Спосіб вимірювання окиснювальної модифікації білків у тканині печінки

Спосіб вимірювання окиснювальної модифікації білків у тканині печінки, що здійснюють шляхом фарбування гістологічного препарату за методикою Мікель-Кальво та проведення візуальної оцінки білкових груп за комп'ютерною мікроспектрометрією, який відрізняється тим, що окиснювальну модифікацію білків оцінюють за співвідношенням величин червоного та синього спектрів забарвлення при комп'ютерній мікроспектрометрії. (19) (21) u200810681 (22) 27.08.2008 (24) 25.12.2008 (46) 25.12.2008, Бюл.№ 24, 2008 р. (72) ДАВИДЕНКО ІГОР СВЯТОСЛАВОВИЧ, U A, ЛЕНГА ЕВЕЛІНА ЛЕОНІДІВНА, UA, МЕЩИШЕН ІВАН ФЕДОРОВИЧ, UA (73) ДАВИДЕНКО ІГОР СВЯТОСЛАВОВИЧ, U A, ЛЕНГА ЕВЕЛІНА ЛЕОНІДІВНА, UA, МЕЩИШЕН ІВАН ФЕДОРОВИЧ, UA 3 38260 нього спектрів забарвлення для забезпечення можливості в одному гістологічному зрізі визначити співвідношення між карбонільними та аміногрупами білків та за цим співвідношенням у відносних величинах виміряти ступінь окиснювальної модифікації білків, а, отже, і судити про інтенсивність утворення активних форм кисню в тканині печінки. Поставлена задача вирішується тим, що у способі вимірювання окиснювальної модифікації білків у тканині печінки шляхом фарбування гістологічного препарату за методикою Мікель-Кальво та проведення візуальної оцінки білкових груп за комп'ютерною мікроспектрометрією згідно до корисної моделі окиснювальну модифікацію білків оцінюють за співвідношенням величин червоного та синього спектрів забарвлення при комп'ютерній мікроспектрометрії. Спільними ознаками прототипу та рішення, що пропонується є те, що для визначення білкових груп проводять фарбування препаратів та комп'ютерну мікроспектрометрію. Корисна модель від прототипу відрізняється тим, що оцінку ступеня окислювальної модифікації білків в тканинах печінки проводять за співвідношенням величин червоного та синього спектрів забарвлення. Спосіб що заявляється, здійснюється наступним чином. Фарбують бромфеноловим синім при низькому рН (2,0) гістологічний зріз тканини печінки і отримують цифрову копію мікроскопічного зображення. Потім ділянки зображення (клітини, міжклітинний матрикс), що зацікавили дослідника, опрацьовують методом комп'ютерної мікроспектрометрії використовуючи систему аналізу кольору RGB, завдяки чому з роздільною здатністю у 256 градацій отримують дві конкретні величини: інтенсивність червоного кольору та синього кольору. Далі величину інтенсивності забарвлення червоного кольору ділять на величину інтенсивності забарвлення синього кольору і отримують співвідношення (коефіцієнт) між цими величинами, яке і дозволяє оцінити ступінь окиснювальної модифікації білків. Таким чином, вищеописаний спосіб дозволяє в гістологічному препараті виміряти ступінь окиснювальної модифікації білків в конкретних структурах тканини печінки. Описаний спосіб застосовано на таких прикладах. Приклад використання способу №1. Отримали зразки печінки щурів, яких за 5 днів до початку та впродовж всього експерименту утримували в умовах штучного освітлення з відношенням тривалості світлого та темного періодів 12год світла : 12год темряви. Для відтворення токсичного гепатиту (експериментальна модель патології мембран) тваринам вводили тетрахлорметан інтрагастрально дворазово (з добовим інтервалом) в дозі 0,25мл 50% олійного (оливкове масло) розчину на 100г маси тварини. Дана сполука є сильною гепатотропною отрутою за рахунок безпосереднього впливу на мембранні структури гепатоцитів та посилення процесів пероксидації біополімерів в клітині, що порушує як структуру, так і функції печінки [Губский Ю.И. Коррекция химического поражения печени. - К.: Здоров'я, 1989. - 168с.]. Паралельно 4 були відібрані тварини, що склали групу контролю і яких утримували за таких же умов освітлення. На чотирнадцяту добу після останньої затравки проводили евтаназію контрольних та інтоксикованих тварин (декапітація під легкою інгаляційною ефірною анестезією). Шматочки тканини печінки фіксували у нейтральному забуференому розчині формаліну протягом 24 годин. Наступним етапом було зневоднювання зразка тканини і його заливка у парафін. На санному мікротомі виготовили гістологічний зріз товщиною 5 мікрометрів, провели його фарбування бромфеноловим синім при рН 2,0 за Мікель-Кальво. Використовуючи цифровий фотоапарата та світлооптичний мікроскоп отримали копії зображень гістопрепаратів у ци фровому форматі, які зберегли на комп'ютерному носієві. Далі цифрові копії зображень завантажили у середовище комп'ютерної програми "GIMP 2.0" (США). Засобами цієї програми в гепатоцитах