Нові методи імунотерапії в лікуванні нейрональних пухлин та пухлин головного мозку

Реферат: Винахід належить до пептиду, що включає безперервний фрагмент амінокислот відповідно до SEQ ID № 3, який індукує Т-клітинну перехресну реакцію з вказаним пептидом, де зазначений пептид має загальну довжину між 8 і 100 амінокислотами і здатний стимулювати Т-клітини CD4 або CD8, для використання в імунотерапевтичних методах, зокрема в імунотерапії раку, в композиціях вакцин для викликання протипухлинних імунних реакцій. UA 101810 C2 (12) UA 101810 C2 UA 101810 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Цей винахід відноситься до пептидів, нуклеїнових кислот та клітин для використання в імунотерапевтичних методах. Зокрема, цей винахід стосується імунотерапії раку. Крім того, цей винахід відноситься до епітопів пухлино-асоційованих пептидів цитотоксичних Т-лімфоцитів (CTL), разом або в поєднанні з іншими пухлино-асоційованими пептидами, котрі служать активними фармацевтичними інгредієнтами композицій вакцин, стимулюючих протипухлинні імунні реакції. Цей винахід відноситься до 11 нових пептидних послідовностей та їхніх варіантів, одержаних з молекул HLA класу I і II пухлинних клітин людини, котрі можуть використовуватись в композиціях вакцин для викликання протипухлинних імунних реакцій. Рівень техніки Гліоми - це пухлини головного мозку, які мають походження з гліальних клітин у нервовій системі. Гліальні клітини, які зазвичай називаються нейроглії чи просто глія, є ненервовими клітинами, котрі забезпечують підтримку та харчування клітин, утримують гомеостаз, утворюють мієлін та беруть участь в передачі сигналів в нервовій системі. Дві найбільш важливі підгрупи гліом - це астроцитоми та олігодендроцитоми, названі відповідно до типу нормальних гліальних клітин, з яких вони походять (астроцити або олігодендроцити, відповідно). Мультиформна гліобластома (далі іменується "гліобластома"), що належить до підгрупи астроцитом, є найбільш типовою злоякісною пухлиною мозку у дорослих людей, що становить приблизно 40 % усіх злоякісних пухлин мозку та близько 50 % гліом (CBTRUS, 2006). Вона агресивно втручається у центральну нервову систему та відзначається найвищим рівнем злоякісності (клас IV) серед усіх гліом. Хоча є стабільний прогрес в лікуванні цього захворювання, завдяки досягненням в нейровізуалізації, мікрохірургії, різноманітним варіантам лікування і препаратам, таким як темозоломід та опромінювання, гліобластоми залишаються невиліковними (Macdonald, 2001; Burton and Prados, 2000; Prados and Levin, 2000). Смертність від цієї пухлини мозку дуже висока: середня тривалість життя дорівнює від 9 до 12 місяців після першого діагнозу. 5-річна виживаність в період з 1986 по 1990 рік становила 8.0 %. На даний час, п'ятирічна виживаність після інвазивного лікування, включаючи повне видалення пухлини, все ж таки менше 10 % (Burton and Prados, 2000; Nieder et al., 2000; Napolitano et al., 1999; Dazzi et al., 2000). Відповідно, існує велика медична потреба в альтернативному і ефективному терапевтичному методі. Пухлинні клітини гліобластом є найбільш недиференційованими серед пухлин мозку, отже клітини пухлини мають великий потенціал міграції та проліферації і є високо-інвазивними, що пояснює дуже несприятливий прогноз. Гліобластоми призводять до смерті внаслідок швидкого, агресивного та інфільтративного росту в мозку. Тип інфільтративного росту відповідає за нерезектабельний характер цих пухлин. Гліобластоми також відносно резистентні до опромінювання та хіміотерапії, і тому випадки рецидивів після курсу лікування є частими. Крім того, імунна реакція на неопластичні клітини є достатньо неефективною, з точки зору повного знищення усіх неопластичних клітин після хірургічного видалення та променевої терапії (Roth and Weller, 1999; Dix et al., 1999; Sablotzki et al., 2000). Гліобластоми розділяються на первинні гліобластоми (de novo) та вторинні гліобластоми, в залежності від різниці в генному механізмі протягом злоякісної трансформації недиференційованих астроцитів або гліальних прекурсорних клітин. Вторинна гліобластома зустрічається у людей віком до 45 років. Протягом, в середньому, 4-5 років вторинна гліобластома розвивається з астроцитоми більш низької злоякісності в недиференційовану астроцитому. І навпаки, первинна гліобластома, переважно, зустрічається у старших людей, з середнім віком 55 років. В цілому, первинна гліобластома є швидкоплинною гліобластомою, яка характеризується прогресуванням пухлини протягом 3 місяців з того стану, коли не виявлено ніяких клінічних або патологічних аномалій (Pathology and Genetics of the Nervous Systems. 