Спосіб вимірювання окиснювальної модифікації білків у ендотеліоцитах мікроциркуляторного русла периферійного нерва

Реферат: UA 95125 U UA 95125 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі медицини, а саме патологічної анатомії та неврології, і може бути використана для морфологічної діагностики патології периферійної нервової системи судинного ґенезу. Периферійна нейропатія - клінічний синдром, що розвивається внаслідок дії різноманітних етіологічних чинників на периферійні нерви та відрізняється неоднорідними патогенетичними механізмами. Полінейропатії займають друге місце в структурі захворювань периферійної нервової системи, після вертеброгенної патології, проте значно випереджають її по тяжкості клінічних проявів та інвалідизуючих наслідках. Причини розвитку периферійних полінейропатій різноманітні та багаточисельні, тому навіть сучасні дослідження дозволяють встановити етіологічний фактор захворювання тільки у 40-70 % хворих. Важливу роль відіграють судинні чинники розвитку полінейропатій, які пов'язані із залученням в процес vasa nervorum та об'єднують велику групу захворювань, серед яких цукровий діабет, васкулітна нейропатія при системних захворюваннях (вузликовий поліартеріїт, кріоглобулінемічний васкуліт, гранулематоз Вегенера, мікроскопічний поліангіїт). Гістоморфологічна оцінка ендотеліоцитів мікроциркуляторного русла периферійного нерва з використанням різних методик дослідження гістологічних зрізів тканини дозволяє зі значною достовірністю виявити причину ураження досліджуваного нерва. Аналогом корисної моделі є спосіб визначення карбонільних груп білків (Zusterzeel P.L.M. Protein carbonils in deciduas and placenta of preeclamptic women as markers for oxidative stress /P.L.M. Zusterzeel, H. Rutten, H.M.J. Roelofs //Placenta. - 2001. - Vol. 22-P. 213-219), в якому з метою визначення карбонільних груп білків у гістологічних препаратах проводять імуногістохімічну реакцію з динітрофенілгідразином з наступним виявленням останнього за допомогою антитіл до нього та системи пероксидазно-бензидинової візуалізації. Недоліком аналогу-способу є те, що кількість карбонільних груп може свідчити не тільки про збільшення окиснювальної модифікації білків, але і про збільшення загального вмісту білка. В той же час для оцінки збільшення окиснювальної модифікації білків насправді найбільш принципово з'ясувати співвідношення між карбонільними та аміногрупами протеїнів. Аналог цього зробити не дозволяє. Найближчим аналогом корисної моделі є спосіб вимірювання окиснювальної модифікації білків (Пат. 13712 Україна, МПК А61В 10/06. Спосіб вимірювання окиснювальної модифікації білків у структурах плаценти /Шендерюк О.П., Давиденко І.С.; Заявник Буковинський державний медичний університет. - № заяви u200509673 від 14.10.2005; опубл. 17.04.2006, бюл. № 4), який базується на фарбуванні гістологічного препарату за методикою Мікель-Кальво та проведенні візуальної оцінки білкових груп за допомогою комп'ютерної мікроспектрометрії. Недоліком найближчого аналогу є те, що він не апробований для ендотеліоцитів мікроциркуляторного русла периферійного нерва, тому може бути для них не адекватним. На відміну від аміногруп білків, характерним спектром забарвлення яких в плаценті та ендотеліоцитах периферійних нервів є синій (В); характерним спектром забарвлення карбонільних груп білків для плаценти є зелений (G), а для ендотеліоцитів - червоний (R). В основу корисної моделі поставлена задача вдосконалити спосіб вимірювання окиснювальної модифікації білків в структурах плаценти шляхом оцінки співвідношення величин червоного та синього спектрів забарвлення, для забезпечення можливості в одному гістологічному зрізі визначити співвідношення між карбонільними та аміногрупами білків та за цим співвідношенням у відносних величинах виміряти ступінь окислювальної модифікації білків, а отже, і оцінити інтенсивність утворення активних форм кисню в ендотеліоцитах мікроциркуляторного русла периферійного нерва. Спільними ознаками найближчого аналогу та корисної моделі є те, що для визначення білкових груп проводять фарбування препаратів методикою Мікель-Кальво та комп'ютерну мікроспектрометрію. Відмінними ознаками корисної моделі є те, що оцінку ступеня окиснювальної модифікації білків проводять у ендотеліоцитах мікроциркуляторного русла периферійного нерва та визначають співвідношенням величин червоного та синього спектрів забарвлення. Визначення термінів, які використовуються при описі корисної моделі: окиснювальна модифікація білків, периферійний нерв, ендотеліоцит, мікроциркуляторне русло. Теоретичні передумови здійснення способу, що заявляється. При забарвленні гістологічних зрізів тканини периферійного нерва бромфеноловим синім за методикою Мікель-Кальво карбонільним групам білків відповідає червоне забарвлення, а аміногрупам - синє забарвлення, тому шляхом встановлення математичного співвідношення між інтенсивністю забарвлення обидвома кольорами (ділянки спектра) оцінюють ступінь окиснювальної модифікації білків. 1 UA 95125 U 5 10 15 20 Спосіб здійснюється наступним чином. Шматочки тканини периферійного нерва фіксують у нейтральному забуференому формаліні впродовж 24 годин. Зневоднюють зразок тканини у висхідній батареї спиртів. Проводять його заливку у парафін. На санному мікротомі виготовляють гістологічний зріз товщиною 5 мікрометрів. Фарбують бромфеноловим синім при низькому рН (2,0) гістологічний зріз тканини периферійного нерва, після чого отримують цифрову копію мікроскопічного зображення. Потім ділянки зображення (ендотеліоцити мікроциркуляторного русла), що зацікавили дослідника, аналізують методом комп'ютерної мікроспектрометрії за допомогою системи аналізу кольору RGB, завдяки чому з роздільною здатністю у 256 градацій отримують дві конкретні величини: інтенсивність забарвлення червоного та синього кольорів. Далі, для забезпечення можливості в одному гістологічному зрізі визначити співвідношення між карбонільними та аміногрупами білків, величину інтенсивності забарвлення червоного кольору ділять на величину інтенсивності забарвлення синього кольору і, таким чином, отримують співвідношення (коефіцієнт) між цими величинами. Ця величина дозволяє встановити переважання карбонільних груп над аміногрупами, виміряти це переважання у відносних величинах та оцінити ступінь окиснювальної модифікації білків. Технічний результат. Спосіб вимірювання окиснювальної модифікації білків у ендотеліоцитах мікроциркуляторного русла периферійного нерва шляхом фарбування за методикою Мікель-Кальво та проведення візуальної оцінки білкових груп за допомогою комп'ютерної мікроспектрометрії дозволяє визначити співвідношення між карбонільними та аміногрупами білків та по цьому співвідношенню виміряти ступінь окислювальної модифікації білків у відносних величинах, а отже, і судити про інтенсивність утворення активних форм кисню в ендотеліоцитах мікроциркуляторного русла периферійного нерва. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 25 30 Спосіб вимірювання окиснювальної модифікації білків у ендотеліоцитах мікроциркуляторного русла периферійного нерва включає фарбування за методикою Мікель-Кальво та проведення візуальної оцінки білкових груп за допомогою комп'ютерної мікроспектрометрії, який відрізняється тим, що окиснювальну модифікацію білків оцінюють за співвідношенням величин червоного та синього спектрів забарвлення. Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2