Спосіб відбору ендоспермових мутантів кукурудзи з поліпшеною якістю зерна

УКРАЇНА (19) UA 9923 (ІЗ) С1 (5D5 А01 НІ/04 ОПИС ДО ПАТЕНТУ ДЕРЖАВНЕ ПАТЕНТНЕ ВІДОМСТВО НА ВИНАХІД (54) СПОСІБ ВІДБОРУ ЕНДОСПЕРМОВИХ МУТАНТІВ КУКУРУДЗИ З ПОЛІПШЕНОЮ ЯКІСТЮ ЗЕРНА 1 (20)94311416,29.06.93 (21) 4946864/S U (22)20.06.91 (46)30.09.96. Бюл. № З (56) 1. Палий А.Ф. Генетические аспекты улучшения качества зерна кукурузы. Кишинев, Штиинца, 1989, с. 95. 2. Esen A. Cer. Chem, 1980, vol. 57, ISfc 2, p. 129-132. 3. Mlsra P.S., Barba-Ho R., Mertz E.T. Cer.Chem. 1973, Vol. 50, I* 2, p. 184-190. 4. Phodes A.P., BJarnason M., Pollmer W.G. J. Agric, Food Chem, 1979, Vol. 27, IV6, p.1266-1270. (71) Дніпропетровський державний університет (72) Феденко Володимир Савелійович, Стружко Віктор Степанович (73) Дніпропетровський державний університет (UA) (57) Способ отбора эндоспермовых мутантов кукурузы с улучшенным качеством зерна, включающий экстракцию размолотого зерна исследуемых образцов водным раствором спирта, определение значений оптической плотности экстрактов и идентификацию селекционно ценных эндоспермовых мутантов по изменению значений оптической плотности их экстрактов, по сравнению со средним, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что экстракцию проводят водным раствором изопропанола объемной концентрации 40-80%, определяют значения оптической плотности экстрактов при 315 и 260 нм, рассчитывают соотношение значений данных показателей и по его превышению в 1,3-1,7 раза, по сравнению со средним, идентифицируют зндоспермовые мутанты. ю О) Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству, в частности к генетическим исследованиям злаковых культурі и может быть использовано в селекционной практике для отбора хозяйственно ценных форм кукурузы с улучшенным биохимическим составом зерна. Применение селекционно-генетических приемов с использованием эндоспермовых мутаций позволяет создавать формы кукурузы с повышенным содержанием лизина и триптофана и сбалансированным по питательной ценности белковым комплексом [1]. При создании перспективных селекционных форм кукурузы возникает необходимость разработки экспрессных способов отбора эндоспермовых мутантов с улучшенным качеством зерна. Известные способы селекционной диагностики включают экстракцию размолотого зерна водноспиртовыми растворами с последующим определением содержания спирторастворимого белка (зеина) фотометрическими методами по поглощению окрашенного комплекса в результате обработки полученного экстракта красителем [2] или биуретовм реагентом [3]. Отбор эндоспермовых мутантов проводят по снижению содержания зеина в сравнении с обычными аналогами. К основным недостач хам указанных способов следует отнести трудоемкость и длительность операций по О 9923 количественному выделению белка, а также проведению анализа с использованием специфичных реагентов. Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является спо- 5 соб, включающий турбидимитрический тест проламина [4]. Согласно способу, навеску размолотого образца зерна кукурузы высушивают до постоянного оеса при 60° при пониженном 10 давлении и обрабатывают 70% раствором этанола. Образцы гомогенизируют и выдерживают в водяной бане при 60° в течение 1 часа, затем смесь повторно гомогенизируют и центрифугируют. К аликвоте суперната- 15 нзта прибавляют 0,2 М раствор хлористого натрия, дважды встряхивают в течение 30 минут инкубации и изиэряют оптическую плотность раствора при 590 нм на спектрофотометре Отбор селекционных форм куку- 20 рузы с улучшенным качеством зерна проводят по абсолютной величине поглощения или значению оптической плотности раствора в пересчете на содержание белка. Основными недостатками способа явля- 25 ются необходимость предварительной подготовки образца к анализу путем высушивания до постоянного веса, проведение количесгьениой экстракции проламина с поддержанием установленного темпера- 30 гурного режима, необходимость определения содержания белка, что, в конечном счете, ограничивает возможность экспрессдиагностики селекционного материала В основу изобретения поставлена зада- 35 ча ycoBept іенствования способа путем определения оптической плотности водноспиртового экстракта зерна при аналитических знамениях длины волны и проведения отбора по величине отношения 40 оптических плотностей для упрощения и ускорения селекционной диагностики. Поставленная задача осуществляется следующим образом. 