2939 (IARC Press, Lyon, France, 2000)). Гліобластома мігрує по мієлінованих нервах та широко розповсюджується в центральній нервовій системі. В більшості випадків хірургічне втручання має лише обмежений тривалий терапевтичний ефект (Neurol. Med. Chir. (Tokyo) 34, 91-94, 1994; Neurol. Med. Chir. (Tokyo) 33, 425-458, 1993; Neuropathology 17, 186-188, 1997) (Macdonald, 2001; Prados and Levin, 2000). Клітини злоякісної гліоми уникають детекції імунною системою хазяїна, оскільки вони генерують імуно-супресивні речовини, що погіршують проліферацію T-клітин та виробництво імуно-стимулюючого цитокіну IL-2 (Dix et al., 1999). Внутрішньочерепні неоплазми можуть виникати з будь-яких конструкцій чи типів клітин, присутніх в ЦНС, включаючи мозок, м'які мозкові оболонки, гіпофіз, череп і навіть залишкові ембріональні тканини. Загальна щорічна захворюваність на первинні пухлини мозку в Сполучених Штатах становить 14 випадків на 100 000 людей. Найбільш типовими первинними пухлинами мозку є менінгіоми, які представляють 27 % від усіх первинних пухлин мозку, та 1 UA 101810 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 гліобластоми - 23 % від усіх первинних пухлин мозку (в той час як гліобластоми нараховують 40 % злоякісних пухлин мозку у дорослих). Більшість з цих пухлин мають агресивну дію та високу злоякісність. Первинні пухлини мозку - найбільш розповсюджені солідні пухлини у дітей, і вони є второю найчастішою причиною смерті від раку у дітей, після лейкемії. Пошук ефективних методів лікування гліобластом у пацієнтів все ще триває. Ведуться дослідження в галузі імунотерапії, або лікування із залученням імуної системи, у боротьбі з цими неопластичними клітинами. Перші багатообіцяючі результати були отримані в імунотерапевтичних дослідженнях у людей, коли індукувалися антиген-специфічні реакції CTL, що вели до тривалої середньої виживаності, в порівнянні з застосуванням стандартного лікування, та супроводжувалися мінімальною токсичністю (Heimberger et al., 2006). Отже, проблема, яка вирішувалася даною заявкою, полягала у знаходженні нового ефективного та безпечного варіанту лікування пухлин мозку та поліпшення стану пацієнтів без використання хіміотерапевтичних препаратів чи інших речовин, котрі можуть викликати серйозні побічні ефекти. Стислий опис принципу винаходу Всі терміни, що використовуються в цьому винаході, мають наведені нижче визначення, якщо не зазначається інше. Термін "пептид" використовується тут для визначення ряду амінокислотних залишків, з'єднаних один з одним, як правило, пептидними зв'язками між альфа-аміно- та карбонільною групами суміжних амінокислот. Зазвичай пептиди мають довжину 9 амінокислот, але можуть мати довжину лише 8 амінокислот чи досягати довжини 14 амінокислот. Термін "олігопептид" використовується тут для визначення ряду амінокислотних залишків, з'єднаних один з одним, як правило, пептидними зв'язками між альфа-аміно- та карбонільною групами суміжних амінокислот. Довжина олігопептиду не є критичною для винаходу, якщо в ньому вміщені належний епітоп чи епітопи. Олігопептиди, як правило, за довжиною є меншими, ніж приблизно 30 амінокислот, та більшими, ніж приблизно 14 амінокислот. Термін "поліпептид" означає ряд амінокислотних залишків, з'єднаних один з одним, як правило, пептидними зв'язками між альфа-аміно- та карбонільною групами суміжних амінокислот. Довжина поліпептиду не є критичною для винаходу, якщо він вміщує належні епітопи. На відміну від термінів "пептид" чи "олігопептид", термін "поліпептид" вживається для визначення білкових молекул, які мають довжину більш ніж приблизно 30 залишків. Пептид, олігопептид, білок чи полінуклеотид, що кодує таку молекулу, є "імуногенним" (тобто, "імуногеном" в рамках цього винаходу), якщо він здатний індукувати імунну реакцію. У випадку цього винаходу, імуногенність більш специфічно визначена як здатність індукувати реакцію, де посередником виступають клітини CTL (цитотоксичні Т-лімфоцити). Отже, "імуноген" буде молекулою, здатною індукувати імунну реакцію, та у випадку цього винаходу, - молекулою, здатною індукувати CTL-реакцію. T-клітинний "епітоп" є молекулою короткого пептиду, яка зв'язується з МНС-молекулою класу I чи II та згодом розпізнається T-клітиною. Епітопи T-клітин, що зв'язуються з MHCмолекулами класу I, як правило, мають довжину 8-14 амінокислот, і найбільш типовою є довжина 9 амінокислот. Епітопи T-клітин, що зв'язуються з MHC-молекулами класу II, як правило, мають довжину 12-30 амінокислот. У випадку епітопів, котрі зв'язуються з MHCмолекулами класу II, один і той самий T-клітинний епітоп може займати спільний коровий сегмент, але мати різну