Спосіб інтегрованого безпервного виробництва біологічних молекул

Реферат: Винахід належить до процесу очищення та виділення молекули, що становить інтерес, з гетерогенної просвітленої рідкої суміші. Процес включає фільтрування гетерогенної просвітленої рідкої суміші шляхом безперервного ультрафільтрування з питомою швидкістю потоку, обраною нижче граничної точки на залежній від тиску ділянці кривої потіктрансмембранний тиск, побудованої для молекули, що становить інтерес, причому питому швидкість потоку підтримують на по суті постійному рівні протягом усього безперервного процесу ультрафільтрування. UA 107937 C2 (12) UA 107937 C2 UA 107937 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Цей винахід стосується вдосконаленого способу і системи виділення молекули, що становить інтерес, із гетерогенної суміші молекул та очищення цієї молекули. Конкретніше, цей винахід спрямований на способи виділення білка, що становить інтерес, з потоку тканинної культуральної рідини, що одержується в ході безперервного процесу перфузійного ферментування, та очищення цього білка. Фахівцям в даній галузі добре відомо, що протягом останніх років із великим комерційним успіхом було розроблено декілька безперервних процесів культивування клітин, які називають також безперервними процесами перфузії. Однак процес виділення, здійснюваний безпосередньо після безперервного процесу перфузійного ферментування, є, як правило, періодичним процесом, відділеним у фізичному і матеріально-технічному відношенні від попередніх стадій безперервного технологічного процесу. Основна мета стадії виділення в ході здійснення цих процесів полягає в збиранні продукту з великих об'ємів відносно розбавленого культурального супернатанту. Потрібно звернути особливу увагу на концентрацію продукту з точки зору матеріально-технічних і просторових вимог, що пред'являються до вказаного процесу, оскільки одночасне видалення забруднювачів (очищення) відіграє вельми істотну роль відносно зведення до мінімального рівня необхідної кількості додаткових подальших стадій очищення. На Фіг. 1 схематично представлений типовий сучасний процес виділення продукту, що одержується в ході безперервного перфузійного ферментування, добре відомий фахівцям в даній галузі. Система безперервного перфузійного ферментування включає пристрій (1) для утримання клітин, який затримує більшу частину клітин, що продукують продукт у системі ферментування. Безперервний потік продукту із системи безперервного перфузійного ферментування, що все ще містить деяку кількість клітин, дебрис і інші частинки, перекачується за допомогою насоса (2) для перекачування продукту в збірні резервуари (3) великого об'єму, наприклад, баки з неіржавіючої сталі. Ці резервуари для зберігання зібраного продукту повинні, як правило, охолоджуватися для утримання втрат продукту, викликаних розкладанням, в прийнятних межах. Після завершення збору певного об'єму, для чого, як правило, потрібно від 1 дня до 4 днів або більш, збірні резервуари продукту від'єднуються від стерильного ферментаційного чана, і зібраний матеріал позначається, як одна партія продукту. Наступною стадією є видалення клітин, дебрису і частинок (стадія 2). У промисловому масштабі це, як правило, здійснюється за допомогою центрифугування (4) з подальшим ультрафільтруванням (5) через напівпроникну мембрану з глухим кінцем або об'ємним фільтруванням (6) з глухим кінцем із подальшим ультрафільтруванням (7) через напівпроникну мембрану з глухим кінцем. Іншим іноді вживаним способом є мікрофільтрування з тангенціальним (або "перехресним") потоком. У будь-якому випадку, продуктом процесу видалення частинок є партія просвітленої тканинної культуральної рідини або cTCF (8). Детальніше питання відділення частинок від біотехнологічних продуктів розглядається в стандартних підручниках, дивися, наприклад, Biotechnology, том 3, Bioprocessing, Wiley-VCH, 2 видання (1996), ISBN:3527283137. На наступній стадії (стадія 3), партію просвітленої тканинної культуральної рідини піддають додатковій обробці з метою концентрування і, по можливості, очищення продукту. Це, як правило, здійснюється шляхом ультрафільтрування з перехресним потоком або хроматографування в ущільненому шарі. У разі ультрафільтрування з перехресним потоком, cTCF закачують у рециркуляційний бак (9) системи. Насос (10) застосовують для проштовхування матеріалу через ультрафільтр із перехресним потоком. Продукт затримується мембраною і рециркулюється у вигляді осаду в рециркуляційний бак, в той час як вода і забруднювачі меншого розміру проштовхуються через мембрану в фільтрат (11) внаслідок трансмембранного тиску, що утворюється внаслідок перепаду тиску на ультрафільтраційному модулі. Таким чином, при кожному проходженні через фільтр cTCF стає все більш концентрованою, а загальний об'єм cTCF зменшується до досягнення необхідного коефіцієнта концентрації. Після досягнення необхідного коефіцієнта концентрації процес зупиняють, і об'єм концентрату (ізоляту), що залишився, зливають із системи і збирають. Детальніше процес ультрафільтрування з перехресним потоком для концентрування біотехнологічних продуктів розглядається в стандартних підручниках, дивися, наприклад, Biotechnology, том 3, Bioprocessing, Wiley-VCH, 2 видання (1996), ISBN:3527283137. У разі хроматографування в ущільненому шарі, cTCF прокачують через хроматографічну колонку (12), що містить ущільнений шар смоли. Продукт зв'язується зі смолою з подальшим елююванням, як правило, в концентрованій і очищеній формі (ізолят, 13) за допомогою придатного буфера (14) для елюювання, після чого здійснюють очищення і регенерацію колонки за допомогою придатних буферів і розчинів (14) для очищення. 1 UA 107937 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Іншими варіантами хроматографії, запропонованими для концентрування/виділення та очищення cTCF, є хроматографія в розширеному шарі і мембранна хроматографія. Шляхом хроматографування в розширеному шарі можна обробляти розчини, що містять частинки. Як і раніше, однак, зберігається необхідність фільтрування ізоляту після хроматографування, хоч площі фільтрування скорочуються. У мембранній хроматографії замість ущільнених шарів смоли застосовують пакети модифікованих мікрофільтрувальних мембран. Перевага полягає в тому, що масоперенос стає в більшій мірі конвективним, ніж дифузійним, що забезпечує прискорене розділення. У інших відношеннях згаданий процес, як правило, еквівалентний стандартному процесу хроматографування в ущільненому шарі. Детальніше процес хроматографування для концентрування і очищення біотехнологічних продуктів розглядається в стандартних підручниках, дивися, наприклад, Protein Purification, Principles, High-Resolution Methods, і Applications, Wiley-VCH, 2 видання (1998), ISBN: 0-471-18626-0. Основну масу ізоляту в подальшому часто заморожують і зберігають для більш пізнього використання на додаткових подальших стадіях очищення. Таким чином, як описано вище, процес виділення, як правило, є періодичним процесом, відділеним у фізичному і матеріально-технічному відношенні від попереднього безперервного процесу. Крім того, в той час як ферментація повинна здійснюватися в стерильних умовах, виділення (тобто видалення частинок і концентрація/очищення) здійснюється по суті з дотриманням чистоти, але не в стерильних умовах. Процеси відомого рівня техніки, описані вище, мають ряд проблем: P1. Втрати виходу і потенційне зниження якості внаслідок тривалого часу перебування матеріалу в установці. Продукт, одержаний в ході