Спосіб одержання токсоплазмового діагностикуму

1 Спосіб одержання токсоплазмового діагностикуму, який полягає у культивуванні фібробластів курячих ембріонів, їх трипсинізаци, зараженні, культивуванні заражених клітин, який відрізняється тим, що для одержання фібробластів використовують 10-11-денні курячі ембріони, зараження провадять у суспензію фібробластів з Корисна модель відноситься до медицини, а саме до імунологи, і може бути використана для діагностики токсоплазмозу і для сероепідемюлопчних досліджень з токсоплазмозу і може бути використана у виробництві бакпрепаратів, а також у експерементальних дослідженнях Діагностика широко розповсюдженого захворювання людини і тварин протозойної природи токсоплазмозу із-за його різноманітних КЛІНІЧНИХ проявів безсимптомних форм, частих асоціацій з іншими інфекціями, базується, головним чином, на лабораторних методах дослідження, із яких найбільш простими і доступними для широкої практики охорони здоров'я є серологічні методи [1] Одним з них є реакція зв'язування комплементу (РЗК) [2] Виготовлення діагностикуму для РЗК потребує накопления великої КІЛЬКОСТІ біомаси токсоплазми Для цього у виробничих умовах використовують метод накопичення токсоплазми в перитоніальному ексудаті білих мишей при внутрішньоутробному зараженні Використання такого методу дозволяє отримувати високоактивну біомасу збудника, яка містить 50 і більше млн токсоплазм в 1 мл экссудата Далі, экссудат після промивання фізіологічним одночасним введенням препарату, який підвищує проникність клітинної мембрани, але не пригнічує розвиток токсоплазм, культивують заражені клітини протягом 4-6 діб, відмивають їх фізрозчином, до осаду додають дистильовану воду, розфасовують і піддають люфілізаци 2 Спосіб одержання токсоплазмового діагностикуму за п 1, який відрізняється тим, що як препарат, який підвищує проникність клітинної мембрани, але не пригнічує розвиток токсоплазм, використовують, наприклад, лідазу 3 Спосіб одержання токсоплазмового діагностикуму за пп 1, 2, який відрізняється тим, що лідазу вводять у КІЛЬКОСТІ 0,4-0,9 од на 1 мл суміші фібробластів розчином, обробляють дистильованою водою (з одночасною його концентрацією у 1,5-1,6 разів), твіном-80 і ефіром з наступним заморожуванням і відтаванням водної частини За таких умов специфічна активність отримуваного діагностикуму (титр не нижче розведення 1 20 (3+) при титруванні з імунною сироваткою у розведенні 1 40) відповідає вимогам регламенту [3] і фармакопейній статті [4] на цей препарат Але данный метод у силу необхідності використання великої КІЛЬКОСТІ лабораторних тварин є дорогим, а необхідність постійного контакту із збудником на протязі тривалого часу (від зараження тварин до їх розтину) робить його небезпечним для обслуговуючого персоналу Є також відомим спосіб одержання токсоплазменного агента для РЗК шляхом накопиченния токсоплазми у культурі клітин фібробластів 9денних курячих ембріонів [5], обраний нами прототипом Отриману після дезинтеграцм шляхом трипсинізацм суміш клітин по 500000 в мл розсівають на матраци, заливають живильним середовищем і культивують на протязі 3 діб до отримання моношара На 3-ю добу живильне середовище зливають, моношар клітин заражують із розрахунку 1 0) 9575 токсоплазма на 8 клітин, заливають підтримуючим середовищем і культивують заражені клітини впродовж 7-8 днів. За цих умов отримують матеріал, який містить в 1мл середовища від 5 до 8-Ю млн токсоплазм. Із цього матеріалу готують антиген для РЗК. Проте, отримати активний антиген у виробничих умовах за такого низького накопичення токсоплазми, відповідно до вимог нормативних документів [3, 4], без значної концентрації збудника практично неможливо. До недоліків методу слід віднести також необхідність використання великої