довжину карбоксильно- та аміно-термінальних бокових послідовностей внаслідок того факту, що кінці пептидної молекули не заглиблені у структуру пептиднозв'язуючої "кишені" МНС-молекули класу II, як в пептидно-зв'язуючій "кишені" MHC-молекули класу І. Існують три різні генетичні локуси, які кодують МНС-молекули класу I: HLA-A, HLA-B та HLAC. HLA-Al, HLA-A2 та HLA-A11 є прикладами різних MHC-молекул класу І, що можуть експресуватися з цих локусів. Посилання на ДНК-послідовність в цьому винаході включає однониткові та двониткові ДНК. Отже, конкретна послідовність, якщо контекст не передбачає іншого, відноситься до однониткової ДНК такої послідовності, дуплексу такої послідовності з її комплементом (двониткова ДНК) та комплементу такої послідовності. Термін "кодуюча ділянка" відноситься до тієї частини гену, яка природним чи нормальним способом кодує продукт експресії того гену в його природному геномному середовищі, тобто, до ділянки, що кодує in vivo природний продукт експресії гену. Кодуюча ділянка може бути з нормального гену, або гену, що мутував чи був змінений, або навіть бути з послідовності ДНК чи гену, повністю синтезованого в лабораторії з використанням методів, добре відомих досвідченим фахівцям в галузі синтезу ДНК. 2 UA 101810 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Термін "нуклеотидна послідовність" відноситься до гетерополімеру дезоксирібонуклеотидів. Нуклеотидна послідовність, що кодує конкретний пептид, олігопептид чи поліпептид, може мати природне походження чи створюватися синтетичним шляхом. В цілому, сегменти ДНК, що кодують пептиди, поліпептиди та білки цього винаходу, збираються з фрагментів кДНК та коротких олігонуклеотидних лінкерів, або з серії олігонуклеотидів, для одержання синтетичного гену, здатного експресуватися в рекомбінантній транскрипційній одиниці, яка вміщує регуляторні елементи, одержані з мікробного чи вірусного оперону. Термін "продукт експресії" означає поліпептид або білок, котрий є природним трансляційним продуктом гену та будь-якої нуклеїново-кислотної послідовності, що кодує еквіваленти, які є результатом деградації генетичного коду, і також кодує ті ж амінокислоти. Термін "фрагмент", стосовно кодуючої послідовності, означає частину нуклеїнової кислоти, яка вміщує менш ніж повну кодуючу ділянку, і продукт експресії якої зберігає по суті ту ж біологічну функцію чи діяльність, що й продукт експресії повної кодуючої ділянки. Термін "сегмент ДНК" відноситься до полімеру ДНК, у формі окремого фрагменту чи як компонент більшої структури ДНК, що одержаний з ДНК, виділеної принаймні один раз по суті в чистій формі, тобто, без забруднюючих ендогенних матеріалів та в кількості чи концентрації, яка дає змогу ідентифікувати, виконувати маніпуляції та відновлювати сегмент і його складові нуклеотидні послідовності за допомогою стандартних біохімічних методів, наприклад, з використанням вектору клонування. Такі сегменти надаються у формі відкритої рамки зчитування, без порушень внутрішніми нетрансльованими послідовностями, чи інтронами, які зазвичай присутні в еукаріотичних генах. Послідовності нетрансльованих ДНК можуть бути присутні по низхідній від відкритої рамки зчитування, де вони не заважають маніпуляціям або експресії кодуючих ділянок. Термін "праймер" означає коротку нуклеїново-кислотну послідовність, котра може бути спарена з однією ниткою ДНК та надає вільний 3'OH-кінець, на якому ДНК-полімераза розпочинає синтез дезоксирібонуклеотидного ланцюгу. Термін "промотор" означає ділянку ДНК, котра включена у зв'язування РНК-полімерази для ініціації транскрипції. Термін "виділений", чи "ізольований" означає, що матеріал видаляється зі свого первісного середовища (наприклад, природного середовища, якщо він має природне походження). Наприклад, природно існуючий полінуклеотид чи поліпептид, присутній у живих тварин, не є виділеним, але той самий полінуклеотид чи поліпептид, відокремлений від якихось чи всіх співіснуючих матеріалів в природній системі, є виділеним. Такі полінуклеотиди можуть бути часткою вектору, та/або такі полінуклеотиди чи поліпептиди можуть становити частину композиції і продовжувати бути виділеними, якщо такий вектор чи композиція не є частиною свого природного середовища. Полінуклеотиди та рекомбінантні чи імуногенні поліпептиди, розкриті відповідно до цього винаходу, також можуть бути в "очищеній" формі. Термін "очищений" не вимагає абсолютної чистоти; він має на увазі відносне визначення та може включати препарати високого ступеню очищення або препарати, які тільки частково очищені, в тому сенсі, як розуміються такі терміни спеціалістами в цій галузі. Наприклад, окремі