безперервного процесу перфузійного ферментування, має збиратися і зберігатися протягом значних періодів часу, як вказувалося вище, перед обробкою виділеної партії. Зібраний продукт хоч і охолоджений, все ще являє собою шкідливе середовище для складних і, по своїй суті, нестабільних білкових продуктів. Внаслідок цього відбувається істотна втрата продукту, що знижує продуктивність установки і підвищує вартість продукту. У доповнення до цього, може виявлятися негативний вплив на якість продукту. Р2. Для проміжного зберігання великих об'ємів продукту необхідні холодильні ємності або охолоджувані резервуари значних розмірів, наслідком чого є високі капітальні витрати і зведення нанівець переваг перфузійних ферментерів, які полягають у компактності і мобільності. Р3. Традиційні способи концентрування/виділення та очищення (наприклад, ультрафільтрування, хроматографування в ущільненому шарі) мають відносно низьку об'ємну продуктивність, значний загальний час виробничого циклу і відносно трудомісткі. Як наслідок, протягом дня здійснюється, як правило, не більш за 1 періодичний процес. Р4. У доповнення до цього, сучасні процеси і способи виділення стикаються з матеріальнотехнічними труднощами, оскільки процесу обробки на ферментаційних установках підлягають змінні об'єми матеріалу, що має на увазі використання більш ніж одного ферментера. У складі промислових установок безперервного перфузійного ферментування працює різна кількість ферментерів. Р5. Крім того, сучасні процеси виділення здійснюються з дотриманням чистоти, однак вони не можуть здійснюватися з дотриманням стерильності. Наслідком цього часто є значна кількість відбракованих партій внаслідок проблем із мікробним забрудненням. Р6. Утилізація предметів одноразового використання, наприклад, одноразових фільтрів, комплектів (вузлів), м'яких резервуарів тощо, хоч і дуже бажана при виробництві парентеральних препаратів для людей (наприклад, для уникнення очищення, оцінки ступеня очищення і інших проблем), є дуже дорогою і фактично часто невигідною з економічної точки зору. Відповідно, метою цього винаходу є створення інтегрованого процесу безперервного відділення білка, здатного працювати протягом тривалих проміжків часу в стерильних умовах. Цей винахід спрямований на новий апарат і процес виділення молекул із гетерогенної рідкої суміші та очищення цих молекул. Конкретніше, цей винахід спрямований на процес виділення молекули, що становить інтерес, із гетерогенної просвітленої рідкої суміші, з якої були видалені великодисперсні забруднювачі, та очищення цієї молекули. Згаданий процес включає стадію фільтрування гетерогенної просвітленої рідкої суміші шляхом безперервного ультрафільтрування з питомою швидкістю потоку, обраною нижчеграничної точки на залежній від тиску ділянці на кривої потік-трансмембранний тиск, побудованої для молекули, що становить інтерес, причому питому швидкість потоку підтримують на по суті постійному рівні протягом усього безперервного процесу ультрафільтрування. 2 UA 107937 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Згідно з конкретними варіантами здійснення процес за даним винаходом включає фільтрування просвітленої рідкої суміші через ультрафільтраційну мембрану, що має площу в квадратних метрах, яка дорівнює приблизно 0,1-2 об'ємним витратам просвітленої рідкої суміші в літрах на годину. Згідно з іншим варіантом здійснення процес за даним винаходом включає фільтрування просвітленої рідкої суміші через ультрафільтраційну мембрану, що має площу в квадратних метрах, яка дорівнює приблизно 0,3-1 об'ємній витраті просвітленої рідкої суміші в літрах на годину. Перевага процесу за даним винаходом полягає в тому, що він дозволяє здійснювати фільтрування просвітленої суміші з питомою швидкістю потоку, що забезпечує пристінкову концентрацію, що менш ніж на приблизно 20 %, менш ніж на приблизно 15 % або менш ніж на приблизно 10 % перевищує концентрацію осаду на мембрані, без істотної концентраційної поляризації. Згідно з більш конкретним варіантом здійснення, цей винахід спрямований на інтегрований, безперервний і стерильний процес перфузійного ферментування, видалення макрочастинок і виділення та очищення/концентрування. Згідно з одним з аспектів цього винаходу, згаданий процес включає фільтрування тканинної культуральної суміші із застосуванням процесу виділення, за допомогою якого здійснюється селективне виділення білка, що становить інтерес, із суміші в заданій робочій точці, обраній нижчеграничної точки на залежній від тиску ділянці кривої потік-трансмембранний тиск, побудованої для молекули, що становить інтерес, з одержанням стерильного вільного від частинок концентрованого і частково очищеного виділеного продукту, причому питому швидкість потоку протягом процесу виділення підтримують по суті постійною на рівні, вибраному нижче граничної точки на кривій потіктрансмембранний тиск, побудованій для згаданого білка. Згідно з іншим аспектом цього винаходу, згаданий процес являє собою безперервний процес виділення білка, що становить інтерес, із гетерогенної тканинної культуральної рідкої суміші та його очищення, який включає: (a) одержання за допомогою безперервного процесу перфузійного ферментування гетерогенної тканинної культуральної рідкої суміші, яка містить білок, що становить інтерес; (b) переміщення згаданої тканинної культуральної рідкої суміші в обладнання для виконання безперервного процесу видалення частинок, інтегрованого з безперервним процесом перфузійного ферментування; (c) видалення великодисперсних забруднювачів із тканинної культуральної рідини в ході безперервного процесу видалення частинок з одержанням просвітленої тканинної культуральної рідини, яка містить білок, що становить інтерес; (d) переміщення згаданої просвітленої тканинної культуральної рідини в обладнання для виконання безперервного процесу виділення та очищення, інтегрованого з безперервним процесом видалення частинок; і (e) виділення білка, що становить інтерес, із просвітленої тканинної культуральної рідини та його очищення в ході безперервного процесу виділення та очищення; причому питому швидкість потоку згаданої суміші в ході безперервного процесу перфузійного ферментування, безперервного процесу видалення частинок і безперервного процесу виділення та очищення підтримують на по суті постійному рівні. Згідно із ще одним аспектом цього винаходу, згаданий процес являє собою напівбезперервний процес виділення білка, що становить інтерес, із гетерогенної тканинної культуральної рідкої суміші та його очищення, який включає: (a) одержання за допомогою безперервного процесу перфузійного ферментування гетерогенної тканинної культуральної рідкої суміші, яка містить білок, що становить інтерес; (b) переміщення згаданої тканинної культуральної рідкої суміші в обладнання для виконання безперервного процесу видалення частинок, інтегрованого із системою безперервного перфузійного ферментування; (c) видалення великодисперсних забруднювачів із тканинної культуральної рідини в ході безперервного процесу видалення частинок з одержанням просвітленої тканинної культуральної рідини, яка містить білок, що становить інтерес; (d) переміщення згаданої просвітленої тканинної культуральної рідини в зрівняльний резервуар, інтегрований в безперервний процес видалення частинок; (e) періодичне переміщення просвітленої тканинної культуральної рідини в обладнання для виконання процесу виділення та очищення, інтегрованого зі зрівняльним резервуаром; і (f) виділення білка, що становить інтерес, із просвітленої