кількості живильного і підтримуючого середовищ, спеціальної обробки лабораторного посуду (матраців), значну тривалість усієї процедури отримання врожаю токсоплазми - не менш 10-11 днів і багатократне мікроскопіювання з метою контролю за станом тканевої культури. У основу корисної моделі поставлена задача отримати препарат, специфічна активність котрого відповідає вимогам нормативних документів на виробництво діагностикумів для РСК, і одночасно знизити його вартість і зменшити ризик зараження збудником обслуговуючого персоналу. Поставлена задача досягається тим, що для накопичення біомаси токсоплазми у кількості, необхідної для отримання активного антигену, використовується суміш клітин фібробластів 11-13денних курячих ембріонів у живильному середовищі, зараження провадять у суспензію фібропластів з одночасним введенням препарату, який підвищує проникність клітинної мембрани, але не пригнічує розвиток токсоплазм, наприклад, лідазу, культивують заражені клітини протягом 4-6 діб, відмивають їх фізрозчином, до осаду додають дистильовану воду, розфасовують і піддають ліофілізації. Лідазу вводять у кількості 0,4-0,9од. на 1мл суміші фібробластів. Спосіб здійснюється наступним чином Накопичення біомаси токсоплазми провадять у суміші клітин фібробластів 11-13-денних курячів ембріонів, що її отримують ферментною дезинтеграцією - трипсином, в живильному середовищі 199 з додаванням 5% сироватки (кінська для живильних середовищ або теляча ембріональна, що не містить антитіл до токсоплазми) і 0,4-0,9од лідази на 1мл суміші клітин. Отриману суміш клітин заражають матеріалом, який містить токсоплазму мишачим (перитоніальний екссудат білих миш) або тканевим (суміш заражених клітин). Згідно до вимог регламенту і фармакопейної статті по виробництву токсоплазменного антигена для РЗК [3, 4] необхідно отримати діагностикум, котрий при титруванні з імунною сироваткою у розведенні 1:40 повинен мати розведення не нижче 1:20 3+. Для дотримання приведених вище критеріїв якості діагностикуму заявлений спосіб реалізується у рамках наступних параметрів: густота суміши клітин - не менш 8-10млн/мл, заражаюча доза - 1 токсоплазма на 4-6 клітин, тривалість культивування 4-6 діб, вихід токсоплазми - не менш 40 млн/мл і збільшення концентрації біомаси у процесі готування діагностикуму - у 2-4 рази. Оцінку активності отриманого препарата проводили загальноприйнятим методом - в реакції зв'язування комплементу з іммунною сироваткою. Реакція вважається позитивною при затримці гемолізу еритроцитів від 4 до 2-х плюсів (4+-повна затримка гемоліза еритроцитів, 2+ - затримка гемолізу на 50%. У порівнянні з прототипом досягається скорочення строку отримання біомаси, зменшення часу контакту персоналу з інфекційним матеріалом. Досягається значне збільшення вмісту токсоплазм у 1 мл середовища - в 4,5-8,5 разів, що дає можливість одержати препарат у виробничих умовах із специфічною активністю, котра відповідає вимогам нормативних документів на виробництво токсоплазменного дігностикума для РЗК. Приклад 1 Готували суміш клітин фібробластів із 3-х курячих ембріонів 11-денного віку [6]. Одержали ЮОмл суміші клітин по 10млн/мл у середовищі 199, куди додали 5мл кінської сироватки і 0,4од/мл лідази. У флакони із сумішшю клітин внесли інфікований матеріал - пєритоніальний ексудат білих мишей із розрахунку 1 токсоплазма на 4 клітини. Флакон с зараженою сумішшю клітин ставили у термостат з температурою 37°С, на 4 доби, з періодичним (4-5 разів на день) перемішуванням його вмісту шляхом зболтування. На 4-ту добу із суміши клітин робили мазки для перегляду морфології токсоплазм. Мазки висушували, фіксували сумішшю Никифорова, офарблювали за Романовскому-Гимзе, переглядали під мікроскопом із збільшенням 90x7. У мазках була визначена