Штам бактерій bacillus thuringiensis var. israelensis – продуцент позаклітинної колагенази

Реферат: Штам Bacillus thuringiensis var. israelensis - продуцент позаклітинної колагенази, що зареєстрований в Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України під номером ІMB В-7465. UA 96195 U (12) UA 96195 U UA 96195 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Винахід (корисна модель) належить до біотехнології, а саме до одержання нового штамупродуцента ферменту колагенази. Колагеназа - фермент, який використовується в промисловості та медицині для гідролізу колагену - природного нерозчинного фібрилярного білка, що є складовою тканин більшості хребетних тварин. Впливаючи переважно на колагенові волокна, вона сприяє видаленню некротичних тканин. Тому найбільш перспективним напрямком застосування колагенази є включення її в склад медичних препаратів для прискорення відторгнення некротизованих тканин після опіків і відморожень, а також при трофічних виразках для очищення гнійнонекротизованих ран. Запропонований штам Bacillus thuringiensis var. israelensis IMB B-7465 знаходиться в колекції живих культур Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України. Штам виділений з акваторії о. Зміїний та знаходиться в колекції живих культур кафедри мікробіології, вірусології та біотехнології Одеського національного університету ім. I.I. Мечникова. На сьогодні відомо [1, 2], що коллагенази синтезуються різними мікроорганізмами, такими як: Clostridium histolyticum, C. perfringens, Bacillus sp., Bacillus cereus, B. anthracis, Vibrio sp., V. vulnificus, Peptostreptococcus magnus, Aspergillus flavus, A.fumigatus, A. repens, Candida albicans, Penicillium purpurogenum і P. frequentan. За даними літератури [3] значна кількість колагенолітичних мікроорганізмів є патогенами для людини, а колагеназа, як один із факторів їх вірулентності, бере участь в інвазії та агресії патогену. Все це значно обмежує область їх практичного застосування. Колагенолітичні протеази включають дві великі групи: серинові та металопротеази. Серед бактеріальних колагеназ металопротеази найбільш широко розповсюджені, в той час як серинові та інші колагенази рідко зустрічаються [4]. Найбільш вивченими серед мікробних продуцентів є колагенази бактерій роду Clostridium, які належать до металопротеаз, активний 2+ центр яких містить іон Zn . Найбільш близьким до корисної моделі по технічній суті та результату, який досягається, є штам Streptomyces sp. 1349 [5], при глибинному культивуванні якого в певних умовах можна одержати комплексний ферментний препарат Streptomyces sp. 1349, колагеназна активність якого складає 2,67 од/мг білка (субстрат - колаген). Культурально-морфологічні та фізіолого-біохімічні особливості продуцента. Грампозитивна паличка, яка утворює спори еліпсоподібної форми, що розташовуються по центру, спорангій не роздутий. Факультативний анаероб, каталазо- та оксидазопозитивний. На МПА росте щільно, утворюючи колонії (6-10 мм) сірувато-білого кольору, округлої форми, матові, профіль колоній вигнутий, мають шорстку поверхню. Для культури характерний окиснювально-бродильний тип метаболізму. Гідролізує желатину і крохмаль, не гідролізує казеїн, не має лецитинази та фенілаланіндезамінази. Ферментація джерел вуглецю: При окисненні глюкози утворює кислоту та ацетоїн, не утворює газ, з L-арабінози, D-ксилози і D-маніту не утворює кислоту. Асиміляція джерел вуглецю: як джерела вуглецю та енергії бактерії використовують пептон, глюкозу, дріжджовий автолізат, ростуть на м'ясо-пептонному агарі, у м'ясо-пептонному бульйоні. Штам відновлює нітрати до нітритів, не продукує газ з нітритів. Фізіолого-біохімічні властивості Відношення до вуглецевого живлення: культура синтезує колагеназу на середовищах, що містять сахарозу, глюкозу, ксилозу, дріжджовий екстракт. Відношення до азотного живлення: із органічних джерел азоту асимілює пептон, желатин, сечовину, дріжджовий екстракт, а з неорганічних - (NH4)2SO4, NaNO3. Найбільшу колагеназну активність забезпечує желатина як єдине джерело азоту в середовищі. Штам зберігається на середовищах МПА під шаром стерильного вазелінового масла. Пересів 2 рази на рік. Жирно-кислотний аналіз та ідентифікацію штаму проведено за допомогою методу газової хроматографії та автоматичної системи ідентифікації мікроорганізмів MIDI Sherlock (MIDI, USA). Штам визначили як Bacillus thuringiensis var. israelensis з індексом схожості 0,442. Штам авірулентний, належить до 4-го класу за ступенем