Штам bacillus subtilis – продуцент позаклітинної a-амілази

Штам бактерії Bacillus subtilis IMB В-7223 продуцент позаклітинної a-амілази. (19) (21) a200714207 (22) 18.12.2007 (24) 12.01.2009 (46) 12.01.2009, Бюл.№ 1, 2009 р. (72) АВДІЮК КАТЕРИНА ВОЛОДИ МИРІВНА, UA, ВАРБАНЕЦЬ ЛЮДМИЛА ДМИТРІВН А, UA, САФРОНОВА ЛАРИСА АН АТОЛІЇВН А, U A, БОРЗОВА НАТАЛІЯ ВІКТОРІВН А, U A, МАЦЕЛЮХ ОЛЕНА ВІКТОРІВН А, UA (73) ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ІМ. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО НАЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ НАУК УКРАЇНИ, UA 3 85337 ся. Після росту на глюкозному агарі у протоплазмі глобули не утворюються. На МПБ культура утворює плівку. Фізіолого-біохімічні властивості. Штам не росте в анаеробних умовах і при 10% NaCl, не гідролізує сечовину, не продукує аргинінгідролазу, дає позитивну реакцію Фогес-Проскауера, росте у присутності 7% NaCI, гідролізує крохмаль на казеїн, розріджує желатину. Ферментує глюкозу, арабінозу, ксилозу, маніт з утворенням кислоти без газу. Редукує нітрати, не має коагулазної та лецитиназної активностей. Відношення до вуглецевого живлення: культура добре засвоює широке коло вуглеводних субстратів: маніт, глюкоза, сахароза, фруктоза, маноза, рафіноза, арабіноза, ксилоза, картопляний крохмаль, соєве борошно, розчинний крохмаль, трегалоза, рамноза, галактоза, лактоза (у порядку зростання питомої активності ферменту), більшість з яких забезпечує також і синтез a-амілази. Картопляний крохмаль у концентрації 0,1% у середовищі росту викликає підвищення амілолітичної активності культури у 8 разів. Відношення до азотного живлення: краще засвоює нітратний азот. Із органічних джерел азоту асимілює сечовину та гліцин. Біосинтетичну активність забезпечує нітрат натрію. Штам нетоксичний, авірулентний. Відношення до кисню: облігатний аероб. Відношення до температури: мезофіл, оптимальна температура для росту та біосинтезу ферменту 37-42°С. Відношення до кислотності поживного середовища: культура росте в діапазоні рН від 6,0 до 10,0. Оптимальне вихідне значення рН середовища для синтезу ферменту становить 7,0. Поживним середовищем для ферментації є середовище наступного складу, (г/л): NaNO3 - 2; КН2РO4 - 1 ; MgSO4 x7 Н2 О - 0,5; КСl - 0,5; FeSO 4 x7 H2О - 0,015, картопляний крохмаль - 1, вихідне значення рН - 7,0. Вирощування культури проводять в глибинних умовах у колбах Ерленмейєра (500мл) на качалці, що робить 220об/хв (рівень аерації 8,5мг О2/лхгод) при 42°С протягом 4-6 діб. Засів поживного середовища проводили 5%-вим добовим інокулюмом. Біомасу відділяли центрифугуванням, ферментативну активність визначали у супернатанті. Як субстрат для визначення активності використовували розчинний крохмаль (OOO "Химлаборреактив"). Для визначення амілолітичної активності брали 2 пробірки і наливали в кожну по 2мл 1% розчину крохмалю (субстрату), інку бували в термостаті при температурі (30±2°С), 5-10хв. Потім, не виймаючи пробірки з термостату, додавали в першу 1мл дистильованої води (контрольна пробірка), в другу - 1мл робочого розчину ферменту (дослідна пробірка). Суміші швидко перемішували і витримували в термостаті протягом 10хв, використовуючи секундомір. Далі з кожної пробірки почергово відбирали по 0,1мл розчину і переносили в пробірки, які містили 10мл робочого розчину 4 йоду. Вміст пробірок перемішували. Через 5-10хв після змішування визначали оптичну щільність розчину колориметричним методом при 670нм в кюветах з товщиною поглинаючого світла 5мм. Контрольним розчином при колориметру ванні була дистильована вода (ГОСТ 20264.4-89). За одиницю активності приймали здатність ферменту при певних значеннях температури, рН і часу дії каталізувати до декстринів різної молекулярної маси 1 г крохмалю (температура 30±2°С). Для визначення протеолітичної активності використовували наступну методику. До 1мл фосфатного буфера (рН 7,5) додавали 1мл казеїну та 0,5мл ферментного розчину. У контрольну пробу наливали 1,5мл фосфатного буфера та 0,5мл казеїна. Пробірки витримували протягом 30хв при 37°С. Реакцію зупиняли додаванням 2,5мл трихлороцтової кислоти (10%). Залишки казеїну відфільтровували. Оптичн у густин у вимірювали на СФ при 276нм. Як субстрати для визначення глікозидазних активностей використовували пара-нітрофенільні похідні цукрів. Для визначення активності до 0,1мл розчину ферменту додавали 0,2мл 0,1М фосфатного буфер у (ФБ) рН 6,0 та 0,1мл 0,01М розчину субстрату у ФБ. Реакційну суміш інкубували протягом 10хвилин при температурі 37°С. Реакцію зупиняли додаванням 2мл 1М розчину бікарбонату натрію. Кількість пара-нітрофенолу, яка було відщеплена у результаті гідролізу, визначали колориметричним методом за поглинанням при 400нм Активність a-амілази у к ультуральній рідині штама-продуцента складає 0,81Од/мл. Загальна протеолітична активність складає 1,52ПА/мл. Також у культуральній рідині присутня (3галактозидазна активність - 0,1Од/мл. Фермент у вигляді культуральної рідини активний у діапазоні рН від 5,0 до 9,0, та у температурному діапазоні від 4 до 100°С (рН 8,2), з максимальною активністю при 90°С. Термостабільний, тобто при 60°С (рН 5,2) зберігається 100% активності протягом 180хв, у присутності СаСІ2 та NaCI зберігається 90% від максимальної активності при інкубації протягом 120хв при температурі 90°С. Встановлено, що при зберіганні та пересівах протягом 5 років рівень ферментативної активності штаму В. subtilis 147 не знижується. Штам зберігається у ліофілізованому стані та на твердих середовищах - МП А, Громико (МП А+сусло-агар), агаризованому середовищі Гаузе №2 під шаром стерильного вазелінової олії. Пересів 1 раз на рік. Перевагою запропонованого продуцента є його здатність синтезувати високоактивну та термостабільну a-амілазу. Запропонований фермент може знайти використання у харчовій промисловості, пивоварінні, текстильній промисловості. Таким чином, виділено новий штам, який, у порівнянні з відомими, має інші культуральні ознаки і є новою культурою зі стійкими біохімічними властивостями. 5 85337 Література: 1. Люджус Л.Л., Чекменева Т.М., Кунинский Д.Г. и др. Состояние производства и применение ферментных препаратов за рубежом. - М.: ВНИИСЭНТИ, 1986. - 72с. Комп’ютерна в ерстка В. Клюкін 6 2. Кичакова НА. Выделение и изучение свойств термостабильной a-амилазы Bacillus sp.: Автореф. дис. канд.биол.наук. – Киев, 1991. - 16с. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601