тканинної культуральної рідини та його очищення в системі виділення та очищення з одержанням стерильного вільного від 3 UA 107937 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 частинок концентрованого і частково очищеного виділеного продукту, який містить білок, що становить інтерес; причому питому швидкість потоку згаданої суміші в ході безперервного процесу перфузійного ферментування і безперервного процесу видалення частинок підтримують на по суті постійному рівні. Цей винахід спрямований також на апарат для виділення білка, що становить інтерес, з гетерогенної тканинної культуральної рідкої суміші. Згідно з одним з аспектів цього винаходу, згаданий апарат включає: (а) систему безперервного перфузійного ферментування; (b) систему безперервного видалення частинок, інтегровану із системою перфузійного ферментування; і (с) систему безперервного виділення та очищення, інтегровану із системою видалення частинок, причому згаданий апарат виконаний з можливістю підтримування стерильних умов. Згідно з іншим аспектом цього винаходу, згаданий апарат включає: (а) систему безперервного перфузійного ферментування; (b) систему безперервного видалення частинок, інтегровану із системою перфузійного ферментування; і (с) систему періодичного виділення та очищення, інтегровану із системою видалення частинок, причому згаданий апарат виконаний з можливістю підтримування стерильних умов. Згаданою системою виділення та очищення може бути, наприклад, система ультрафільтрування або система конвективного адсорбування/десорбування або будь-яка інша система, здатна забезпечити виділення білка, що становить інтерес, із гетерогенної суміші та його очищення або часткове очищення в інтегрованій, безперервній або напівбезперервній стерильній системі, як описано в даному описі. Процес і апарат, запропоновані даним винаходом, забезпечують безперервну обробку гетерогенної рідкої суміші, наприклад, клітинної культуральної рідини, з по суті постійною швидкістю потоку. Згідно з конкретним аспектом цього винаходу, процес і апарат, запропоновані даним винаходом, забезпечують безперервну обробку гетерогенної клітинної або тканинної культуральної рідкої суміші з по суті постійною швидкістю потоку, обраною нижче граничної точки на залежній від тиску ділянці кривої потік-трансмембранний тиск, протягом безперервного періоду часу і в ході процесу виділення та очищення. Ці і інші аспекти винаходу детально описуються далі в приведеному нижче докладному описі винаходу. Прикладені малюнки, які включені в опис і становлять його частину, ілюструють варіанти здійснення винаходу і, разом із докладним описом варіанта винаходу, призначені для пояснення принципів цього винаходу і його переваг. Фіг. 1: Схематичне зображення традиційного безперервного процесу перфузії з подальшими 3 відділеними в фізичному і матеріально-технічному значенні стадіями процесу виділення (періодичний збір продукту, періодичне видалення частинок і періодичне концентрування/виділення та очищення). Фіг. 2: Схематичне зображення 2 варіантів здійснення запропонованого даним винаходом пристрою А для безперервного, інтегрованого і стерильного виробництва. Схематичне зображення варіанта здійснення А1 подане ліворуч, а схематичне зображення варіанта здійснення А2 подане праворуч. Фіг. 3: Схематичне зображення 2 варіантів здійснення запропонованого даним винаходом пристрою В для безперервного, інтегрованого і стерильного виробництва. Схематичне зображення варіанта здійснення В1 подане ліворуч, а схематичне зображення варіанта здійснення В2 подане праворуч. Фіг. 4: Схематичне зображення варіанта здійснення запропонованої даним винаходом інтегрованої системи (100) безперервного видалення частинок, що є елементом як запропонованого даним винаходом пристрою А, так і запропонованого даним винаходом пристрою В. Фіг. 5: Схематичне зображення додаткових варіантів здійснення запропонованого даним винаходом пристрою А, який об'єднує численні елементи для підвищення або загальної продуктивності установки (A3), або ефективності концентрування і відділення (А4). Фіг. 6: Схематичне зображення додаткових варіантів здійснення запропонованого даним винаходом пристрою В. Фіг. 7: Додатковий варіант здійснення запропонованих даним винаходом пристроїв, що поєднують послідовно розташовані елементи пристрою А і пристрою В для підвищення загальної ефективності концентрування і відділення. Фіг. 8: Порівняння зразків повних допустимих навантажень у літрах на 10" (254,00 мм) фільтрувальної капсули для традиційного періодичного процесу і варіанта здійснення запропонованого даним винаходом пристрою і способу для безперервного видалення частинок 4 UA 107937 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 (інтегрований безперервний процес фільтрування), в яких застосовуються ідентичні комерційні фільтрувальні капсули. Як приклад показаний спосіб виробництва рекомбінантного фактора VIII системи згортання крові. 2 Фіг. 9: Приклад кривої тиск-потік (питомий потік фільтрату в LМН=літри/годину/м в залежності від трансмембранного тиску) і визначення робочої точки. Коло показує типову робочу точку, яка буде регулюватися за допомогою трансмембранного тиску для традиційних періодичних процесів. Прямокутник показує робочу ділянку, якій віддається перевага, яка буде регулюватися за допомогою насоса для перекачування фільтрату, наприклад, в способі застосування запропонованого даним винаходом пристрою А. Фіг. 10: Приклад розподілу часу перебування матеріалу в установці і середнього часу перебування матеріалу в установці інтегрованої системи (300) безперервного ультрафільтрування, наприклад, для способу застосування запропонованого даним винаходом 2 пристрою А. Визначалися для одноразової безперервної системи з модулем 290 см (довжиною 62,5 см), перехресним потоком 120 LMH, потоком осаду 0,2 LMH, потоком фільтрату 2 LMH. Фіг. 11: Приклад виділення rFVIII (рекомбінантний фактор VIII системи згортання крові) з одержаного внаслідок безперервного процесу перфузійного ферментування продукту, що не містить плазмового білка, за допомогою варіанта здійснення запропонованого даним винаходом пристрою А. Порівняння середнього виходу виділення запропонованого даним винаходом безперервного способу із середнім виходом періодичного виділення, що включає один стандартний розкид середнього квадратичного відхилення. Для визначення періодичного виходу застосували 3 послідовних періодичних процеси, в той час як для безперервного процесу застосували 3 послідовні точки (дні). Фіг. 12: Приклади робочих характеристик запропонованого даним винаходом пристрою А. Показано трансмембранний тиск і питомий потік інтегрованої системи (300) безперервного ультрафільтрування як функцію тривалості безперервного процесу для 3 різних прикладів. Трикутники=100 кДа мембрана, рекомбінантний фактор VIII системи згортання крові (rFVIII); Квадрати=10 кДа мембрана, рекомбінантний інтерлейкін - 2; Кола=50 кДа мембрана, генноінженерний глікопротеїн (Мr>100 кДа). Всі приведені приклади відносяться до одержаного внаслідок безперервного процесу перфузійного ферментування продукту, що не містить плазмового білка. Фіг. 13: Приклад довгострокових робочих характеристик запропонованого даним винаходом пристрою А, безпосередньо застосовуваного в безперервному процесі перфузійного ферментування лінії клітин, що коекспресує 2 білкових продукти (зелений флуоресцентний білок GFP і IL-2SA (інтерлейкін 2SA)). Показано трансмембранний тиск і питомий потік запропонованої даним винаходом системи (300) безперервного ультрафільтрування