Штам bacillus thuringiensis імв в-7324 – продуцент позаклітинної еластази

Реферат: Винахід належить до біотехнології, а саме до одержання гідролітичних ферментів за допомогою мікробного синтезу. Запропонований штам Bacillus thuringiensis ІМВ В-7324 дозволяє отримати еластазу з активністю 50-55 од/мл культуральної рідини. UA 97906 C2 (12) UA 97906 C2 UA 97906 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до біотехнологічної промисловості, а саме до одержання нового штаму, продуцента ферменту еластази. Еластаза - фермент, який використовується в промисловості і медицині для гідролізу еластину - природного нерозчинного фібрилярного білка, що є складовою тканин більшості хребетних тварин. Однією з унікальних областей застосування даного ферменту є включення його в склад як моно-, так і поліферментних медичних препаратів для очищення гнійнонекротизованих ран. Запропонований штам Bacillus thuringiensis IMB В-7324 знаходиться в колекції живих культур Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України. Штам отримано шляхом хімічного мутагенезу 0,05 % розчином N-метил-N-нітрозогуанідину у 2009р. у відділі біохімії мікроорганізмів IMB НАНУ з морського ізоляту Bacillus thuringiensis 27 з колекції живих культур кафедри мікробіології і вірусології ОНУ ім. I.I.Мечникова [1]. Описані в літературі еластази гетерогенні за субстратною специфічністю і каталітичними механізмами. Відомо, що ферменти з еластолітичною дією знайдені серед серинових, цистеїнових, аспарагінових та металопротеаз. На сьогоднішній день в світовій літературі практично відсутні систематизовані дані щодо еластолітичних ферментів мікробного походження. В основному, описані окремі продуценти, що належать до різних таксономічних груп мікроорганізмів, зокрема Pseudomonas, Bacillus, Vibrio, Aspergillus, Streptomyces та деяких інших [2]. До їх недоліків можна віднести те, що більшість з них є патогенними для людини, а фермент еластаза, який виділяють з них, необхідний для виявлення вірулентних властивостей і приймає безпосередню участь у ініціації патогенетичного процесу. Все це значно обмежує область їх практичного застосування. Найбільш близьким до винаходу по технічній суті та результату, що досягається, є штам Bacillus mesentericus 316м [3], при глибинному культивуванні якого в певних умовах можна одержати ферментний препарат еластази з активністю 6 од/мг білка (субстрат - забарвлений конго-рот еластин). Культурально-морфологічні та фізіолого-біохімічні особливості продуцента Грампозитивна спороутворююча паличка, яка продукує каталазу, утворює кристал токсину, який фарбується аніліновим чорним. На МПА росте рясно, утворюючи матові гладенькі колонії сірувато-білого кольору діаметром до 3мм. На середовищі Громико утворює як гладенькі колонії до 3мм в діаметрі, так і складчасті діаметром до 5-6мм. Ріст на сусло-агарі спостерігається на 34 добу. Культура росте на картопляному і желатиновому агарі, на агарі Чапека з крохмалем. Зони гідролізу крохмалю на 2 добу на картопляному агарі складають 19-23мм (діаметр колоній 7-9мм); на агарі Чапека з крохмалем - до 20-25мм (діаметр колоній до 7мм). Зони гідролізу желатини при рості на 5 % желатиновому агарі на 2 добу досягають 20-25мм. В мазках з колоній, що виросли на МПА, через 18 год. можна побачити прямі паличковидні клітини розміром 1,2-1,6×2,5-3,0мкм, які розташовані здебільше ланцюгом, зрідка поодиноко. Спори в клітині розташовані центрально. Мають червоне забарвлення при фарбуванні мазка за методом Ожешки. Спори з'являються на 2 добу культивування. Розмір спор складає до 1мкм. Ферментація джерел вуглецю: ферментує глюкозу з утворенням кислоти без газу, дає позитивну реакцію Фогес-Проскауера. Асиміляція джерел вуглецю: асимілює: моносахариди (арабінозу, галактозу, глюкозу, ксилозу, манозу, рамнозу, сорбозу); дисахариди (мальтозу, лактозу, сахарозу); трисахариди (рафінозу), багатоатомні спирти (маніт, сорбіт, дульцит), а також соєве та кукурудзяне борошно. Штам росте при концентрації хлориду натрію 7 %, редукує нітрати до нітритів, гідролізу є крохмаль, желатину та казеїн. Фізіолого-біохімічні властивості Відношення до вуглецевого живлення: культура синтезує фермент на середовищах, що містять як моно-, так і полісахариди. При рості на арабінозі і мальтозі біосинтез еластази максимальний. В присутності сорбози, лактози, рафінози, соєвого і кукурудзяного борошна, а також багатоатомних спиртів - дульциту, маніту, сорбіту, синтез еластази знижується в 6-7 разів. Відношення до азотного живлення: добре засвоює нітратний та амонійний азот. Із органічних джерел азоту асимілює пептон, желатину, сечовину, дріжджовий автолізат, деякі амінокислоти (аланін, валін, метіонин, аспарагін, треонін, глицин, серин, тощо). Найбільшу біосинтетичну активність забезпечує желатина в концентрації 0,1 %. Синтез еластази пригнічується при вирощуванні на дріжджовому автолізаті, аспарагіновій і глутаміновій кислотах, та триптофані як єдиному джерелі азоту в середовищі. Штам зберігається в ліофілізованому стані та на середовищах МПА та Громико під шаром стерильного вазелінового масла. Пересів 1 раз на рік. Ідентифікація проведена за визначником: Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (2 ed.), Volume 3. 2008. 1 UA 97906 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Штам авірулентний, належить до 3-го класу за ступенем небезпеки мікроорганізмів: "помірно небезпечні, мають слабку загально токсичну чи алергенну дію". Відношення до кисню: факультативний анаероб. Відношення до температури: мезофіл, оптимальна температура для росту та біосинтезу ферменту 25-42 °C. Відношення до кислотності поживного середовища: культура росте в діапазоні рН від 4,0 до 9,0. Оптимальне вихідне значення рН середовища для синтезу ферменту становить 6,5, в процесі росту та ферментації спостерігається зростання рН до 8,2. Оптимальні параметри культивування штаму: температура 42 °C, рН 6,5, 18 год. на напівсинтетичному середовищі такого складу (в г/л): КН 2РО4-1,6; MgSO4·7H2O-0,75; ZnSO4·7H2O-0,25; (NH4)2SO4-0,5; мальтоза - 1,0; желатин - 10,0; дріжджовий автолізат - 0,15. Біомасу відділяють центрифугуванням, ферментативну активність визначають у надосадовій рідині. Для визначення активності ферменту як субстрат використовують нативний білок еластин, отриманий шляхом екстракції з бичачих шийних зв'язок ("Реахим", Росія). Еластазну активність визначають колориметрично за інтенсивністю забарвлення розчину при ферментативному гідролізі конго-рот еластину [4]. Інкубаційна суміш містить 2,5мл 0,01 М фосфатного (або трисового) буфера рН 7,5, 5мг еластину, забарвленого 0,002 % розчином конг-рот та 1мл розчину культуральної рідини. Суміш інкубують протягом 5год. при 37 °C. Реакцію зупиняють, витримуючи пробірки з реакційною сумішшю на бані з льодом протягом 30хв. Негідролізований еластин відділяють центрифугуванням протягом 10хв. при 3000g. Інтенсивність забарвлення вимірюють на спектрофотометрі СФ-26 при довжині хвилі 515нм. За одиницю активності приймають кількість ферменту, яка каталізує гідроліз 1мг субстрату за годину в стандартних умовах. Активність еластази у культуральній рідині штама-продуцента Bacillus thuringiensis ІMB В7324 оптимальних умовах досягає значень 50-55од/мл, або 14-16од/мг білка. Перевагою запропонованого продуцента є його здатність синтезувати високоактивну та термостабільну еластазу, відсутність сезонності та токсичності, що є технологічно ефективним. Ферментний препарат, одержаний з цієї культури осадженням сульфатом амонію (90 % насичення) здатний ефективно працювати при фізіологічних значеннях рН середовища з помітним піком активності при рН 6,0-7,0. Фермент стабільний при зазначених вище значеннях рН впродовж 24 годин. Ферментний препарат активний від 10 до 60 °C (оптимум при 37-40 °C). Термостабільність препарату при 30 °C повністю зберігається впродовж доби; при 50 °C-120хв. Препарат зберігає активність впродовж 1 року. Запропонований фермент може знайти використання у медико-технологічних процесах. Таким чином, отримано новий штам, який, у порівнянні з відомими, має інші культуральні ознаки і є новою культурою зі стійкими біохімічними властивостями. Джерела інформації: 1. Мацелюх О.В. Отримання мутантів Bacillus sp. з підвищеною здатністю до синтезу еластази // Біотехнологія.-2010.-3, №2 - С.42-47. 2. Мацелюх О.В., Нідялкова Н.А., Варбанець Л.Д. Еластолітичні ензими мікроорганізмів // Біотехнологія.-2010.-3, №4 - С.20-28. 3. Колтукова Н.В., Бондарчук А.А., Захарова И.Я. Разделение, очистка и некоторые свойства протеиназ Bacillus mesentericus II Микроб, журнал.-1982.-44, №3. - С.12-15. 4. Trombridg G.O., Moon H.D. Purification of human elastase // Proc. Soc. Exp. Biol. Med.-1972. – V.141, №3. – P.928-931. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 50 Штам Bacillus thuringiensis – продуцент позаклітинної еластази, що зареєстрований в Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України під номером ІМВ В-7324. Комп’ютерна верстка Н. Лисенко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2