Штам бактерій bacillus subtilis – продуцент позаклітинної днк, збагаченої неметильованим цитозином

Штам бактерій Bacillus subtilis TMB B-7108 продуцент позаклітинної ДНК, збагаченої неметильованим цитозином, яка має імуностимулюючу активність. (19) (21) a200505271 (22) 02.06.2005 (24) 26.11.2007 (72) ЯНІШ ЮРІЙ ВАДИМОВИЧ, UA, ОЛІШЕВСЬКИЙ СЕРГІЙ ВАЛЕРІЙОВИЧ, UA, КОЗАК В'ЯЧЕСЛАВА ВАДИ МІВН А, U A, ШЛЯХОВЕНКО ВОЛОДИ МИР ОЛЕКСІЙОВИЧ, U A (73) ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ПАТОЛОГІЇ, ОНКОЛОГІЇ І РАДІОБІОЛОГІЇ ІМ. Р.Є. КАВЕЦЬКОГО Н АН УКРАЇНИ, U A (56) UA 56348 C2, C12N1/20, 15.05.2003 EP 1302541 A1, C12N15/12, 16.04.2003 3 80995 Протягом серпня - вересня 2002р, під час польового сезону в Сумській області, було відібрано, понад двадцять ґрунтових проб на території заплави р. Сейм та на південно західних схилах Середньоруської височини. Запропонований до патентування штам Bacillus subtilis GP 1-807-03 було одержано у липні 2003р. із зразка ґрунту, відібраного поблизу села Голубкове Путивльського району. Разом із зразками чистої культури бактерій до Депозитарію мікроорганізмів ІМБВ передано паспорт штаму, в якому докладно описано спосіб його одержання. Культурально - морфологічні ознаки Вегетативні клітини зазначеного штаму Bacillus subtilis являють собою грампозитивні палички. Вирощені на м'ясо-пептонному агарі (ΜΠ Α), вони мають розміри 0,8 x 4,0 ¸ 6,0мкм, з прямо обмеженими кінцями; деякі клітини досягають у довжину 7,0 ¸ 8,0мкм. Колонії мають круглу форму, матову (оксамитову) поверхню, світло-сіре забарвлення, чіткий рівний край, пастоподібну консистенцію; колонії не заглиблюються у поживне середовище. На рідких поживних середовищах (зокрема на мясо- чи рибо-пептонному бульйонах, - МПБ та РПБ відповідно) бактерія вже за добу утворює досить потужну м'яку плівку, сірувато-білого кольору спочатку, практично білу - з другої доби культивування. В цей же час на дні флаконів формується ніжний осад, до якого наприкінці культивування (6-9-та доба) долучаються більші, нібито створожені фрагменти поверхневої плівки. Сама плівка матова, з характерними кристамифебінцями 0,2 - 0,5мм заввишки. Товщина плівки досягає інколи 3-4мм. На рідких середовищах описаний штам утворює довгі пакети стрептобацил, або навіть кубельця надзвичайно видовжених ниткоподібних клітин, які виникли внаслідок неповного розвитку або відсутності перетинок між клітинами; це цілком збігається з морфологічними характеристиками виду Bacillus subtilis. Принаймні протягом перших дво х діб культивування вегетативні клітини рухомі. По поверхні напіврідкого агаризованого середовища, або ж по поверхні звичайного ΜΠΑ, нещодавно розлитого в чашки Петрі, а тому ще вкритого дрібними краплями водного конденсату всуціль, бактерії активно розповсюджуються в усі боки від посівного штриха. Вони утворюють суцільний газон у вигляді ніжної сіруватої плівки з тендітним помереженим краєм, який на другу добу досягає країв чашки за умови центрального розташування вихідного штри ха. Через дві доби росту на щільному середовищі (ΜΠ Α) в культурі поступово розпочинається споруляція. Спори розміром 0,6 x 1,5мкм, із заокругленими кінцями, овальні; клітини, які вміщують спори, не роздуваються. Розташування спор центральне, зрідка - субтермінальне. Одночасно з появою перших клітин з проспорою в культурі з'являються старі грамнегативні клітини, або - порожні клітинні стінки; якщо фарбувати фіксовані препарати 4 еозином-метиленовим синім за Май-Грюнвальдом, виявляється їх оксифільність. Протрава на основі таніну візуалізує перитрихіально розташовані джгутики, принаймні у першу добу росту на щільному середовищі, коли молода культура демонструє енергійну експансію на його поверхні. Вказаний штам Bacillus subtilis гарно росте на синтетичному поживному середовищі