клони, виділені з бібліотеки кДНК, були умовно очищені до електрофорезної однорідності. Очищення вихідного матеріалу чи природного матеріалу принаймні на порядок величини, переважно на два-три порядки, та більш переважно, на чотири- п'ять порядків величини, чітко передбачається в цьому винаході. Крім того, заявлений поліпептид, котрий має чистоту переважно в 99.999 %, або принаймні в 99.99 % чи 99.9 %; і навіть бажано 99 % за вагою, чи більше, також чітко пропонується. Нуклеїнові кислоти та продукти експресії поліпептидів, що розкриваються в цьому винаході, а також вектори експресії, які вміщують такі нуклеїнові кислоти та/або поліпептиди, можуть бути в "збагаченій формі". Термін "збагачений" в тому виді, в якому він використовується тут, означає, що концентрація матеріалу принаймні в 2, 5, 10, 100 або 1000 разів перевищує його природну концентрацію (наприклад), переважно 0.01 %, за вагою, принаймні переважно приблизно 0.1 % за вагою. Також передбачаються збагачені препарати приблизно в 0.5 %, 1 %, 5 %, 10 % та 20 % за вагою. Послідовності, структури, вектори, клони та інші матеріали, які складають цей винахід, можуть переважно бути у збагаченій чи виділений формі. Термін "активний фрагмент" означає фрагмент, що генерує імунну реакцію (тобто, має імуногенну функцію) при введенні, разом чи як додатково з прийнятним ад'ювантом, тварині, наприклад, ссавцю, такому як кролик чи миша, і також включаючи людину. Така імунна реакція має вид стимуляції реакції CTL у тварини-реципієнта, такої як людина. Альтернативно, "активний фрагмент" також може використовуватись для індукування реакції CTL in vitro. 3 UA 101810 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 В цьому винаході терміни "частка", "сегмент" і "фрагмент", якщо вони використовуються по відношенню до поліпептидів, означають безперервну послідовність залишків, таких як амінокислотні залишки, причому ця послідовність утворює підгрупу більшої послідовності. Наприклад, якщо поліпептид був підданий обробці будь-якою з типових ендопептідаз, таких як трипсин або химотрипсин, олігопептиди, одержані в результаті такої обробки, будуть представлять частки, сегменти чи фрагменти початкового поліпептиду. Це означає, що будьякий такий фрагмент буде обов'язково вміщувати, як частину своєї амінокислотної послідовності, сегмент, фрагмент або частину, яка є по суті ідентичною, якщо не повністю ідентичною, послідовності від SEQ ID NO: 1 до SEQ ID NO: 11, котра відповідає природним або "вихідним" білкам послідовностей від SEQ ID NO: 1 до SEQ ID NO: 11. Якщо такі терміни використовуються стосовно полінуклеотидів, вони означають продукти, одержані після обробки зазначених полінуклеотидів будь-якою з типових ендонуклеаз. Відповідно до цього винаходу, термін "процентна ідентичність" або "процент ідентичності", відносно послідовності, означає, що послідовність порівнюється із заявленою або описаною послідовністю після вивірки послідовності, яка порівнюється ("Порівняна Послідовність"), з описаною або заявленою послідовністю ("Контрольна Послідовність"). Процентна ідентичність визначається відповідно до наведеної нижче формули: Процентна ідентичність = 100 [I -(C/R)] де C - кількість різниць між Контрольною Послідовністю та Порівняною Послідовністю на довжині вивірки в інтервалі порівняння між Контрольною Послідовністю та Порівняною Послідовністю, де (i) кожна основа чи амінокислота у Контрольній Послідовності, котра не має відповідної вивіреної основи чи амінокислоти у Порівняній Послідовності, та (ii) кожній розрив у Контрольній Послідовності, та (iii) кожна вивірена основа чи амінокислота у Контрольній Послідовності, яка відрізняється від вивіреної основи чи амінокислоти у Порівняній Послідовності, становить різницю; та R - кількість основ чи амінокислот в Контрольній Послідовності на довжині вивірки з Порівняною Послідовністю з будь-яким розривом, утвореним в Контрольній Послідовності, також зарахованим як основа чи амінокислота. Якщо існує вивірка між Порівняною Послідовністю та Контрольною Послідовністю, для якої процентна ідентичність, розрахована вище, є приблизно рівною чи більшою, ніж зазначена мінімальна Процентна Ідентичність, то Порівняна Послідовність має зазначену мінімальну процентну ідентичність до Контрольної Послідовності, навіть якщо можуть існувати вивірки, в яких розрахована, як описано вище, Процентна Ідентичність менша, ніж зазначена Процентна Ідентичність. Первісні пептиди, що розкриваються в цьому винаході, можуть модифікуватися заміщенням одного чи кількох залишків на різних, можливо, селективних, ділянках пептидного ланцюгу, якщо не зазначається інше. Такі заміщення