нормальна морфологія токсоплазми. Одночасно у суміші клітин підраховували кількість токсоплазм у камері Горяєва. В одному мл суміші клітин містилось 41,8млн токсоплазм. Далі із одержаної суміші токсоплазм готували препарат для РЗК. Після відмивання суміші фізіологічним розчином центрифугуванням, до осаду додавали дистильовану воду у кількості в 0,50,55мл, (що у тричі менше, ніж указано у регламенті) для одержання більшої концентрації токсоплазм у препараті. Після розфасовки в ампули по 0,5мл одержаного матеріале заражених фібробластов курячого ембріона і ліофільного висушування, здійснювали випробування його активності шляхом титрування з імунною токсоплазменною сироваткою у порівнянні з антигеном, виготовленим з перитоніального ексудату білих мишей. Результати наведені у табл.1. Із наведених у таблиці 1 даних видно, що одержаний із тканевої суміші препарат має активність, рівну титру 1:40, і повністю відповідає вимогам регламенту и фармакопейної статті на діагностикум токсоплазмений для РЗК. Виробнича серія препарату має таку ж активність. 9575 Таблиця 1 Специфічна активність препаратів для РЗК, виготовлених із культуральної суміші та з перитоніального ексудату білих мишей Розведення імунної сироватки Антигенів 1:80 1:40 1:10 1:20 1:160 Антиген із культуральної суміші, одержаний за раженням клітин перитоніальним ексудатом 2+ 1:10 4+ 4+ 4+ + 2+ 3+ 1:20 4+ 4+ + 2+ 4+ 3+ 1:40 3+ 2+ 1:80 3+ + Антиген із перитоніального ексудата (контроль) 4+ 2+ 3+ 1:10 4+ 4+ 4+ + 4+ 3+ 1:20 4+ 2+ 1:40 4+ 4+ 3+ 2+ 1:80 4+ + 3+ Приклад 2 Виконували усі процеси таким же чином, як в прикладі 1, за винятком того, що як заражаючий матеріал використовували тканеву суміш токсоплазми. Із 4 курячих ембріонів 12-денного віку одержують 129мл суміші клітин фібробластів по 10млн/мл у середовищі 199 з 5% кінської сироватки і додаванням 0,9од. лідази на 1мл суміші. Для зараження одержаної суміші із розрахунку 1 токсоплазма на 6 клітин додавали 4,7мл раніше зараженної суміші клітин, яка містить 41млн токсоплазм в 1мл. Через 6 діб культивування у термостаті при 37°С провадили морфологічний контроль і підрахунок токсоплазм в камері Горяєва. Морфологія токсоплазм - у нормі, а кількість в 1мл суміші - 45,7млн. В процесі приготування антигену одержали 40мл препарату. Після розфасо вки в ампули по 0,5мл і ліофільного висушування провели титрування специфічної активності одержаного діагностикуму у порівнянні з контролем виробничою серією препарату (табл.2). Із представлених в таблиці даних видно, що препарат, одержаний із тканевой суміші, зараженої тканевим інфікуючим матеріалом, має активність з титром 1:40, що повністю відповідає вимогам регламенту і фармакопейної статті на токсоплазменний діагностикум для РЗК. Специфічна активність виробничого препарату, виготовленого із перитоніального ексудату білих мишей, відповідно до існуючої технології одержання токсоплазменного діагностикуму, була такою же. Однак, вартість препаратів, виготовлених із ексудату білих мишей значно вище вартості антигену, одержаного із суміші клітин курячих ембріонів. Таблиця 2 Специфічна активність препаратів для РСК, приготованних із культуральної суміші і перитоніального ексудата білих мишей Розведення імунної сироватки 1:10 1:20 1:40 1:160 1:80 Антиген із культуральної суміші, зараженної інфікованної токсоплазмою культурою клітин (курячі фібробласти) 4+ 1:10 4+ 4+ 2+ 4+ 1:20 4+ 4+ 2+ 4+ 1:40 4+ 4+ 2+ 1:80 3+ 2+ + + Антиген із перитоніального ексудату (конт роль) 4+ 4+ 2+ 4+ 4+ 1:10 4+ 4+ 1:20 4+ 3+ 1:40 4+ 4+ 4+ 2+ 1:80 2+ 2+ + Антигенов Для порівняння приводимо вартість матеріалів, які використовують для готування ЮОмл діагностикуму обома методами. Для одержання ЮОмл культурального діагностикуму необхідно ЮОмл суміші клітин по 