Luria-Bertani з дріжджовим екстрактом, як на рідкому, так і агаризованому. При рості бактерій на будь-якому із згаданих рідких поживних середовищ значення рН культуральної рідини змінюються від 7,2 до 8,0 ¸ 8,6. Фізіолого - біохімічні властивості Штам Bacillus subtilis GP1-807-03 являє собою аеробний мікроорганізм з ознаками факультативної термофілії: на рідких середовищах він добре росте при температурі до 59°С, не змінюючи своїх ознак. Проте при кількадобовому культивуванні за умов гіпертермії (45 - 59°С) нами відмічено перехід великого відсотку (до 20%) вегетативних клітин в зворотну L-форму, яка швидко ревертує в нормальну бацилярну форму, здатн у утворювати спори при зниженні температури хоча б до 42°С. Аналогічно провокує утворення L-форм і дія комплексу вітамінів С та К3 (2,0мкг/мл та 40нг/мл відповідно). Виникненню L-форм передує наявність гетероморфного росту у вигляді дуже тонких і дуже довгих (0,2 x 20,0 ¸ 30,0мкм) утворень; овальні структури протопласту, - оксифільні, грампозитивні, розміром 3,0 x 4,0мкм, з'являються на кінцях згаданих ниткоподібних утворень. Дія вітамінного комплексу викликала L трансформацію за іншою схемою: масове утворення так званих елементарних тілець дрібних сфероїдів діаметром 0,2 - 0,3мкм. Штам Bacillus subtilis GP 1-807-03 під час росту на відповідних середовищах розріджує желатину, розщеплює казеїн та крохмаль, утворює кислоту з маніту та глюкози. Мікроорганізм неауксотрофний, каталазопозитивний, позитивний щодо тесту Voges-Proskauer [5]. Бактерії описуваного штаму екскретують у позаклітинний простір фрагменти ДНК, збагачені залишком неметильованого цитозину. Штам Bacillus subtilis GP1-807-03 може бути використаний як продуцент біологічно-активної ДНК-вмісної субстанції, якій притаманні імуномодулюючі, ад'ювантні та протипухлинні властивості. Культивування штаму може здійснюватися на загальноприйнятих середовищах: ΜΠ Α, РП А, МПБ, РПБ, Luria-Bertani тощо. Воно може бути поверхневим (щільні середовища та рідкі середовища без перемішування) або глибинним у колбах на спеціальних коливальних пристроях чи на шуттель-апараті. Для довгострокового зберігання штаму використовуються біологічні пробірки з ΜΠΑ, що має скошену поверхню, під ватно-марлевими пробками з чарунковою покришкою. Після формування вираженого посівного штриха (на другу добу росту при 37°) пробірки вміщують у 5 80995 звичайний холодильник при 4°С; незважаючи на поступове підсихання середовища ендоспори, що встигли утворитися, дають змогу поновлювати свіжу культур у у будь-який час. Тому пересівати колекційний штам на свіже поживне середовище достатньо всього 3-4 рази на рік. В цьому також полягає одна з переваг представників родини Bacillaceae перед представниками родини Eubacteriaceae стосовно їх промислового культивування. Зовнішніми чинниками, що впливають на перебіг вивільнення фрагментів ДНК бактеріями штаму Bacillus subtilis GP 1-807-03, є в першу чергу температурні умови їх культивування. Культуру бактерій вирощували на РПБ, при температурі 37° або 45°С, - залежно від характеру планованого дослідження. Щодоби з певної аліквоти культурального середовища центрифугуванням (6000 об/хв) видаляли вегетативні клітини бацил та їх спори. ДНК з культуральної рідини виділяли згідно [8]. Електрофорез матеріалу виконували в плоскому агарозному гелі; надалі гель обробляли розчином бромистого етидію, після чого фотографували в УФ світлі трансілюмінатора. Встановлено, що культивування за стандартних умов (при 37°) на РПБ призводить до специфічно модульованого накопичення в культуральному середовищі молекул ДНК з неметильованим цитозином. Рівень загальної ДНК у культуральному середовищі Bacillus subtilis GP1807-03 коливається в чіткій протифазі з вмістом в ній неметильованих CG-послідовностей, причому вміст цей, залежно