печінки виміряли середню інтенсивність червоного кольору (для групи контролю вона склала 44,17 одиниць, для групи тварин з експериментальною патологією - 59,45 одиниць) та середню інтенсивність синього кольору (61,15 та 53,97 одиниць у тварин відповідних гр уп). Поділивши першу величину на другу (44,17/61,15 - для тварин групи контролю та 59,45/53,97 - для тварин з токсичним гепатитом) отримали ступінь окиснювальної модифікації білків в гепатоцитах печінки щурів: 0,722 - у тварин групи контролю та 1,102 - у інтоксикованих тварин. Ця величина дозволила не тільки встановити переважання карбонільних груп над аміногрупами у тварин з експериментальним токсичним гепатитом (про що свідчить більше значення коефіцієнта ніж у тварин контрольної групи - 1,102>0,722), але і виміряти це переважання - в 0,655 раза. Приклад використання способу №2. Отримали печінку від щурів, які перебували в умовах освітлення та яким моделювали гепатит за описаною вище методикою. Тварин розділили на три групи: перша - контрольна, друга - з нелікованим токсичним гепатитом, третя група - на фоні токсичного гепатиту щурам вводили розчин мелатоніну ("Sigma", США), приготовлений на 0,9% розчині NaCl у дозі 3мг/кг маси тварини інтрагастрально у ранкові години (8.00). За походженням мелатонін є гормоном епіфізу, що синтезується з амінокислоти триптофану переважно у темновий період доби та проявляє виражені біоритморегулюючі, а також прямі і непрямі антиоксидантні властивості. Знеживлення тварин, обробку печінки та оцінку одержаних гістологічних зрізів тканини провели як описано в прикладі №1. У клітинах печінки тварин, які отримували мелатонін, визначили середню величину інтенсивності червоного кольору, що склала 53,37 одиниць, а синього - 73,27. Поділивши перше значення на друге, отримали ступінь окиснювальної модифікації білків в гепатоцитах лікованих тварин - 0,728, котрий виявився у 1,51 рази нижчим показника у інтоксикованих тварин. Це свідчить не лише про відновлення кислотно-основної рівноваги в тканині печінки та зменшення процесів пероксидації біополімерів, а й ще раз вказує на здатність гормону пінеальної залози - мелатоніну проявляти потужну антиоксидантну дію. Також 5 38260 можна рекомендувати залучення його до комплексної терапії токсичних уражень печінки різного ґенезу. Приклад використання способу №3. Отримали печінку тварин, які знаходились в умовах штучного освітлення (12год світла : 12год темряви) за 5 днів до та впродовж всього експерименту. Затравку тварин тетрахлорметаном провели за описаною вище методикою. На наступний день після останнього введення токсину, тваринам впродовж ще п'яти діб внутрішньошлунково о 8.00 вводили настоянку ехінацеї пурпурової (ТОВ "ДКП "Фармацевтична фабрика", м.Житомир, Україна) в дозі 0,25мл/кг маси тварини. Для порівняння використали печінку тварин гр упи контролю та з токсичним гепатитом, яких утримували у таких же умовах експерименту. Після евтаназії тварин (на 14 день від початку досліду) зразки тканини печінки фіксували у забуференому розчині формаліну впродовж 24 годин, а далі зневоднювали та заливали у парафін. З отриманого матеріалу виготовили гістологічні зрізи, профарбували їх бромфеноловим синім при кислому рН середовища за методикою МікельКальво. Використовуючи світлооптичний мікроскоп та цифровий фотоапарат, отримали зображення Комп’ютерна в ерстка І.Скворцов а 6 гістологічних препаратів у цифровому форматі, завантажили їх у середовище комп'ютерної програми "GIMP 2.0" (США) і виміряли інтенсивність червоного та синього спектрів забарвлення у відповідних зразках тканини печінки. Визначили середню інтенсивність червоного забарвлення - 53,7 одиниць, середню інтенсивність синього забарвлення - 68,25 одиниць та ступінь окиснювальної модифікації білків - 0,787 у печінці тварин, які отримували настоянку ехінацеї пурпурової. Встановили, що на фоні тетрахлорметанового гепатиту при введенні даного лікарського препарату рівень окиснювальної модифікації білків печінки знижується у 1,4 рази. Це ще раз підтверджує, що настоянка ехінацеї пурпурової володіє вираженими антиоксидантними та гепатопротекторними властивостями і її п'ятиденне застосування є ефективним у лікуванні уражень печінки. Технічний результат: використання способу, що заявляється, дозволяє визначити співвідношення між карбонільними та аміногрупами білків та по цьому співвідношенню у відносних величинах виміряти ступінь окиснювальної модифікації білків, а, отже, і судити про інтенсивність утворення активних форм кисню в тканині печінки. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601