як функцію тривалості безперервного процесу. Застосовувалася 10 кДа мембрана. Фіг. 14: Приклад довгострокових робочих характеристик запропонованого даним винаходом пристрою А, безпосередньо застосовуваного в безперервному процесі перфузійного ферментування лінії клітин, що коекспресує 2 білкових продукти (зелений флуоресцентний білок GFP і IL-2SA). Застосовувалася 10 кДа мембрана. Коефіцієнт концентрації обох білкових продуктів, визначений відповідними аналізами, і коефіцієнт об'ємної концентрації представлені у вигляді функції тривалості безперервного процесу. Фіг. 15: Приклад робочих характеристик запропонованого даним винаходом пристрою В. Вихід продукту і перепад тиску протягом біля 100 послідовних циклів адсорбування/десорбування з конвективним адсорбером (цільовий білок: генноінженерний варіант фактора FVIII системи згортання крові; конвективний адсорбер: комерційний адсорбер, Mustang Q, фірма Pall Corporation). Фіг. 16: Приклад робочих характеристик запропонованого даним винаходом пристрою В. УФпрофіль і профіль електропровідності під час типового циклу адсорбування/десорбування з конвективним адсорбером (цільовий білок: генноінженерний варіант фактора FVIII системи згортання крові; конвективний адсорбер: комерційний адсорбер, Mustang Q, фірма Pall Corporation). Фіг. 17: Приклад робочих характеристик запропонованого даним винаходом пристрою В. Показані дані, що стосуються SDS-PAGE (електрофорез у поліакриламідному гелі в присутності додецилсульфату натрію) (фарбування сріблом) навантаження=просвітлений розчин продукту, що безперервно виходить із системи (100) видалення частинок і напівбезперервно вводиться в систему (400) конвективного адсорбера, і типового елюату, що одержується внаслідок адсорбування/десорбування. (Цільовий білок: генноінженерний варіант фактора FVIII системи згортання крові; конвективний адсорбер: комерційний адсорбер, Mustang Q, фірма Pall 5 UA 107937 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Corporation). Елюат розбавляли до концентрації навантаження перед проведенням серії експериментів на поліакриламідному гелі. Визначення Термінологія, застосована в цій заявці, за винятком чітко обумовлених випадків, є стандартною для даної галузі. Приведені нижче визначення деяких термінів представлені в даному описі для забезпечення ясності і визначеності розуміння значення формули винаходу. Одиниці, префікси і умовні позначення можуть бути виражені в формі, прийнятій для них у системі СІ. Числові діапазони, на які посилаються в даному описі, включають числа, що визначають діапазон, а також включають і підтримують кожне ціле число в межах певного діапазону. Якщо не обумовлено інше, однина повинна розглядатися як така, що означає "щонайменше один з". Назви розділів, застосовані в даному описі, мають виключно організаційне призначення і не повинні розглядатися як такі, що обмежують описаний предмет винаходу. Всі документи або частини документів, згадані в цій заявці, включаючи (але без обмеження) патенти, заявки на патент, статті, книги і наукові праці (монографії), включені сюди в повному обсязі виключно шляхом посилання з будь-якою метою. Термін "просвітлення" і "просвітлений" означає видалення макрочастинок із розчину, завдяки чому розчин, що залишився, проходить через 0,2 мкм мембрану. Термін "безперервне перфузійне ферментування" відноситься до стаціонарної системи або процесу ферментування, яка (який) функціонує без перерв і в якій (якому) клітини або мікроорганізми підтримуються в культурі в експонентній фазі зростання за допомогою безперервного додання свіжого живильного середовища, яке урівноважується видаленням суспензії клітин із біореактора. Терміни "культивування", "вирощування", "підтримування" і "розмноження" є синонімічними в тому значенні, що клітини залишаються життєздатними і здатними до продукування потомства. Термін "концентрування" в дієслівній формі означає видалення води з розчину, завдяки чому кількість молекул, що становлять інтерес, на одиницю об'єму розчину, що залишився, зростає. Термін "концентраційне поляризування" означає накопичення затриманих молекул (шар гелю) на поверхні мембрани, зумовлене сполученням факторів: трансмембранний тиск, швидкість перехресного потоку, в'язкість зразка і концентрація фільтрату. Термін "безперервний" означає той, що не переривається у часі, послідовності і/або функціонуванні протягом тривалих періодів часу. У разі застосування відносно процесів ферментування, просвітлення і фільтрування в даному винаході, термін "безперервний" означає, що процеси в фізичному і матеріально-технічному відношенні інтегровані, що забезпечує можливість безперервної роботи протягом тривалого періоду часу, достатнього для одержання стерильного вільного від частинок концентрованого і частково очищеного виділеного продукту, який містить білок, що становить інтерес. Термін "безперервний", у разі застосування його відносно процесів, запропонованих даним винаходом, потрібно також розуміти як такий, що означає те, що процес не здійснюється періодичним способом або безперервним способом буквально. Процеси, запропоновані даним винаходом, можуть здійснюватися безперервно, наприклад, протягом тривалих періодів часу в межах від 1 дня до декількох місяців без переривання здійснення або послідовності процесів. Згідно з даним винаходом, процеси здійснюються протягом безперервного періоду часу, тривалість якого перевищує 2 дні, 3 дні, 4 дні, 5 днів, 6 днів або 7 днів, 2 тижні, 3 тижні, 4 тижні, 5 тижнів, 6 тижнів, 7 тижнів або 8 тижнів або ж 3 місяці, 4 місяці, 5 місяців, 6 місяців або більш. Терміни "напівбезперервний" і "періодичного" означають, що один або декілька процесів або елементів інтегрованої системи здійснюються переривчастим або періодичним способом, в той час як інші процеси або елементи інтегрованої системи здійснюються безперервним способом. Наприклад, згідно з деякими варіантами здійснення цього винаходу, процес очищення являє собою процес конвективного адсорбування/десорбування, який, як правило, вимагає адсорбування гетерогенної суміші адсорбувальним субстратом, наслідком чого, зрештою, є насичення субстрату, і який вимагає завершення процесу адсорбування і десорбування або виділення зв'язаної фракції. Такий процес по своїй суті є періодичним, хоч і придатним до інтегрування з подальшими процесами, що є безперервними. Термін "конвективне адсорбування/десорбування" означає хроматографічний процес, в ході якого масоперенос здійснюється головним чином шляхом конвекції. Конвективне адсорбування/десорбування являє собою процес, в ході якого частина суміші, яка містить молекулу, що становить інтерес, відділяється від іншої частини суміші за допомогою адсорбування однієї частини субстратом, з подальшою десорбцією цієї частини із субстрату. 