Спосіб отримання антигену сибіркового для виготовлення референт-стандарту

Реферат: Спосіб отримання антигену сибіркового для виготовлення референт-стандарту, при якому використовують три авірулентні штами збудника сибірки: Bacillus anthracis Sterne 34F2, Bacillus anthracis 3/97 та Bacillus anthracis matrix II вакцина Ценковського (депоновані в Національному центрі штамів мікроорганізмів), які культивують 24 години на щільному поживному середовищі агар Хоттінгера (рН = 7,2±0,2, амінний азот 120±20 мг %), знімають отримані агарові культури шпателем. Додатково перевіряють отриману целюлярну масу на предмет споруляції та піддають автоклавуванню за температури 120 °C. Бактеріальну масу кожного штаму, після набуття сталої ваги, ретельно подрібнюють у фарфоровій ступці та змішують. Готовий антиген перевіряють за показниками: зовнішній вигляд, активність та специфічність. UA 99617 U (12) UA 99617 U UA 99617 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до ветеринарної медицини, а саме до ветеринарної мікробіології та біотехнології, і може бути використана для виготовлення діагностичних препаратів, зокрема до способів отримання антигену сибіркового для виготовлення референт-стандарту. В рутинній роботі діагностичних лабораторій при дослідженні матеріалу на наявність збудника сибірки керуються методичними вказівками "Лабораторная диагностика сибирской язвы у животных и людей, обнаружение возбудителя в сырье животного происхождения и объектах внешней среды", що затверджені 1 вересня 1986 року Головним управлінням ветеринарії Держагропрому СРСР та Головним управлінням карантинних інфекцій Мінздраву СРСР. Відповідно до пункту 1.1.2 даних вказівок, дослідження на сибірку проводять шляхом мікроскопії мазків, посівом на поживні середовища, постановки біопроби, за необхідності постановки реакції преципітації, а у людей - антраксинової проби. Техніка постановки реакції преципітації включає використання позитивних та негативних контролів. Як позитивний контроль необхідно використовувати стандартний сибірковий антиген. Існує патент України № 25400 від 30.10.1998 року "Антиген сибірковий стандартний для діагностики сибірки", відповідно до якого антиген виготовляють із продуктів життєдіяльності (екстрацелюлярного токсину) авірулентного вакцинного штаму K-79Z збудника сибірки. Штам вирощують в рідкому поживному середовищі, відділяють мікробну масу і фільтрують через стерилізуючі фільтри. В фільтраті культуральної рідини визначають за допомогою реакції дискпреципітації чи Асколі наявність специфічного сибіркового білка і його титр. Стерильний фільтрат використовують як стандартний сибірковий антиген для постановки реакції преципітації. Необхідно зазначити, що при використанні рекомендованих поживних середовищ (бульйон Хоттінгера, середовище 199 тощо), культуральна рідина буде кольорова, що ускладнить облік результатів досліджень. Тому, при вирішенні поставленої задачі із розробки способу отримання антигену сибіркового для виготовлення референт-стандарту, необхідним було розробити технологію, яка дозволить отримувати безбарвний, прозорий, специфічний та активний сибірковий антиген за можливості виготовлення його у промислових умовах на підприємствах біологічної промисловості. Найближчим до способу, що пропонується є спосіб, описаний в довіднику ветеринарних препаратів (1981) за редакції Д.