можуть бути консервативного характеру, наприклад, коли одна амінокислота замінюється амінокислотою подібної структури та характеристик, тобто, коли гідрофобна амінокислота замінюється іншою гідрофобною амінокислотою. Навіть більш консервативною буде заміна амінокислот такого ж чи подібного розміру та хімічного характеру, наприклад, коли лейцин замінюється ізолейцином. В дослідженнях варіацій послідовностей в сімействах природних гомологічних білків, певні амінокислотні заміщення частіше допускаються, ніж інші, і вони часто демонструють кореляцію зі схожістю в розмірі, заряді, полярності та гідрофобності між первісною амінокислотою та її заміною, і це є основою для визначення "консервативних заміщень". Консервативні заміщення визначаються тут як заміни в межах однієї з наведених нижче п'яти груп: Група 1 - малі аліфатичні, неполярні чи слабо полярні залишки (Ala, Ser, Thr, Pro, Gly); Група 2 - полярні, негативно заряджені залишки та їхні аміди (Asp, Asn, Glu, Gln); Група 3 полярні, позитивно заряджені залишки (His, Arg, Lys); Група 4-великі аліфатичні неполярні залишки (Met, Leu, Ile, Val, Cys); та Група 5 - великі ароматичні залишки (Phe, Tyr, Trp). Менш консервативні заміщення заміщення можуть включати заміну однієї амінокислоти іншою, котра має подібні характеристики, але трохи відрізняється за розміром, наприклад, заміна аланіну ізолейциновим залишком. Високо-неконсервативні заміни можуть включати заміщення кислотної амінокислоти полярною, або навіть такою, що є основною за своїм характером. Такі "радикальні" заміщення не можуть, однак, відхилятись як потенційно неефективні, оскільки їхні хімічні наслідки не є повністю прогнозованими, та радикальні заміщення також можуть мати сприятливий ефект, який неможливо передбачити за простими хімічними принципами. 4 UA 101810 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Безумовно, такі заміщення можуть включати структури, інші ніж звичайні L-амінокислоти. Отже, D-амінокислоти можуть замінятися L-амінокислотами, котрі зазвичай виявляються в антигенних пептидах винаходу та охоплюються розкриттям в ньому. Крім того, амінокислоти, які мають нестандартні R-групи (тобто, R-групи, інші ніж можна знайти в типових 20 амінокислотах природних білків) також можуть використовуватись для цілей заміщення, з метою виробництва імуногенів та імуногенних поліпептидів, відповідно до цього винаходу. Якщо виявляється, що заміщення в більш ніж одній позиції призводять до утворення пептиду по суті з еквівалентною чи більшою антигенною активністю, як визначено нижче, тоді комбінації цих заміщень будуть досліджуватись з метою визначення, чи мають комбіновані заміщення додатковий чи синергічний ефект на антигенність пептиду. Більшою частиною, не більш ніж 4 позиції в пептиді замінюються одночасно. Термін "Т-клітинна реакція" означає специфічну проліферацію та активацію ефекторних функцій, індукованих пептидом in vitro чи in vivo. Для CTL, обмежених MHC класу I, ефекторними функціями можуть бути лізис клітин-мішеней з імпульсно введеним пептидом, пептидним прекурсором чи клітин-мішеней, природно презентуючих пептид, секреція цитокінів, переважно гамма-інтерферону, TNF-альфа, або IL-2, індукована пептидом, секреція ефекторних молекул, переважно, гранзимів чи перфорінів, індукована пептидом, або дегрануляція. Для обмежених MHC класу II Т-клітин- хелперів, ефекторні функції - це, ймовірно, індукована пептидом секреція цитокінів, переважно, IFN-гамма, TNF-alpha, IL-4, IL5, IL-10 або IL2, чи індукована пептидом дегрануляція. Можливі ефекторні функції для CTL і Т-клітин- хелперів не обмежуються цим переліком. На основі аналізу цитотоксичності, епітоп вважається по суті ідентичним контрольному пептиду, якщо він має принаймні 10 % антигенної активності контрольного пептиду, як визначається здатністю заміщеного пептиду відновлювати епітоп, розпізнаний CTL, в порівнянні з контрольним пептидом. Отже, при порівнянні літичної активності на лінійній ділянці кривих ефектор:мішень з еквімолярними концентраціями контрольного та заміщеного пептидів виявлений процент знищення клітин-мішеней, інкубованих з заміщеним пептидом, повинен дорівнювати аналогічному показнику контрольного пептиду зі співвідношенням ефектор:мішень не більше, ніж в 10 разів вищим співвідношення ефектор:мішень контрольного пептиду, з яким проводиться порівняння. Переважно, коли CTL, специфічні для пептиду послідовностей від SEQ ID NO: l до SEQ ID NO: 11, перевіряються в порівнянні з заміщеними пептидами, пептидна концентрація, при якій заміщені пептиди досягають половини від максимального зростання в лізисі, становить не більше, ніж приблизно 1 