогенних бактерій та грибів та біопрепарат на його основі, призначений для захисту зернобобових культур

1. Штам бактерій Bacillus subtilis, депонований у Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології 3 90181 Культивування можна проводити на середовищах - МПА, середовищі Громико, агаризованому середовищі Гаузе №2 при t 137°С. Спосіб, умови та склад середовища для довгострокового зберігання штамму. Штам зберігається на МПА, середовищі Громико, агаризованому середовищі Гаузе №2 під шаром стерильного вазелінового масла. Пересів 1 раз на рік. До унікальних особливостей штаму слід віднести його здатність проявляти антагоністичну активність щодо фітопатогенних бактерій та грибів, які викликають кореневі гнилі зернобобових культур. Приклад 1. Визначення антагоністичної активності щодо фітопатогенних бактерій. Для визначення антагоністичної активності щодо фітопатогенних бактерій по діаметру пластинок картопляного агару в чашках Петрі засівали 4 штрихами антагоніст B.subtilis ВНИИСХМ 128, а в інші чашки аналогічно B.subtilis 1401 і культивували при 28°С протягом двох днів. Потім до вирослих макроколоній бацил штрихами перпердикулярно із суспензій у фізіологічному розчині 5 108КУО/мл підсівали культури різних видів бактерій, вирощували дальше при 28°С ще три дні. За наявністю і розмірами зон відсутності росту штамів різних видів фітопатогенних батерій робили висновок про чутливість до антимікробних речовин бацил і про спектр антимікробної дії останніх. (Табл. 1). Таким чином, штам B.subtilis 1401 проявляє антагоністичну дію на бактерії родів Xantomonas, Clavibacter, Pseudomonas та Erwinia. Таблиця 1 Експертна оцінка антагоністичної активності Bacillus subtilis 1401 щодо бактеріальних тест-культур Тест-штами Xantomonas campestris 8003 b X. maltofilia X. malvacearum 6518 X. phaseoli 262 X. ampelina 10 a Pseudomonas alcaligenes 5816 P. gladioli 8573 P. lachrymans 7395 P. syringae 8511 Erwinia carotovora 8982 Clavibacter michiganense 102 Антагоністична активність штамів щодо тест-культур (зони затримки росту тест-культур) Штам-прототип Штам, що пропонується В. ubtilis ВНИИСХМ 128 В. subtilis 1401 + + + + + + + + + + + + + Приклад 2. Визначення антагоністичної активності щодо фітопатогенних грибів. Для визначення специфічної активності штама B.subtilis 1401 досліджували його антагоністичну активність відносно тест-культур фітопатогенних грибів. Дослідження проводили методом радіальних штрихів за методом Єгорова [3]. Для цього готували суспензію штама B.subtilis 1401 з титром 5 109KУO/мл. Отриманий завис висівали петлею в центр чашки Петрі з агаризованим середовищем Гаузе №2. Посіви інкубували в термостаті при 28°С протягом 72 год. До культури, яка виросла, підсівали штрихом тест-мікроорганізми (5 109КУО/мл). Чашки з тест-культурами грибів культивували при 28°С протягом 5 діб. Облік результатів проводили за величиною зон затримки росту тест-культур. Контролем росту тест-культур слугувало паралельне вирощування їх на чашках з агаризованим середовищем Гаузе №2 без культури-антагоніста. Таким чином, штам B.subtilis 1401 характеризується високою антагоністичною активністю щодо широкого спектру фітопатогенних грибів (Табл. 2). Таблиця 2 Експертна оцінка антагоністичної активності Bacillus subtilis 1401 щодо фітопатогенних грибів Тест-культури Alternaria alternata Botrytis cinerea Cladosporium sp. Fusarium solani var. arigillaceum F. gibbosum F. graminearum F. solani Зони затримки росту тест-культур, мм 22 16 16 10 9 13 12 5 90181 6 Продовження таблиці 2 F. oxysporum 53674 F. oxysporum (ячмінь) F. oxysporum (люпин) F. moniliformis v. lactis Rhizoctonia solani Thielaviopsis basicola Thrichothecium roseum Verticillium dahliae 16071 V. dahliae (бавовник) Colletortichum gloeosporioidus Приклад 3. Оцінка безпечності для теплокровних тварин. Обов'язковою умовою впровадження штамів для використання їх як основного інгредієнта в біопрепараті повинна бути його безпечність для теплокровних тварин. Для визначення безпечності штаму B.subtilis 1401 для теплокровних тварин готували робочі суспензії в фізіологічному розчині (за оптичним стандартом мутності) і