6 UA 107937 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Термін "перехресний потік" або "перехресний потік рідини" означає потік рідини, що проходить по верхній частині поверхні мембрани. Термін "інтегрований", застосовуваний по відношенню до багатоелементних систем і/або процесів, означає, що згадані системи і/або процеси об'єднані в фізичному і матеріальнотехнічному відношенні таким чином, що утворюють єдину систему, здатну працювати безперервно. У контексті системи, запропонованої даним винаходом, яка спрямована на інтегровану безперервну або напівбезперервну систему для виробництва вільного від частинок концентрованого і частково очищеного білка, що становить інтерес, інтегрована система буде безпосередньо об'єднувати різні складові елементи способом, достатнім для підтримування стерильних умов між різними складовими елементами системи. Терміни "живильні середовища" (множина) і "живильне середовище" (однина) є синонімами і застосовуються в даному описі взаємозамінно, причому застосування згаданого терміну в одній формі не має на увазі виключення іншої форми. Термін "суміш" означає гетерогенну комбінацію молекул і сполук, що містять молекулу, що становить інтерес, наприклад, білок, і різні забруднювачі. Сумішшю, якій віддається перевага, запропонованою даним винаходом, є тканинна культуральна рідина, що являє собою гетерогенну суміш білків, в тому числі екзогенний білок, що становить інтерес, яку спочатку одержують внаслідок безперервного процесу перфузійного ферментування. Термін "шар гелю" означає мікроскопічно тонкий шар молекул, який може утворюватися на верхній частині мембрани. Він може чинити негативний вплив на утримання молекул внаслідок закупорки поверхні мембрани і, тим самим, зниження потоку фільтрату або ж, в режимі роботи з постійним потоком, підвищення трансмембранного тиску. Термін "молекула, що становить інтерес" означає частинки або молекули інших видів, які повинні відділятися від розчину або суспензії в плинне середовище (наприклад, в рідину). Частинки або молекули, що становлять інтерес, відділяються від плинного середовища і, в більшості випадків, від інших частинок або молекул в згаданому плинному середовищі. Розміром молекули, що становить інтерес, яка підлягає відділенню, буде визначатися розмір пор використовуваної мембрани. Згідно з варіантом, якому віддається перевага, молекули, що становлять інтерес, мають біологічне або біохімічне походження або ж їх одержують за допомогою трансгенних або in vitro процесів, і включають білки, пептиди, поліпептиди, антитіла або фрагменти антитіл. Прикладами походження потоків поживних речовин, яким віддається перевага, є культура клітин ссавців і культура клітин мікроорганізмів, наприклад, бактерій, грибів і дріжджів. Потрібно також звернути увагу на те, що видами, що підлягають видаленню шляхом фільтрування, є небажані поліпептиди, білки, компоненти клітин, ДНК, колоїди, мікоплазми, ендотоксини, віруси, вуглеводи і інші молекули, що становлять біологічний інтерес, незалежно від того, глікозильовані вони чи ні. Термін "фільтрат" застосовується як синонім терміну "рідина, яка пройшла крізь фільтр". Термін "виділений продукт" означає вільний від частинок концентрований і частково очищений продукт, що містить білок, що становить інтерес. Виділений продукт є продуктом, що досяг ступеня очищення і концентрування, порівнянного зі ступенем, досягнутим за допомогою процесу ультрафільтрування або конвективного адсорбування/десорбування. Виділений продукт не обов'язково є гомогенним, однак він буде по суті очищеним у порівнянні з вихідною основною масою продукту, одержаною за допомогою процесу ферментування. Термін "питома швидкість потоку" застосовується взаємозамінно з терміном "потік фільтрату", оскільки він відноситься до фільтрату. Питома швидкість потоку осаду означає швидкість потоку осаду, нормалізовану до використовуваної площі мембрани. Термін "по суті постійний", застосовуваний відносно потоку, означає, що потік підтримується загалом на постійному рівні протягом значного періоду часу в ході фільтрування. Термін "тканинна культуральна рідина" означає гетерогенну суміш компонентів, одержану з тканинного культурального середовища. Згідно з аспектами цього винаходу, яким віддається перевага, тканинну культуральну рідину одержують за допомогою безперервного процесу перфузійного ферментування. "Просвітлена" тканинна культуральна рідина являє собою тканинну культуральну рідину, яка була піддана попередньому фільтруванню для видалення дебрису клітин і інших великих макромолекул. Термін "трансмембранний тиск" і його акронім "ТМР" означає середній тиск, що прикладається до мембрани з боку подачі на бік фільтрату. ТМР обчислюють за формулою TMP[6ap]=(PF+PR)[/2]-Pf, де PF - тиск подачі, PR - тиск осаду, Pf - тиск фільтрату. Термін "виділення" означає кількість молекул, що становлять інтерес, яке може бути зібране і оброблене. Виражається, як правило, у вигляді відсотка від вихідного матеріалу або виходу. 7 UA 107937 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Термін "осад" означає частину зразка, яка не пройшла через мембрану, відому також як концентрат. Термін "ультрафільтрування" означає форму фільтрування, при якій застосовують мікропористі або напівпроникні мембрани для переважного відділення рідин або іонів на основі різного розміру або молекулярної маси. Ультрафільтрування, як правило, застосовують для відділення шляхом фільтрування молекул, молекулярна маса яких перевищує приблизно 10000 Да. Цей винахід спрямований на інтегрований, безперервний і стерильний процес, що включає безперервне перфузійне ферментування, видалення частинок і виділення та очищення/концентрування. Згідно з одним з аспектів цього винаходу, згаданий процес включає фільтрування тканинної культуральної суміші за допомогою процесу виділення, шляхом якого здійснюється селективне виділення білка, що становить інтерес, із суміші в заданій робочій точці, обраній нижче граничної точки на залежній від тиску ділянці кривої потіктрансмембранний тиск, побудованої для згаданого білка, з одержанням стерильного вільного від частинок концентрованого і частково очищеного виділеного продукту, причому питому швидкість потоку протягом процесу виділення підтримують по суті постійною на рівні, обраному нижче граничної точки на кривій потік-трансмембранний тиск, побудованій для згаданого білка. Згідно з іншим аспектом цього винаходу, згаданий процес являє собою безперервний процес, що включає: (а) безперервне одержання за допомогою безперервного перфузійного ферментування гетерогенної тканинної культуральної рідкої суміші, яка містить білок, що становить інтерес; (b) безперервне переміщення згаданої тканинної культуральної рідкої суміші в обладнання для виконання процесу видалення частинок, інтегрованого із системою безперервного перфузійного ферментування; (с) безперервне видалення великодисперсних забруднювачів із тканинної культуральної рідини в ході процесу видалення частинок із безперервним одержанням просвітленої тканинної культуральної рідини, яка містить білок, що становить інтерес; (d) безперервне переміщення згаданої просвітленої тканинної культуральної рідини в обладнання для виконання процесу виділення та очищення, інтегрованого із системою видалення частинок; і (e) постійне виділення білка, що становить інтерес, із просвітленої тканинної культуральної рідини в системі виділення та очищення для постійного одержання стерильного вільного від частинок концентрованого і частково очищеного виділеного продукту, який містить білок, що становить інтерес. Згідно із ще одним аспектом цього винаходу, згаданий процес являє собою напівбезперервний процес, що включає: (а) безперервне одержання шляхом безперервного перфузійного ферментування гетерогенної тканинної культуральної рідкої суміші, яка містить білок, що становить інтерес; (b) безперервне переміщення згаданої тканинної культуральної рідкої суміші в обладнання для виконання процесу видалення частинок, інтегрованого із системою безперервного перфузійного ферментування; (с) безперервне видалення великодисперсних забруднювачів із тканинної культуральної рідини в ході процесу видалення частинок із безперервним одержанням просвітленої тканинної культуральної рідини, яка містить білок, що