мМ, переважно не більше, ніж приблизно 1 мкM, ще більш переважно не більше близько 1 нМ, та ще більш переважно не більше 100 пM, та найбільш переважно - не більше, ніж приблизно 10 пМ. Також є переважним, щоб заміщений пептид розпізнавався CTL від більш, ніж однієї людини, принаймні, від двох та, більш переважно, від трьох людей. Отже, епітопи цього винаходу можуть бути ідентичними природно існуючим пухлиноасоційованим чи пухлино-специфічним епітопам та можуть включати епітопи, що відрізняються не більш, ніж на 4 залишки від контрольного пептиду, за умови, що вони мають по суті ідентичну антигенну активність. Стимуляція імунної реакції залежить від наявності антигенів, які визнаються імунною системою хазяїна як чужорідні. Виявлення існування пухлино-асоційованих антигенів дало можливість використовувати імунну систему хазяїна для сприяння імунній реакції, котра є специфічною для цільових антигенів, експресованих на поверхні клітин пухлин, що завдяки такому механізму дії здатна призводити до ремісії, затримки чи сповільнення росту пухлини. Зараз досліджуються різні механізми використання як гуморальних, так і клітинних важелів імунної системи для імунотерапії раку. Окремі елементи клітинної імунної реакції здатні специфічно розпізнавати та знищувати клітини пухлин. Виділення цитотоксичних T-лімфоцитів (CTL) з пухлино-інфільтруючих клітинних популяцій чи з периферичної крові наводить на думку, що такі клітини грають важливу роль в природному імунному захисті проти раку (Cheever et al., 1993; Zeh, III et al., 1999). На основі аналізу 415 зразків, взятих у пацієнтів з колоректальним раком, автори Galon et al. змогли продемонструвати, що тип, щільність та локалізація імунних клітин в пухлинній тканині, фактично, є кращим прогностичним фактором виживаності пацієнтів, ніж широко використовувана TNM-класифікація пухлин (Galon et al., 2006). Зокрема, CD8-позитивні T+ клітини (TCD8 ), які розпізнають молекули Класу I головного комплексу гістосумісності (MHC), що презентують пептиди зазвичай з 8-10 амінокислотних залишків, одержані з білків чи дефектних продуктів рибосом (DRIPS) (Schubert et al., 2000), відіграють важливу роль в цій 5 UA 101810 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 реакції. Крім того, пептиди, що походять зі сплайсованих білків, були описані в науковій літературі. MHC-молекули людини також визначаються як лейкоцитарні антигени людини (HLA). Є два класи MHC-молекул: MHC-молекули класу I, котрі можна знайти на більшості клітин, що мають ядро. МНС-молекули складаються з важкого ланцюгу альфа та бета-2-мікроглобуліну (рецептори МНС класу І) або альфа та бета ланцюгу (рецептори МНС класу ІІ), відповідно. Тримірна структура утворює порожнину зв'язування, яка використовується для нековалентної взаємодії з пептидами. MHC класу I презентують пептиди, які є результатом протеолітичного розщеплення, в основному, ендогенних протеїнів, DRIPS та більших за розміром пептидів. MHC-молекули класу II, переважно, знаходяться на професійних антиген-презентуючих клітинах (APC); вони презентують пептиди екзогенних чи трансмембранних білків, що поглинаються АPC в ході ендоцитозу, та проходять подальшу обробку (Cresswell, 1994). Комплекси пептиду та MHC-молекули класу I розпізнаються CD8-позитивними цитотоксичними T-лімфоцитами, які презентують відповідні рецептори Т-клітин (TCR), а комплекси пептиду і MHC-молекули класу II розпізнаються CD4-позитивними Т-клітинами- хелперами, що презентують відповідні TCR. Добре відомим є той факт, що TCR, пептид і MHC присутні в стехіометричному співвідношенні 1:1:1. CD4-позитивні T-клітини-хелпери відіграють важливу роль в індукуванні та підтриманні ефекторних реакцій CD8-позитивними цитотоксичними T-клітинами (Wang and Livingstone, 2003; Sun and Bevan, 2003; Shedlock and Shen, 2003). З цієї причини, ідентифікація епітопів CD4позитивних T-клітин, які одержуються з пухлино-асоційованих антигенів (TAA) може мати велике значення для розробки фармацевтичних продуктів для викликання протипухлинних імунних реакцій (Kobayashi et al., 2002; Qin et al., 2003; Gnjatic et al., 2003). За відсутності запалення, експресія молекул MHC класу II, переважно, зводиться до клітин імунної системи, зокрема, до професійних антиген-презентуючих клітин (APC), наприклад, моноцитів, клітин, що походять з моноцитів, макрофагів, дендритних клітин. При дослідженні пацієнтів з пухлинами було несподівано виявлено, що клітини пухлини експресують MHCмолекули класу II (Dengjel et al., 2006). На моделях ссавців, наприклад, мишей, було продемонстровано, що навіть за відсутністю цитотоксичних Т-лімфоцитарних (CTL) ефекторних клітин (тобто, CD8-позитивних Tлімфоцитів), CD4-позитивні T-клітини є достатніми для візуалізації інгібування пухлин шляхом інгібування ангіогенезу завдяки секреції гамма-інтерферону (IFNγ) (Qin and Blankenstein, 2000). Крім того, було показано, що CD4-позитивні T-клітини, які розпізнають пептиди з пухлиноасоційованих антигенів, представлених молекулами HLA класу II, можуть протидіяти розвитку пухлин за допомогою індукування реакцій антитіл (Ab) (Kennedy et al., 2003). На відміну від пухлино-асоційованих пептидів, які зв'язуються з молекулами HLA класу I, лише невелика кількість лігандів класу II TAA була описана на цей час (www.cancerimmunity.org, www.syfpeithi.de). Оскільки визначальна експресія молекул HLA класу II зазвичай обмежується клітинами імунної системи (Mach et al., 1996), можливість виділення пептидів класу II безпосередньо з первинних пухлин не вважалася ймовірною. Однак, автори Dengjel et al. за останній час досягли успіху в ідентифікації ряду епітопів MHC класу II безпосередньо з пухлин (WO 2007/028574, EP 1 760 088 B1; (Dengjel et al., 2006). Для того, щоб пептид індукував (викликав) клітинну імунну реакцію, він повинен зв'язуватися з MHC-молекулою. Цей процес залежить від алелі MHC-молекули та специфічного поліморфізму амінокислотної послідовності пептиду. Пептиди, зв'язані з MHC класу I, як правило, мають довжину 8-10 амінокислотних залишків та зазвичай вміщують два консервативні залишки ("якір") в своїй послідовності, що взаємодіє з відповідною порожниною зв'язування MHC-молекули. Таким чином, кожна MHC-алель має "мотив зв'язку", що визначає, які пептиди можуть специфічно зв'язуватися з порожниною зв'язування (Rammensee et al., 1997). В імунній реакції, залежній від MHC класу I, пептиди повинні не тільки мати здатність зв'язуватися з певними молекулами MHC класу I, експресованими пухлинними клітинами, вони також мають розпізнаватися T-клітинами, презентуючими специфічні T-клітинні рецептори (TCR). Антигени, котрі розпізнаються пухлино-специфічними цитотоксичними T-лімфоцитами, тобто, їхні епітопи, можуть бути молекулами, одержаними з усіх класів білків, таких як ферменти, рецептори, транскрипційні фактори та ін., котрі експресуються та, в порівнянні з незміненими клітинами того ж самого походження, мають підвищену концентрацію в клітинах відповідної пухлини. 6 UA 101810 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Діюча класифікація пухлино-асоційованих антигенів включає наведені нижче основні групи (Novellino et al., 2005): 1. Антигени Cancer-testis: Перші TAA, що були ідентифіковані, котрі можуть розпізнаватися T-клітинами (van der Bruggen et al., 1991) належать до цього класу, і вони спочатку були названі антигени cancer-testis (CT), внаслідок експресії членів цього класу в гістологічно різних пухлинах людини та, серед нормальних тканин, тільки в сперматоцитах/сперматогонії сем'яників та, час від часу, в плаценті. Оскільки клітини сем'яників не експресують молекули HLA класу I і II, ці антигени не можуть розпізнаватися T-клітинами в нормальних тканинах і тому можуть вважатися імунологічно пухлино-специфічними. Добре відомі приклади CT-антигенів - це члени сімейства MAGE або NY-ESO-1. 2. Диференційовані антигени: Ці TAA зустрічаються і в пухлинах, і в нормальній тканини, з якої виникає пухлина; більшість з них знаходиться в меланомах та нормальних меланоцитах. Багато з цих меланоцитних білків, що відносяться до лінії диференціювання, беруть участь в біосинтезі меланіну і тому не є пухлино-специфічними, але незважаючи на це широко використовуються для імунотерапії раку. Приклади включають, без обмежень, тирозиназу та Melan-A/MART-1 для меланоми або PSA для раку простати. 3. Надмірно експресовані TAA: Гени, що кодують широко експресовані TAA, були визначені в гістологічно різних типах пухлин, а також в багатьох нормальних тканинах, в цілому, з більш низькими рівнями експресії. Можливо, багато епітопів, що процесуються та потенційно презентуються нормальними тканинами, нижче порогового рівня для розпізнавання Тклітинами, в той час як їхня надмірна експресія в клітинах пухлин може запускати протиракову реакцію за допомогою порушення раніше встановленої толерантності. Яскравими прикладами цього класу TAA є Her-2/neu, Survivin, Telomerase або WT1. 4. Пухлино-специфічні антигени: Ці унікальні TAA виникають з мутацій нормальних генів (таких к β-катенін, CDK4, та ін.). Деякі з цих молекулярних змін асоціюються з неопластичною трансформацією та/або прогресуванням. Пухлино-специфічні антигени, в цілому, здатні індукувати сильні імунні реакції без ризику аутоімунних реакцій проти нормальних тканин. З іншого боку, ці TAA в більшості випадків є релевантними тільки до конкретної пухлини, на якій вони були ідентифіковані, і зазвичай не зустрічаються на великій кількості іншихпухлин. 