від часу культивування, має чітко виражений тримодальний профіль (Фіг.1). На відміну від цього, вирощування за умов гіпертермії (45°С) демонструє пряму кореляцію між накопиченням у к ультуральному середовищі Bacillus subtilis GP 1-807-03 позаклітинної ДНК та відсотковим представництвом в ній динуклеотидів, які містять неметильований цитозин (Фіг.2). Згідно літературних даних [9] вивільнення геномної ДНК з бактеріальних клітин та накопичення її в культуральній рідині можна пояснити присутністю в бактеріальному геномі дефектних профагових елементів. Подальші дослідження продемонстрували, що екскретована бактеріями ДНК}і поліаніонна за своїми властивостями, викликає зниження сумарного негативного поверхневого заряду та xпотенціалу клітин асцитного раку Ерліха (АРЕ) - за рахунок утворення дифузного шару позитивно заряджених протиіонів (Фіг.3). Вказаний факт може свідчити про наявність позитивно заряджених ділянок молекули позаклітинної бактеріальної ДНК, відповідальних за звязування з негативно зарядженою поверхнею пухлинних клітин, принаймні - клітин АРЕ в експериментах in vitro. Суть винаходу підтверджує Фіг.4, який демонструє, що при культивуванні відомого штаму В. subtilis 7025 спостерігається відносно слабке накопичення позаклітинної ДНК в культуральній рідині, тоді як штам, що заявляється, (В. subtilis GP 1-807-03) є значно кращим продуцентом позаклітинної ДНК, збагаченої неметильованим 6 цитозином, у чому і полягає його основна перевага перед відомим штамом В. subtilis. Перелік фігур креслення Фіг.1 Динаміка накопичення ДНК у культуральному середовищі Bacillus subtilis при 37°С (1) та відносний вміст в ній CpGпослідовностей з неметильованим цитозином (2) Фіг.2 Динаміка накопичення ДНК у культуральному середовищі Bacillus subtilis при 45°С (1) та відносний вміст в ній CpGпослідовностей з неметильованим цитозином (2) Фіг.3 Розподіл за значенням x-потенціалу клітин АРЕ: контрольних (1); оброблених ДНК з культурального середовища Bacillus subtilis (2) Фіг.4 Молекулярна гетерогенність ДНК в складі ДНК-вмісної субстанції, о триманої з культурального середовища Bacillus subtilis штаму GP1-807-03 -(1) та штаму 7025 - (2). З - Маркер ДНК (Lambda DNA BstE II Digest). Використані джерела 1. Патент України №56348 на винахід "Штам бактерій Bacillus subtilis -продуцент протипухлинних цитотоксичних речовин", авт. Потебня Г.П. та ін. Заявл. 17.04.2001. Опубл. 15.05.03, Бюл. №5. 2. Затула Д.Г. Применение продуктов жизнедеятельности микроорганизма для получения противоопухолевой вакцины // Вопросы онкол - 1968, т. XIV, №4.-С. 75-79. 3. Затула Д.Г., Загоруйко Е.Е., Семерников В.А. Изменение активности антигенов клеток опухолей при обработке их продуктами метаболизма Bacillus mesentericus АБ - 56. // Эксперим онкол - 1985, т. 7, №4. - 53 -57. 4. Bergeu's manual of determinativ bacteriology. Edition 8-th / Ed. Buchanan PE, Gibbons KE. Baltimore, Williams S. Wilkins, 1974. 1268p. 5. Смирнов В.В., Резник СР., Сорокулова И.Б. Методические рекомендации по выделению и идентификации бактерий группы Bacillus subtilis mesentericus из организма человека и животных. К., 1980. - С. 26. 6. Krieg AM. CpG motifs in bacterial DNA and their immune effects // Annu Rev Immunol. - 2002. 20. - P. 709 - 760. 7. Krieg A.M., Yі А.К., Matson S., Waldschmidt TX, Bishop G.A., Teasdale R., Koretzky G.A., Klinman D.M. CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B-cell activation // Nature,-1995.-374(6522).P.6546-6549. 8. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; 567p. 9. Shingaki R, Kasahara Y, Inoue T, Kokegochi S, Fukui K. Chromosome DNA *. fragmentation and excretion caused by defective prophage gene expression in the early-exponential-phase culture of Bacillus subtilis // Can J Microbiol,-2003,-49. -P.31325. 7 80995 8