становить інтерес; (d) безперервне переміщення згаданої просвітленої тканинної культуральної рідини в зрівняльний резервуар, інтегрований в процес видалення частинок; (e) періодичне переміщення просвітленої тканинної культуральної рідини в обладнання для виконання процесу виділення та очищення, інтегрованому зі зрівняльним резервуаром; і (f) виділення білка, що становить інтерес, із просвітленої тканинної культуральної рідини та його очищення в системі виділення та очищення з одержанням стерильного вільного від частинок концентрованого і частково очищеного виділеного продукту, який містить білок, що становить інтерес, причому питому швидкість потоку згаданої суміші в ході безперервного процесу перфузійного ферментування і безперервного процесу видалення частинок підтримують на по суті постійному рівні, і вона в середньому дорівнює усередненій за часом пропускній спроможності інтегрованого напівбезперервного процесу виділення та очищення. Пристрої для практичного здійснення способів, запропонованих даним винаходом Цей винахід спрямований також на апарат для виділення білка, що становить інтерес, із гетерогенної тканинної культуральної рідкої суміші. Загалом, апарат включає: (а) систему безперервного перфузійного ферментування; (b) систему безперервного видалення частинок, інтегровану із системою перфузійного ферментування; і (с) систему безперервного виділення та очищення, інтегровану із системою видалення частинок, причому згаданий апарат виконаний з можливістю підтримування стерильних умов. Згідно з іншим аспектом цього винаходу, апарат включає: (а) систему безперервного перфузійного ферментування; (b) систему безперервного видалення частинок, інтегровану із системою перфузійного ферментування; і (с) систему періодичного виділення та очищення, інтегровану із системою видалення частинок, причому 8 UA 107937 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 згаданий апарат виконаний з можливістю підтримування стерильних умов. Згаданою системою виділення та очищення може бути, наприклад, система ультрафільтрування або система конвективного адсорбування/десорбування або будь-яка інша система, здатна виділяти білок, що становить інтерес, із гетерогенної суміші та очищати або частково очищати його в інтегрованій безперервній або напівбезперервній стерильній системі, опис якої представлений. Процес і апарат, запропоновані даним винаходом, забезпечують безперервну обробку гетерогенної тканинної культуральної рідкої суміші з по суті постійною швидкістю потоку. Згідно з конкретним аспектом цього винаходу, процес і апарат, запропоновані даним винаходом, забезпечують безперервну обробку гетерогенної тканинної культуральної рідкої суміші з по суті постійною швидкістю потоку, обраною нижче граничної точки на залежній від тиску ділянці кривої потік-трансмембранний тиск, побудованої для білка, що становить інтерес, протягом безперервного періоду часу і в ході всього процесу виділення та очищення. Згідно з конкретними прикладами здійснення, цей винахід пропонує два нові пристрої (А, В), кожний з яких складається з 3 різних, однак повністю інтегрованих елементів, всі з яких відіграють істотну роль і спільно утворюють таку, що відрізняється особливою ефективністю, робочу установку по безперервному виділенню білка, яка вирішує проблеми відомого рівня техніки, описані вище. Трьома різними елементами кожного пристрою є, по-перше, інтегрована система (100) безперервного видалення частинок, по-друге, стерильний зрівняльний резервуар (200) і, потретє, інтегрована система концентрування/виділення та очищення (300, 400, відповідно). Всі три елементи, таким чином, являють собою нові розроблені пристрої, і способи застосування цих пристроїв детально описані нижче. Для забезпечення інтегрованого безперервного або напівбезперервного концентрування/виділення та очищення білкового продукту, запропонований даним винаходом пристрій А (два варіанти здійснення якого показані на Фіг. 2) включає інтегровану систему (300) безперервного стерильного ультрафільтрування, в той час як запропонований даним винаходом пристрій В (2 варіанти здійснення якого показані на Фіг. 3) включає інтегровану систему (400) напівбезперервного конвективного адсорбування/десорбування. Пристрої, запропоновані даним винаходом, безпосередньо інтегровані з одним або декількома перфузійними ферментерами безперервної дії і, таким чином, утворюють нову інтегровану робочу установку безперервної дії. Пристрій А Інтегрована система (100) безперервного видалення частинок На Фіг. 2 показані 2 варіанти здійснення пристрою А, запропонованого даним винаходом. Інтегрована система (100) безперервного видалення частинок безпосередньо приєднана до боку відбору продукту системи (1) безперервного перфузійного ферментування. На Фіг. 4 представлене більш докладне схематичне зображення варіанта здійснення запропонованої даним винаходом інтегрованої системи (100) безперервного видалення частинок, до складу якої входять насос (101), манометр або датчик (107), відповідно, з'єднувальна магістраль (102) і вузол (103), що включає декілька агрегатів із послідовно розташованих фільтрів. Всі складові частини з'єднані шлангами і/або трубами. Насосом (101) є звичайний перистальтичний насос, що забезпечує акуратне перекачування продукту без яких-небудь обертових частин або сальників, що контактують зі стерильним продуктом. Величина параметрів насоса і трубопроводів підбирається таким чином, щоб забезпечувалася необхідна швидкість потоку продукту, одержаного із системи ферментування культури клітин, що складає до 15 об'ємів біореактора в день, наприклад, до 9,4 л/год. у разі ферментера місткістю 15 л і до 125 л/год. у разі ферментера місткістю 200 л. Конструкцією манометра або датчика тиску (107) передбачається можливість їх стерилізації шляхом автоклавування або опромінення. У сучасних конструкціях застосовуються або п'єзорезистивний датчик багаторазового використання в корпусі з неіржавіючої сталі або манометр багаторазового використання з неіржавіючої сталі. Додаткові удосконалення, однак, можуть включати застосування одноразових датчиків, які можуть легко стерилізуватися за допомогою опромінення. Згідно з представленим варіантом здійснення, з'єднувальна магістраль (102) виконана зі шлангів, де трубні затискачі (або клапани) і відповідні стерильні з'єднувачі забезпечують можливість приєднання додаткових вузлів, що включають декілька агрегатів із послідовно розташованих фільтрів, без порушення стерильності системи. Згідно з варіантом, якому віддається перевага, діаметр трубопроводів підібраний таким чином, щоб забезпечувати лінійні швидкості рідини в межах приблизно 2 м/с або менш при необхідній витраті, що дозволяє уникнути високого протитиску і зсувних зусиль. У іншому представленому варіанті здійснення, 9 UA 107937 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 замість стерильних з'єднувачів застосовуються спеціальні гнучкі відрізки труб, які можуть зварюватися за допомогою промислових трубних зварювальних машин без порушення стерильності. Такі відрізки труб виготовляються з поліхлорвінілу або інших придатних полімерів. До складу вузла (103), що включає декілька агрегатів із послідовно розташованих фільтрів, входить як мінімум два, згідно з варіантом, якому віддається перевага, більша кількість ідентичних агрегатів із послідовно розташованих фільтрів (як показано на схематичному зображенні), причому в будь-який даний час відкритим є лише один із агрегатів із послідовно розташованих фільтрів, як показано у вигляді прикладу на Фіг. 4 (105). До складу кожного агрегату з послідовно розташованих фільтрів входить як мінімум один фільтр, згідно з варіантом, якому віддається перевага, послідовно з'єднані один фільтр для попереднього очищення і один фільтр тонкого очищення (як показано на Фіг. 4). У разі необхідності підвищення пропускної спроможності для конкретного варіанта здійснення, кожний агрегат із послідовно розташованих фільтрів (105, 106 і т.