45 Экстрагируют образцы размолотого зерна стандартной и исследуемой форм кукурузы 40-80% водным изипропиловым спиртом (по объему). Экстракт отделяют фильтрованием и измеряют оптическую 50 , "гтность при 315 и 260 нм на спектрофотометре и рассчитывают отношение оптически »плотностей при указанных длинах волн в качестве сравнительного показателя. Эндоспермовые мутанты кукурузы с улучшен- 55 ным качеством зерна определяют по возрастанию величины сравнительного показателя в 1,3-1,7 раза по отношению к обычным аналогам, используемым в качестве среднего образца. Значения аналитических длин волн (315 нм и 260 нм) определены экспериментально и соответствуют положению максимума и минимума в спектре поглощения экстракта, поэтому соотношение оптических плотностей обеспечивает максимальную контрастность установленного маркерного признака. В качестве форм кукурузы с улучшенным качеством зерна использованы эндоспермовые мутанты типа о2'о2, о2/о2 su2/su2 с установленными биохимическими характеристиками [1]. Способ иллюстрируется следующими примерами. Пример 1. Образец размолотого зерна (40 мг) обычной (А 204 +/+) и мутантной по гену опейк-2 кукурузы (А 204 о2/о2) экстрагируют 5 мл водного изопропанола различной концентрации (10-90% по объему) при комнатной температуре в течение 5 минут при постоянном встряхивании. Экстракт отделяют фильтрованием и измеряют оптическую плотность при 315 и 260 нм на спектрофотометре Спекорд М-40 в 1 см кювете. Определяют отношение указанных оптических плотностей (D315/D260) в качестве сравнительного показателя. Результаты определения сравнительного показателя экстрактов, полученных при различных концентрациях водного изопропанола, приведены D таблице 1 (данные статически достоверны, ошибка измерения не более 5%). Полученные результаты показывают, что при концентрациях водного изопропанола 40-80% наблюдаются наиболее контрастные различия между обычным аналогом и эндоспермовым мутантом (28-43%), и поэтому указанный интервал концентраций растворителя является оптимальным для проведения отбора. Пример 2. Анализируют аналогично примеру 1 образцы исходной (Wf 9 +/+) и мутантной (Wf o2/o2) форм кукурузы с использованием 70% водного изопропанола (табл.2). Пример 3. Проводят анализ аналогично примеру 1 образцов исходной (А 619 +/+) и MyTaHTHbix(A619o2/o2,A619su2/su2^opM кукурузы с использованием 70% водного изопропанола (табл.3). Пример 4. Аналогично примеру 1 анализируют эндоспермовые мутанты типа о2/о2 Su2/su2 (линии W 64 А, Мк 302, А 293, А 632) с использованием 70% водного изопропанола (табл.4). В качестве стандарта используют образцы исходных форм (линии А 204 +/+, Wf 9 +/+, А 619 +/+), значение сравнительного показателя D315/D26O которых составляет 9923 интервал 0,87-0,98 при экстракции 70% изопропанолом (примеры 1-3). По отношению к указанному интервалу значения сравнительного показателя исследуемых эндоспермовых мутантов (табл.4) повышены в 1,5-1,7 раза. В результате решения поставленной задачи достигнуто упрощение и ускорение отбора ценных селекционных форм кукурузы путем исключения операций по подготовке образца к анализу и сокращению времени экстракции. Таблица 1 Концентра Генотип ция водного изопропанола (% по объему) кукурузы 10 D315/D260 20 30 40 50 60 70 80 90 D315 D26O А 204 +/+ 0,25 0,49 0,51 А204о2/о2 А 204 +/+ А204о2/о2 А 204 +/+ А204о2/о2 А 204 +/+ А 204 о2/о2 А 204 +/+ А 204 о2/о2 А 204 +/+ А204о2/о2 А 204 +/+ А204о2/о2 А 204 +/+ А 204 о2/о2 А 204 +/+ А 204 о2/о2 0,27 0,30 0,45 0,49 0,71 0,54 0,83 0,56 0,80 0,58 0,55 0,48 0,70 0,36 0,54 0,16 0,23 0,58 0,49 0,73 0,67 0,85 0,71 0,83 0,69 0,77 0,73 0,50 0,55 0,59 0,41 0,43 0,18 0,22 0,47 0,61 0,62 0,73 0,84 0,76 1,00 0,81 1,04 0,79 1,10 0,87 1,19 0,88 1,26 0,89 1,05 * 0,92 1,02 1,15 1,32 1,28 1,39 1,37 1,43 1,18 Таблица 2 Генотип кукурузы D315/D26O Мутантная форма Исходная форма Wf9+/+ Wf9o2/o2 0,88±0,04 1,11 ±0,06 1,26 Таблица 3 Генотип кукурузы D315/D26O Мутантная форма Исходная форма А619+/+ А619о2/о2 А619о2/о2 su2/su2 О,98±О,ОЗ 1,32 ±0,07 1,28±0,04 1,35 1,31 9923 Таблица 4 Генотип кукурузы D315/D26O W 64 А о2/о2 su2/su2 Мк302о2/о2 su2/su2 A293o2/o2su2/su2 A632o2/o2su2/su2 1.33 ±0,06 1,47 ±0.05 1,35±0.08 1,68+0,05 Упорядник Замовлення 4558 Техред М.Моргентал Коректор Н. Милюкова Тираж Підписне Державне патентне відомство України, 254655, ГСП, КиТв-53, Львівська пл., 8 Відкрите акціонерне товариство "Патент", м. Ужгород, вул.Гагаріна, 101