небезпеки мікроорганізмів: "малонебезпечні, практично без алергенної та загальнотоксичної дії". Відношення до кисню: факультативний анаероб. Відношення до температури: мезофіл, оптимальна температура для росту та біосинтезу ферменту 28-30 °C. 1 UA 96195 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Відношення до кислотності поживного середовища: культура росте при рН 7,2-7,8. Оптимальне вихідне значення рН середовища для синтезу ферменту становить 6,5, в процесі росту та ферментації спостерігається зростання рН до 8,2. Оптимальні параметри культивування штаму: температура 28 С, рН 7,5, 24 год. на напівсинтетичному середовищі такого складу (в г/л): КН 2РО4 - 1,6; MgSO47H2O - 0,75; ZnSO47H2O - 0,25; (NH4)2SO4 - 0,5; мальтоза - 1,0; желатин - 10,0; дріжджовий автолізат - 0,15. Біомасу відділяють центрифугуванням, колагеназну активність визначають у надосадовій рідині. Для визначення активності ферменту як субстрат використовують нативний високомолекулярний білок колаген, отриманий за спеціальною технологією з очищеної колагенової тканини тварин ("Геліос-12"). При вивченні колагеназної активності інкубаційну суміш, яка містить 10 мг колагену, 2,5 мл 0,01 Трис-НСl буфера (рН 9,0-10,0) і 1 мл досліджуваного препарату, витримують на водяній бані 5 год. при 37 °C. Після цього 0,1 мл реакційної суміші переносять в пробірки, які містять 0,5 мл 4 % розчину нінгідрину в суміші з 0,2 М цитратним буфером. Інкубування проводять 20 хв на киплячій водяній бані, після чого в охолоджену суміш додають 5 мл 50 % розчину н-пропанолу і витримують 15 хв при кімнатній температурі. Продукти розщеплення визначають на спектрофотометрі СФ-26 при довжині хвилі 600 нм. За одиницю колагеназної активності приймають кількість мкмолей вивільненого лейцину згідно зі стандартною кривою, побудованою за лейцином [6]. При глибинному культивуванні Bacillus thuringiensis var. israelensis одержано комплексний ферментний препарат, колагеназна активність якого досягає значень 34,5 од/мг білка, що майже в 13 разів перевищує активність комплексного ферментного препарату Streptomyces sp. 1349, взятого в якості стандарту порівняння (субстрат - колаген). Перевагою запропонованого продуцента є його здатність синтезувати високоактивну та термостабільну колагеназу, відсутність сезонності та токсичності, що є технологічно ефективним. Ферментний препарат, одержаний з цієї культури осадженням сульфатом амонію (90 % насичення), здатний ефективно працювати в діапазоні значень рН реакційного середовища від 5,0 до 11,0 з помітним піком активності при рН 8,0. Фермент стабільний при зазначених вище значеннях рН впродовж 24 годин. Ферментний препарат активний від 20 до 60 °C (оптимум при 45 °C). Термостабільність препарату при 30 °C повністю зберігається впродовж доби; при 45-50 °C - 120 хв; при 60 °C - 60 хв. Препарат зберігає активність впродовж 1 року. Запропонований фермент може знайти використання у медико-технологічних процесах. Таким чином, отримано новий штам, який, у порівнянні з відомими, має інші культуральні ознаки і є новою культурою зі стійкими біохімічними властивостями. Джерела інформації: 1. Suphatharaprateep W., Cheirsilp В., Jongjareonrak A. Production and properties of two collagenases from bacteria and their application for collagen extraction // N. Biotechnol. - 2011. - 28, N 6. - P. 649-55. 2. Jain R., Jain P.C. Production and partial characterization of collagenase of Streptomyces exfoliatus CFS 1068 using poultry feather // Indian J. Exp. Biol. - 2010. - 48, N 2. - P. 174-178. 3. Harrington D.J. Bacterial collagenases and collagen-degrading enzymes and their potential role in human disease // Infect. Immun. - 1996. - 64, N 6. - P. 1885-1891. 4. Liu L., Ma M., Cai Z., Yang X., Wang W. Purification and properties of a collagenolytic protease produced by Bacillus cereus MBL13 strain // Food Tech. Biotech. - 2010. - 48, N 2. - P. 151-160. 5. Іванко О.В., Варбанець Л.Д. Очистка та фізико-хімічні властивості колагенази Streptomyces sp. 1349 і кератинази Streptomyces sp. 1382 // Мікробіол. Журн. - 2004. - 66, N 6. С. 11-24. 6. Mandl I. Collagenase // Science. - 1970. - 169, N 3951. - P. 1234-1238. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Штам Bacillus thuringiensis var. israelensis - продуцент позаклітинної колагенази, що зареєстрований в Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України під номером ІMB В-7465. 55 Комп’ютерна верстка С. Чулій Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2