Спосіб одержання біомаси тохорlаsма gоndіі

Изобретение относится к медицине, а именно иммунологии и паразитологии и может быть использовано в производственных условиях для приготовления токсоплазменных диагностических препаратов. Токсоплазмоз, одна из наиболее распространенных на земном шаре паразитарных инфекций. Особое внимание он привлекает к себе в последние 10-летия, в связи с определением его роли в различных видах патологии беременности, плода и новорожденных, в следствии чего он был внесен в группу так называемых TORCH-инфекций, а также в связи с тем, что он определен как одно из основных заболеваний, осложняющих течение СПИДа и других иммунодефицитных состояний, чаще всего в виде энцефалитов и пневмоний. Диагностика токсоплазмоза основывается на выявлении паразита в инфекционном материале (метод микроскопии) или его выделении методом биологических проб чаще всего на белых мышах, куриных эмбрионах, реже на культуре клеток различного происхождения [1, 2, 3]. Однако трудности обнаружения токсоплазмы при микроскопии и выделении паразитов путем постановки биопроб обусловили выбор более простых и доступных для практического здравоохранения методов диагностики токсоплазмоза, основанных на реакциях иммунитета -серологических и аллергических. В последнее время наиболее широкого распространения получили реакции связывания комплемента (РСК), иммунофлуоресценции (РИФ), агглютинации (РА), иммуиоферментный метод (ИФА) и др. Для приготовления диагностикума или тестсистемы для этих реакций требуется накопление большого количества биомассы Toxoplasma gondii. В настоящее время для этой цели повсеместно используют в основном экссудат внутрибрюшинно зараженных белых мышей. Обычно на 4 - е сутки после заражения при появлении клинических признаков заболевания животных забивают и производят забор перитонеального экссудата. От каждой мыши получают от 0,5 до 1,5мл материала, а для приготовления, например, 100 доз токсоплазменного диагностикума для РСК требуется материал от 80 - 100 мышей. Таким образом, метод накопления биомассы токсоплазмы путем заражения белых мышей дорогостоящий, трудоемок, относительно продолжительный по времени. В последние годы проведены работы по получению токсоплазменных антигенов в различных культура х клеток. При этом используются как первичные культуры (4), так и перевиваемые клетки человека - диплоидные (5), и животных - клетки саркомы мышей (6). Наиболее простым и доступным для производственных целей является метод накопления токсоплазмы в первичной культуре куриных фибробластов. Согласно данным Г.Т. Акиншиной (7), при использовании 3-суточной культуры фибробластов 9-дневных куриных эмбрионов и заражении токсоплазмой из расчета 1 паразит на 8 клеток, на 7 - 8 сутки после заражения можно получить урожай возбудителя от 5 до 10 - 12млн токсоплазм в 1мл культуральной среды. Для размножения клеток была использована среда, состоящая из 0,5% гидролизата лактальбумина на растворе Хенкса с добавлением 5 - 10% бычьей сыворотки, которую после заражения заменяли средой 199 без сыворотки. Из полученной биомассы готовили токсоплазменный антиген для РСК. В литературе имеются указания на использование суспензионных культур, в частности клеток HeLa, для размножения токсоплазмы (8). Однако в производственных условиях этот способ размножения токсоплазмы не применялся. Недостатки способа получения биомассы токсоплазмы в первичной культуре куриных эмбрионов: 1) необходимость разлива взвеси клеток в посуду определенного объема из соответствующего стекла для получения монослоя, учитывая, что оптимальная густо та взвеси клеток не должна превышать 500000 клеток в 1мл среды; 2) необходимость использования большого количества среды для приготовления монослоя клеток с последующей сменой после заражения, иногда повторной для поддержания оптимального pH среды при длительном культивировании; 3) продолжительный срок культивирования клеток и накопления биомассы токсоплазмы - 3 суток до заражения и 7 - 8 - после; 4) необходимость постоянного микроскопического контроля за состоянием зараженной токсоплазмой культуры клеток. В основу изобретения поставлена задача сократить сроки накопления биомассы токсоплазмы и снизить себестоимость конечного продукта за счет сокращения объема используемой питательной среды, сыворотки, посуды и затрат труда. Поставленная задача достигается тем, что для заражения используется 5-миллионная взвесь клеток фибропластов 10 - 11-дневных куриных эмбрионов в среде 199 с 5% лошадиной или телячьей сыворотки, не содержащих специфические антитела, в которую вносят раствор лидазы из расчета 0,5 - 0,6ед на 1мл взвеси, как фактор распространения (9, 10), способствующий проницаемости клеточных оболочек. Согласно нашим данным, наличие 0,5 0,7ед лидазы на 1мл взвеси повышает выход токсоплазм в 1,3 - 1,5 раз. Полученную взвесь клеток заражают взвесью токсоплазм из расчета 1 паразит на 2 - 8 клеток. Через 72 часа выдерживания флакона с зараженной взвесью в термостате при периодическом (5 - 6 раз в день) встряхивании в полученной биомассе токсоплазмы подсчитывают количество особей в 1мл. Для заражения могут быть использованы как перитонеальный экссудат зараженных белых мышей, так и культуральная взвесь токсоплазмы. Поставленная задача достигается следующим образом. У 10 - 11-дневных куриных эмбрионов отрезают лапы, крылья, клюв извлекают и удаляют мозг, печень, кишечник. Тушки измельчают и кусочки тканей тщательно дважды отмывают от крови и сгустков в физиологическом растворе pH 7,2 - 7,4 (ф.