д.) сам по собі може також включати велику кількість паралельно з'єднаних фільтрів або агрегатів із послідовно розташованих фільтрів (не показано). Згідно з варіантом здійснення цього винаходу, показаним на Фіг. 4, другий агрегат із послідовно розташованих фільтрів вузла (106) перекривається чутливим до тиску розривним диском або розривним штифтом (104), відповідно. У процесі роботи функція розривного диска або розривного штифта полягає в автоматичному відкритті проходу на другий агрегат (107) із послідовно розташованих фільтрів у випадку, якщо тиск на першому агрегаті (105) із послідовно розташованих фільтрів досягне певної межі, завдяки чому забезпечується безперервне продовження процесу фільтрування. У системі, запропонованій даним винаходом, застосовуються комерційно доступні розривні диски або розривні штифти, які, в іншому випадку, застосовуються для забезпечення безпечного скидання тиску. У представленому варіанті здійснення застосовуються розривні диски або розривні штифти, що виявилися вельми 2 2 корисними, з граничним заданим тиском розриву не більш за 16 фунт/дюйм (1,125 кг/см ). Можливий, однак, діапазон граничного заданого тиску. Кожний додатковий агрегат із послідовно розташованих фільтрів вузла, що включає декілька агрегатів із послідовно розташованих фільтрів відділяється також ручним або автоматичним клапаном і іншим розривним диском або розривним штифтом. Після вступу в роботу другого агрегату (106) з послідовно розташованих фільтрів, відкривається клапан на наступний розривний диск або розривний штифт, відповідно, завдяки чому наступний агрегат із послідовно розташованих фільтрів може виконувати роль резервного і т.д. За альтернативним варіантом здійснення застосовуються виключно автоматичні клапани, і в процесі роботи система керування приводить у дію клапани під впливом вхідного сигналу п'єзорезистивного датчика (107) тиску, який також може стерилізуватися за допомогою автоклавування. Заявники встановили, однак, що представлена конструкція, що включає розривний диск або розривний штифт, відповідно, забезпечує можливість вельми стійкої довгострокової експлуатації. Номінальна допустима межа фільтра тонкого очищення становить як мінімум 3 мкм або менше, згідно з варіантом, якому віддається перевага, 0,45 мкм і згідно з варіантом, якому віддається більша перевага, 0,2 мкм. Таким чином, агрегат (6) із послідовно розташованих фільтрів, що знаходиться в роботі, затримує всі інші клітини, а також відповідний дебрис клітин і інші частинки, наслідком чого є одержання вільного від частинок вихідного потоку (9) просвітленої тканинної культуральної рідини (cTCF). Можуть застосовуватися різні комерційно доступні фільтрувальні матеріали. У фільтрах сучасної конструкції застосовуються одноразові фільтрувальні капсули, наприклад, капсули для попереднього очищення Sartopure або Sartoclear (фірма Sartorius, Goettingen) і капсули тонкого очищення Sartobran (фірма Sartorius, Goettingen), які можуть стерилізуватися за допомогою автоклавування або опромінення. Як приклад запропонованого варіанта здійснення пристрою за даним винаходом розробленого для витрати 1 л/хв, кожний агрегат (105, 106 і т.д.) із послідовно розташованих фільтрів вузла (103) включає три 30" (761,99 мм) капсули для попереднього очищення 2 (Kleenpak Ultipleat, Pall Corp., номінальна допустима межа 4,5 мкм, кожна площею 0,75 м ), за якими йде три 20" (507,99 мм) капсули тонкого очищення (Sartobran P, Sartorius, номінальна 2 допустима межа 0,45 мкм/0,2 мкм, кожна площею 1,3 м ). Було встановлено, що даний конкретний варіант здійснення є особливо корисним для виробничого одержання рекомбінантного фактора VIII системи згортання крові, а також генноінженерного варіанта FVIII, в тому числі FVIII із делецією В-домена. 10 UA 107937 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Заявники, однак, встановили також, що у разі застосування пристрою і способу, запропонованих даним винаходом, ефективність видалення частинок за допомогою різноманітних доступних фільтрувальних матеріалів і конфігурацій від різних виробників (фірми Pall, Sartorius, Cuno) послідовно і значно поліпшується в порівнянні з відповідними традиційними періодичними процесами. Таким чином, нові пристрій і процес, запропоновані даним винаходом, будуть також вигідними у разі застосування із фільтрами нових типів і конфігурацій, наприклад, із фільтрами таких типів, які збільшують доступну площу фільтрування/мембрани, а також із фільтрами таких типів, які забезпечують утворення перехресних потоків або інші можливості зведення утворення відфільтрованого осаду до мінімального рівня, наприклад, за допомогою вібрації або обертання елементів фільтра. У іншому варіанті здійснення процесу за даним винаходом до складу вузла (103), що включає декілька агрегатів з послідовно розташованих фільтрів, входить усього один стерильний резервний агрегат із послідовно розташованих фільтрів, замкнений розривним диском або розривним штифтом, відповідно, але для роботи в ньому передбачена велика кількість агрегатів із послідовно розташованих фільтрів. Перший агрегат із послідовно розташованих фільтрів згаданого вузла працює до завершення обробки певного заздалегідь встановленого об'єму завантаження, після чого процес перемикається (вручну або автоматично) на наступний агрегат із послідовно розташованих фільтрів згаданого вузла. Певний об'єм завантаження встановлюється таким чином, що при нормальних робочих умовах межа тиску розривного диска або розривного штифта не перевищується. Якщо ж, однак, в процесі фільтрування тиск зростає більше звичайного, наприклад, внаслідок незвичайно низького фільтрування продукту, резервний агрегат із послідовно розташованих фільтрів знову забезпечує безперервну постійну фільтрування, відкриваючись відразу ж після перевищення встановленого тиску. Після відкриття резервного агрегату з послідовно розташованих фільтрів, фільтрування перемикається на інший агрегат із послідовно розташованих фільтрів згаданого вузла, і інший резервний агрегат із послідовно розташованих фільтрів із розривним диском або розривним штифтом встановлюється без порушення стерильності системи. Фахівцям у цій галузі добре відомо, що для підтримки як витрат на фільтрування, так і часу обробки у разі періодичних процесів видалення частинок на мінімальному рівні, величина параметрів періодично діючих агрегатів з послідовно розташованих фільтрів повинна підбиратися таким чином, щоб площа фільтрування, необхідна для забезпечення необхідної абсолютної швидкості потоку (в л/год.) і максимального тиску була, по можливості, максимально низькою. Необхідна абсолютна швидкість потоку, в свою чергу, повинна бути досить високою для забезпечення прийнятного часу обробки партії необхідного об'єму. Це, по своїй суті, 2 зумовлює необхідність високої питомої швидкості потоку (в л/год./м площі фільтрування). У протилежність порівнянній оптимізованій системі періодичного фільтрування, пристрій, запропонований даним винаходом, в конструктивному відношенні призначено для в декілька 2 разів більш низької питомої швидкості потоку, яка утримується