Ф. Осідзе. При цьому технологія включає використання вірулентного збудника сибірки, який вирощують 24 години на щільному поживному середовищі, отримані колонії знімають шпателем та автоклавують за 120 °C і висушують до постійної ваги. Потім готують екстракт отриманої маси на стерильному фізіологічному розчині у співвідношенні 1:3000-1:5000, витримують 24 години та фільтрують. Отриманий фільтрат фасують в ампули чи флакони, укупорюють та піддають стерилізації автоклавуванням. В основу корисної моделі, що заявляється, поставлено задачу використання трьох авірулентних штамів (класична схема виготовлення антигену сибіркового передбачає використання одного вірулентного штаму) збудника сибірки для отримання антигену та додаткову перевірку їх, з метою біобезпеки, на предмет споруляції (класична схема не передбачає стадії перевірки отриманої целюлярної маси на предмет споруляції): Bacillus anthracis Sterne 34F2, Bacillus anthracis 3/97 та Bacillus anthracis matrix II вакцина Ценковського. Дані штами депоновано в Національному центрі штамів мікроорганізмів, вони мають типові для збудника сибірки біологічні та антигенні властивості, дають чітке кільце преципітації в реакції з преципітуючими сироватками. При цьому штами Bacillus anthracis Sterne 34F2 та Bacillus anthracis 3/97 - безкапсульні авірулентні, а штам Bacillus anthracis matrix II вакцина Ценковського - капсульний авірулентний. Спосіб отримання антигену сибіркового для виготовлення референт-стандарту, що пропонується, може бути описано наступними прикладами. Приклад 1. Антиген готують із целюлярної маси наступним чином: отримують добову агарову культуру (агар Хоттінгера рН=7,2±0,2, амінний азот 120±20 мг %) авірулентних штамів Bacillus anthracis Sterne 34F2, Bacillus anthracis 3/97 та Bacillus anthracis matrix II вакцина Ценковського (кожного окремо). Приклад 2. Знімають отримані агарові культури шпателем, з метою біобезпеки, перевіряють їх на предмет відсутності споруляції та піддають автоклавуванню за температури 120 °C. Приклад 3. Споруляцію визначають шляхом виготовлення мазка із агарової культури та фарбуванням його 0,5 %-вим водним розчином малахітового зеленого протягом 5 хвилин над водою, що кипить. Після цього протягом 30 секунд мазок дофарбовують сафраніном. При цьому спори будуть мати яскраво-зелений колір, а вегетативні форми - червоно-коричневий. 1 UA 99617 U 5 10 15 Наявність спор не допускається. Приклад 4. Під час автоклавування бактеріологічна маса стає бурого кольору. Ємності із бакмасою після автоклавування поміщають до термостата для висушування до сталої ваги за температури 37 °C. Приклад 5. Після набуття сталої ваги, бактеріальну масу кожного штаму ретельно подрібнюють у фарфоровій ступці та змішують у співвідношенні: Bacillus anthracis matrix II вакцина Ценковського - 60 %; Bacillus anthracis Sterne 34F2-20 %; Bacillus anthracis 3/97-20 %. Приклад 6. Отриману суміш екстрагують на холоді в стерильному фізіологічному розчині у співвідношенні 1:3000-1:5000 протягом 24 годин. Після цього екстракт фільтрують та фасують у флакони чи ампули і піддають стерилізації автоклавуванням. Приклад 7. Готовий антиген перевіряють за показниками: зовнішній вигляд, активність та специфічність. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 20 25 30 Спосіб отримання антигену сибіркового для виготовлення референт-стандарту, який відрізняється тим, що використовують три авірулентні штами збудника сибірки: Bacillus anthracis Sterne 34F2, Bacillus anthracis 3/97 та Bacillus anthracis matrix II вакцина Ценковського (депоновані в Національному центрі штамів мікроорганізмів), які культивують 24 години на щільному поживному середовищі агар Хоттінгера (рН = 7,2±0,2, амінний азот 120±20 мг %), знімають отримані агарові культури шпателем, додатково перевіряють отриману целюлярну масу на предмет споруляції та піддають автоклавуванню за температури 120 °C, бактеріальну масу кожного штаму, після набуття сталої ваги, ретельно подрібнюють у фарфоровій ступці та змішують у співвідношенні: Bacillus anthracis matrix II вакцина Ценковського - 60 %; Bacillus anthracis Sterne 34F2 - 20 %; Bacillus anthracis 3/97 - 20 %, а готовий антиген перевіряють за показниками: зовнішній вигляд, активність та специфічність. Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2