5. TAA, що виникають з аномальних пост-трансляційних модифікацій: Такі TAA можуть виникати з білків, котрі не є пухлино-специфічними і не експресуються надмірно в пухлинах, але незважаючи на це стають пухлино-асоційованими внаслідок пост-трансляційних процесів, активних, перш за все, в пухлинах. Приклади цього класу виникають зі змінених моделей глікозилювання, котрі ведуть до нових епітопів в пухлинах, як у випадку MUC1 чи сплайсингу білків в ході деструкції, що може чи не може бути пухлино-специфічною (Hanada et al., 2004; Vigneron et al., 2004). 6. Онковірусні білки: Ці TAA є вірусними білками, котрі можуть відігравати вирішальну роль в онкогенному процесі, та внаслідок того, що такі білки є чужорідними (не людського походження), вони можуть викликати Т-клітинну реакцію. Прикладами таких білків є вірусні білки папіломи типу 16 у людини, E6 and E7, котрі експресуються в цервікальній карциномі. Для того, щоб білки розпізнавалися цитотоксичними T-лімфоцитами як пухлино-специфічні або пухлино-асоційовані антигени, та з метою використання в лікуванні, мають бути дотримані деякі попередні умови. Антиген повинен експресуватися, головним чином, клітинами пухлин, а не нормальними здоровими тканинами, чи бути присутнім в здорових клітинах в порівняно невеликих кількостях. Крім того, бажано, щоб відповідний антиген був не тільки присутнім в будь-якому виді пухлин, але також знаходився у високих концентраціях (наприклад, кількість копій відповідного пептиду на клітину). Пухлино-специфічні та пухлино-асоційовані антигени часто походять з білків, що беруть безпосередню участь у трансформації нормальної клітини в пухлинну клітину внаслідок їхньої функції, наприклад, в контролі клітинного циклу чи в супресії апоптозу. До того ж, наступні мішені цих білків, які є основною причиною трансформації, можуть мати підвищену експресію і, відповідно, бути непрямим чином асоційованими з пухлинами. Такі непрямо пухлино-асоційовані антигени також можуть бути мішенями у вакцинаційному підході (Singh-Jasuja et al., 2004). Істотно важливою в обох випадках є присутність епітопів в амінокислотній послідовності антигену, оскільки такий пептид ("імуногенний пептид"), що одержується з пухлино-асоційованого антигену, повинен призводити до Т-клітинної реакції in vitro чи in vivo. По суті, будь-який пептид, здатний зв'язувати молекулу MHC, може функціонувати як Tклітинний епітоп. Передумовою для індукування Т-клітинної реакції in vitro чи in vivo є наявність T-клітини з відповідним рецептором TCR та відсутність імунологічної толерантності до цього конкретного епітопу. 7 UA 101810 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Отже, TAA є відправною точкою для розробки протипухлинної вакцини. Методи ідентифікації та характеризації TAA основані на використанні CTL, котрі можуть бути виділені у пацієнтів або здорових людей, або вони базуються на генерації різних профілів транскрипції або різних моделей експресії пептидів пухлин і нормальних тканин (Lemmel et al., 2004; Weinschenk et al., 2002). Однак, ідентифікація генів, надмірно експресованих в тканинах пухлин чи клітинних лініях пухлин людини, або селективно експресованих в таких тканинах чи клітинних лініях, не дає точної інформації щодо використання антигенів, транскрибованих з цих генів, в імунній терапії. Це можна пояснити тим, що тільки індивідуальна субпопуляція епітопів з цих антигенів є прийнятною для такого застосування, оскільки T-клітина з відповідним TCR повинна бути присутньою, а імунологічна толерантність до цього конкретного епітопа має бути відсутньою чи мінімальною. Отже, важливо обирати тільки ті пептиди з надмірно експресованих чи селективно експресованих білків, котрі презентуються в зв'язку із молекулами MHC, проти яких можна знайти функціональну T-клітину. Така функціональна T-клітина визначається як Т-клітина, що після стимуляції специфічним антигеном може клонально розмножуватись і здатна виконувати ефекторні функції ("ефекторна T-клітина"). Типові ефекторні Т-клітин включають секрецію гамма-інтерферону, перфоріну та гранзимів. T-клітини - хелпери відіграють важливу роль в регуляції ефекторної функції CTL в протипухлинному імунітеті. Епітопи Т-хелперів, які запускають реакцію Т-клітин- хелперів типу TH1, підтримують ефекторні функції CD8-позитивних T-клітин-кілерів, котрі включають цитотоксичні функції, спрямовані проти клітин пухлин, що експресують комплекси пухлиноасоційованого пептиду/MHC на своїх клітинних поверхнях.