10млн/млхЗ(концентрація)+5%(витрати виробництва) разом 135мл культуральної біомаси токсопла 8 9575 зми із розрахунку Юмлн/мл клітин в 1мл середовища Для одержання такої КІЛЬКОСТІ суміші клітин потребується 8-10 курячих ембріонів 11-13денного віку, 315мл середовища, 50мл 0,25% розчину трипсину, 15,5мл кінської сироватки і 3 ампули лідази Для одержання такої ж КІЛЬКОСТІ препарату із перитоніального ексудата білих мишей, враховуючи, що від 1-і миши вагою 16-18г одержують у середньому 1мл матеріалу (0,5мл ексудату і 0,5мл фізіологічного розчину, яким промивають черевну порожнину) необхідно ЮОмл ексудатах 1,51,6(концентрація)+5%(втрати виробництва), разом 155, 5-160 мишей До цього ще варто додати вартість їх утримання протягом 3 днів (карантин) і 4 днів після зараження Розрахунки вартості сировини і матеріалів в порівняних цінах наведені в табл З Таким чином, середня вартість ЮОмл препарата, виготовленого із суміші клітин - 49,3грн, а з перитоніального ексудату білих мишей - 220,32грн, тобто майже в 4,5 раза вище Що стосується роботи безпосередньо із заразним матеріалом при виготовленні препарату для РСК, то на зараження суміші клітин потрібно 1520хв , а для одержання ексудату білих мишей - 2 години на зараження і від 5 до 6 годин на розтин заражених тварин, тобто 7-8 годин, не рахуючи часу догляду за зараженими мишами - чищення кліток, годівля та ін Таким чином, на одержання ексудату заражених білих мишей витрачається в 20-30 разів більше часу на контактування обслуговуючого персоналу з заразним матеріалом (прототип), ніж для одержання зараженої суміші клітин (заявлений спосіб) Таблиця З Вартість основних матеріалів, що витрачаються на одержання ЮОмл препарата для РЗК (в грн) № 1 2 3 4 5 1 2 Найменування матеріалів Одиниця Вартість виміру Препарат із суміші клітин 1шт 1,0 450мл 60 400мл 60 ЮОмл 40 1амп 0,35 Необхідна КІЛЬКІСТЬ Вартість, грн 10 315 50 15,5 3 100 42,0 7,5 6,2 1,05 66,75 160 640,0 160 336,0 Курячі ембріони 11-13-денні Середовище 199 Трипсин 0,25% Кінська сироватка Лідаза РАЗОМ Препарат из перитоніального ексудата 1 шт 4,0 БІЛІ МИШІ 16-1 8Г 1 миша х Корм (хліб, зерно, Крупи, сир 2,10 та ін) 7дн РАЗОМ У цілому, запропонований спосіб одержання діагностикуму для РЗК забезпечує його специфічну активність на рівні активності виробничого препарату, виготовленого ВІДПОВІДНО вимогам фармакопейної статті Поряд з цим, спосіб, що заявляється, має такі переваги 1) економічність - зменшення затрат на сировину і матеріали більш, майже у 10 разів, 2) скорочення строку отримання біомаси у 1,21,7 раза, 3) скорочення часу контакту обслуговуючого персоналу з заразним матеріалом в 20-30 разів Джерела інформації 1 Казанцев А П Токсоплазмоз - Медицина, 1985г 2 Клиника, диагностика и лечение приобретенного токсоплазмоза у беременных женщин, профилактика врожденного токсоплазмоза (метоКомп ютерна верстка Д Шеверун 656,0 дические рекомендации) Составители Мороз Б В , Бакулева Л П и др -М 1990г 3 Регламент антигена токсоплазменного сухого для постановки реакции связывания комплемента №113-78, утвержденный начальником Главного управления по производству бактерийных и вирусных препаратов МЗ СССР от 13 02 78г 4 Фармакопейная статья на диагностикум токсоплазменный сухой для РСК, утвержденная первым заместителем министра ЗО СССР 29 01 89г 5 Акиншина Г Т Изучение возбудителя токсоплазмоза в культуре ткани, автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук - М , 1964г 6 Посібник з медичної вірусологи, под редакцией академика Академии наук высшей школы Украины Гирина В М Киев, "Здоров я", 1995г, с 44-48 Підписне Тираж 26 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул Урицького, 45, м Київ, МСП, 03680, Україна ДП 'Український інститут промислової власності", вул Глазунова, 1, м Київ - 4 2 , 01601