р.) с 500000Ед пенициллина и стрептомицина. Затем кусочки тканей переносят но флакон и снова измельчают до размеров 0,5 - 1,0мм, заливают трипсином для культуры клеток и проводят трипсинизацию. По окончании трипсинизации клетки отмывают от трипсина физиологическим раствором pH 7,2 7,4, добавляя последний к взвеси клеток по объему из расчета 1 : 4 - 1 : 5. Кле тки осаждают центрифугированием при 1000об/мин в течении 10 - 15мин и ресуспендируют во флаконе соответствующего объема со средой 199 + 5% лошадиной (телячьей) сыворотки из расчета 5000000 клеток в 1мл среды. К полученной взвеси клеток добавляют раствор лидазы из расчета 0,5 - 0,6ед на 1мл взвеси клеток и заражают токсоплазмой (Toxoplasma gondii, штамм RH) из расчета 1 токсоплазма на 2 - 8 клетки, флакон встряхивают и помещают в термостат при температуре 37°C на 48 - 72 часа, при периодическом (5 - 6 раз в день) встряхивании. По окончании культивирования в камере Горяева производят подсчет токсоплазм в 1мл культуральной взвеси. Примеры, подтверждающие возможность осуществления изобретения с получением положительного эффекта. Пример 1. Взвесь 11-дневных куриных эмбрионов, содержащая 5млн.кл. в 1мл среды 199 с 5% лошадиной сыворотки и раствором лидазы из расчета 0,5ед. на 1мл, заражена взвесью перитонеального экссудата белых мышей из расчета 1 паразит на 2 клетки. После встряхивания флакон с зараженной взвесью клеток помещен в термостат при 37°C на 72 часа, с периодическим встряхиванием. Через 72 часа произведен подсчет количества токсоплазм в 1мл взвеси в камере Горяева. Он равен 30500000 токсоплазм в 1мл (кратность прироста количества токсоплазм - 12,4 раза). Пример 2. Взвесь 11-дневных куриных эмбрионов, содержащая 5млн клеток в 1мл среды 199 с 5% лошадиной сыворотки и раствором лидазы из расчета 0,5ед на 1мл, заражена взвесью токсоплазм перитонеального экссудата белых мышей из расчета 1 паразит на 4 клетки. После встряхивания флакон со взвесью зараженных клеток помещен в термостат при 37°C на 72 часа с периодическим встряхиванием. Через 72 часа произведен подсчет количества токсоплазм в 1мл взвеси в камере Горяева. Он равен 34500000 токсоплазм в 1мл (кратность прироста количества токсоплазм - 27,3 раз). Пример 3. Взвесь 10-дневных куриных эмбрионов, содержащая 5млн клеток в 1мл среды 199 с 5% лошадиной сыворотки и раствором лидазы из расчета 0,6ед на 1мл, заражена культуральной взвесью токсоплазм из расчета 1 паразит на 2 клетки. После встряхивания флакон со взвесью клеток помещен в термостат при 37°C на 48 часов с периодическим встряхиванием. Через 48 часов произведен подсчет количества токсоплазм в 1мл взвеси в камере Горяева. Он равен 34600000 токсоплазм в 1мл (кратность прироста количества токсоплазм 13,8 раз). Пример 4. Взвесь 10-дневных куриных эмбрионов содержащая 5млн клеток в 1мл среды 199 с 5% лошадиной сыворотки и раствором лидазы из расчета 0,6ед на 1мл, заражена культуральной взвесью токсоплазмы из расчета 1 паразит на 4 клетки. После встряхивания флакон со взвесью зараженных клеток помещен в термостат при 37°C на 48 часов с периодическим встряхиванием. Через 48 часов проведен подсчет количества токсоплазм в 1мл взвеси в камере Горяева. Он равен 18100000 в 1мл (кратность прироста количества токсоплазм в 14,4 раза). Пример 5. Взвесь 10-дневных куриных эмбрионов, содержащая 5млн клеток в 1мл среды 199 с 5% лошадиной сыворотки и раствором лидазы из расчета 0,68ед на 1мл заражена взвесью токсоплазм перитонеального экссудата белых мышей из расчета 1 паразит на 8 клеток. После встряхивания флакон со взвесью зараженных клеток помещен в термостат при 37°C на 72 часа с периодическим встряхиванием. Через 72 часа произведен подсчет количества токсоплазм в 1мл взвеси в камере Горяева, он равен 10800000 в 1мл (кратность прироста количества токсоплазм - 17,2 раза). Таким образом, предложенный метод позволяет в короткий срок, за 2 - 3 суток, при значительной экономии среды, посуды, времени и затрат труда получить урожай токсоплазмы от 12,4 до 27,3 раза по сравнению с заражающей дозой, и полученную биомассу использовать для производственных целей.