вводили рекомендовані дози перорально та внутрішньоочеревинно мишам. Для кожного варіанту дослідних 10 13 11 13 12 12 21 10 14 18 зразків використовували не менше ніж 10 мишей масою 16-18г. Дослідний зразок рахується безпечним, якщо всі миші залишались живими протягом 5 діб спостереження. Таким чином, штам B.subtilis 1401 безпечний для лабораторних тварин. Введення штаму тваринам різними способами в значних дозах не викликає загибелі і не викликає патологічних змін внутрішніх органів. Результати досліджень безпечності штама B.subtilis 1401, представлені в Табл. 3. Таблиця 3 Експертна оцінка вивчення безпечності штаму Bacillus subtilis 1401 на мишах Курс вве- Доза, дення КУО/мл 1 1 5 5 1,0 2,0 1,0 2,0 109 109 109 109 1 1 5 5 1,0 2,0 1,0 2,0 109 109 109 1010 1 1 5 5 контроль 1,0мл 2,0мл 1,0мл 2,0мл 1,0мл Кількість тваЗахворіло Загинуло рин в досліді Результати дослідження вірулентності культури Внутрішньоочеревенно 10 0 0 -"10 0 0 Пероральне 10 0 0 -"10 0 0 Результати дослідження токсичності культури Внутрішньоочеревенно 10 0 0 -"10 0 0 Пероральне 10 0 0 -"10 0 0 Результати дослідження токсигенності культури Внутрішньоочеревенно 10 0 0 -"10 0 0 Пероральне 10 0 0 -"10 0 0 Внутрішньоочеревенно 10 0 0 Шлях введення Приклад 4. Процес виготовлення зразків біопрепарату на основі біомаси штамму Bacillus subtilis 1MB 5-72. Процесс складається з таких етапів: Допоміжна робота. - підготовка посуду (миття, стерилізація); - підготовка розчину для технології (0,85% хлориду натрію, наповнювача); - стерилізація посуду і матеріалів; - приготування поживних середовищ (агаризоване сусло, м'ясо-пептонний агар, середовище Громико, середовище Гаузе) і дезинфікуючих розчинів (перекис водню в суміші з миючими засоба Вижило Безпечність 10 10 10 10 Безпечний -"-"-" 10 10 10 10 -"-"-"-" 10 10 10 10 10 -"-"-"-"-" ми, хлорамін 4% розчин з активатором - 10% розчином нашатирного спирту, 70% етиловий спирт); - стерилізація поживних середовищ; - підготовка приміщень для асептичних робіт. Підготовка штаму бактерії: - розчинення ампули ліофілізованої культури Bacillus subtilis у 1мл 0,85% NaCl; - посів мікроба на поживне середовище Громико в пробірки зі скошеним агаром; - пересів на середовище Громико в чашки Петрі через 18-22год., t +37°C; - відбір типових колоній через 18-20год.; - фарбування за Грамом; 7 - відсівання культури на поживне середовище в пробірки зі скошеним агаром на 18-22год., t +37°С. 90181 8 9 Приготування маточної суміші мікроба: - змив мікроба з пробірок зі скошеним агаризованим поживним середовищем і визначення концентрації (титру); - розведення змиву мікроба 0,85% NaCl до 13млрд/мл. Отримання біомаси: - засівання мікробіологічних матраців "маточною" сумішшю мікроба; - розміщення матраців в термальну кімнату (t 37°С на 7-10 діб для вирощування спор); - контроль на мікробну чистоту; - змивання бактеріальної маси. Приготування ліофілізованого концентрату: - визначення концентрації (титру) мікроба в 1мл біомаси; - розчинення біомаси у фізіологічному розчині; - додавання наповнювача; - розливання біомаси в лабораторний посуд; - ліофільне сушіння; Комп’ютерна верстка Т. Чепелева 90181 10 - фасування ліофілізованого концентрату в придатний для його зберігання пакувальний матеріал (скляні ампули, поліетиленові мішечки, тощо). Для приготування біопрепарату для обробки посівного матеріалу або вегетативних рослин ефективну кількість ліофілізованого концентрату бактерій Bacillus subtilis 1MB В-7243 відновлюють у придатному носії. Як носій використовують розчини цукрів або інші липкогенні композиції, добре відомі спеціалісту в даній галузі техніки. Обробку посівного матеріалу та рослин здійснюють способами добре відомими з рівня техніки. Використана література: 1. Патент UA 698. А 01 №63/00. С12№1/20. Штам бактерій Bacillus subtilis для одержання препарату проти збудників захворювань бавовника. 15.12.93. Бюл.№2. 2. Бактериальные болезни растений. - Под ред. В.П.Израильского. - Изд. 3-е, перераб. и доп. М.:Колос, 1979. - 288с. 3. Егоров Н. С. Основы учения об антибиотиках. - М.: Изд-во МГУ, 1994. - 512с. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601