на постійному рівні (в л/год./м встановленій площі фільтрування), завдяки чому абсолютна швидкість потоку дорівнює швидкості потоку продукту безперервного ферментування. Заявники несподівано встановили, що об'єм, який може пропускатися через фільтр при таких низьких питомих швидкостях потоку, виявляється непропорційно більш високим, ніж при швидкостях потоку, встановлених в періодичних процесах. Важливо зазначити, що в традиційних періодичних процесах виділення такі низькі питомі швидкості потоку недосяжні внаслідок або граничних площ фільтрування (і, отже, витрат), або дуже низької абсолютної швидкості потоку. Подібне зумовлене головним чином тим, що обладнання для періодичного видалення частинок більшу частину часу не діє, в той час як здійснюється збір продукту для наступної партії. Більш того разюче непропорційне збільшення досяжної пропускної спроможності фільтра в способі, запропонованому даним винаходом, забезпечує можливість значного зниження ступеня зносу фільтра і, тим самим, витрат виробництва. Зрівняльний резервуар (200) Вихідний отвір інтегрованої системи безперервного видалення частинок безпосередньо і постійно приєднаний до зрівняльного резервуара (201), як показано на Фіг. 2. Цей зрівняльний резервуар є стерильним резервуаром, наприклад, одноразовим м'яким резервуаром або резервуаром із неіржавіючої сталі з як мінімум одним вхідним отвором і одним вихідним отвором, причому останній, згідно з варіантом, якому віддається перевага, розташований в донній частині резервуара. Можуть застосовуватися резервуари найрізноманітніших розмірів і конструкцій. Однак величина параметрів зрівняльного резервуара, згідно з варіантом, якому 11 UA 107937 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 віддається перевага, підбирається таким чином, щоб він був невеликим в порівнянні з об'ємною пропускною спроможністю системи для підтримування часу перебування продукту в резервуарі на мінімальному рівні, тобто протягом менше за 24 год., згідно з варіантом, якому віддається перевага, протягом менше за 8 год. і згідно з варіантом, якому віддається ще більша перевага, протягом менше за 4 год. Заявники виявили, що такий короткий час перебування продукту в системі, можливий винятково завдяки пристроям, запропонованим даним винаходом, забезпечує значне збільшення виходу нестійких по своїй суті білкових продуктів, що вирішує одну з проблем відомого рівня техніки. У деяких варіантах здійснення пристроїв, запропонованих даним винаходом, зрівняльний резервуар розміщується на вимірювальній месдозі або динамометричному елементі (202), як показано у разі пристрою В1 і В2 на Фіг. 3. Ця вимірювальна месдоза або динамометричний елемент забезпечує подачу вагового сигналу на комп'ютеризовану систему керування (не показана). На додаток до цього, у варіанті здійснення пристроїв (В2), запропонованих даним винаходом, буферний резервуар (204) підключається до зрівняльного резервуара через перистальтичний насос (203). У робочих умовах подібний пристрій застосовують для регулювання властивостей вільного від частинок потоку продукту, наприклад, електропровідності (іонної сили) або рН, шляхом додання придатного буфера або розріджувача. У подібному випадку застосовують факультативну систему (205) змішування і датчики для контролювання необхідної умови (206), наприклад, рН або електропровідності. У конструктивному рішенні, що пропонується, застосовується магнітна мішалка; застосовуватися, однак, можуть також інші системи змішування, наприклад, вібратори або пульсуючі пристрої. Інтегрована система (300) безперервного концентрування/виділення та очищення До складу пристрою А, 2 варіанти здійснення якого представлені на Фіг. 2, входить інтегрована система (300) безперервного стерильного ультрафільтрування. До складу варіантів здійснення системи безперервного стерильного ультрафільтрування входить рециркуляційний насос (301) і рециркуляційний обвідний трубопровід (306), один або декілька стерильних ультрафільтрувальних модулів (303) із перехресним потоком, насос (305) для перекачування фільтрату, стерильна приймальна посудина (307) фільтрату на вимірювальній месдозі або динамометричному елементі (309) і насос (311) для перекачування осаду. У доповнення до цього, до її складу входять контрольно-вимірювальні прилади у вигляді вхідного манометра або датчика (302), манометра фільтрату або датчика (304), вихідного манометра або датчика (308), а також рециркуляційний витратомір (310). У процесі роботи вихідний отвір (312) системи видає безперервний потік концентрованого і частково очищеного білкового продукту, який можна безперервно збирати, заморожувати або піддавати додатковій обробці. До складу варіанта здійснення А2, запропонованого даним винаходом, додатково входить резервуар (314) для буфера або розріджувача, перистальтичний насос (313) для додаткового подавання буфера/розріджувача, а також проточні датчики для контролювання стану концентрату в рециркуляційному обвідному трубопроводі, наприклад, датчики (315, 316) рН і електропровідності. У процесі роботи подібний пристрій застосовується для регулювання властивостей вільного від частинок потоку продукту, наприклад, електропровідності (іонної сили) або рН, за допомогою додання придатного буфера або розріджувача. Цей пристрій може застосовуватися також для додання стабілізаторів білка. Незважаючи на те, що у варіанті здійснення А2, запропонованому даним винаходом, сам рециркуляційний обвідний трубопровід виконує роль змішувальної камери, додаткове модифікування може також здійснюватися за допомогою зрівняльного резервуара, який показаний для пристрою В (варіант здійснення В2), до складу якого входять елементи (203, 204, 205, 206), що буде обговорюватися нижче в цьому описі (дивися опис пристрою В). До складу варіантів здійснення пристрою за даним винаходом також входить програмовна система керування і реєстрації даних, яка реєструє вхідні сигнали даних від контрольновимірювальних приладів (наприклад, однак, без обмеження, тиск, швидкість потоку, масу резервуара, рН, електропровідність) і регулює частоту обертання насосів згідно із заздалегідь розробленим алгоритмом керування. Всі насоси (301, 305, 311, 313) є перистальтичними насосами, що забезпечує можливість перекачування потоків відповідних рідин без яких-небудь обертових частин або сальників, що контактують із потоком стерильного продукту. Заявники встановили, що подібному варіанту віддається перевага для забезпечення надійної тривалої роботи в стерильних умовах. У принципі, однак, можуть застосовуватися стерильні насоси інших конструкцій. Величина параметрів рециркуляційного насоса (301) і відповідних трубопроводів підбирається таким 12 UA 107937 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 чином, щоб забезпечувалося надійне регулювання необхідної швидкості перехресних потоків в 2 межах 80-800 л/год. на м площі встановленої мембрани, в залежності від характеристик масопереносу застосовуваного ультрафільтраційного модуля. Величина параметрів насоса для перекачування фільтрату задається таким чином, щоб забезпечувалося надійне і точне регулювання питомого потоку фільтрату в межах 90-99 % від швидкості потоку продукту безперервного перфузійного ферментування. Величина параметрів насоса для перекачування осаду задається таким чином, щоб забезпечувалося надійне і точне регулювання потоку осаду речовини в межах 1-10 % від швидкості потоку продукту безперервного перфузійного ферментування. Герметизовані ультрафільтраційні модулі (303) застосовуються для забезпечення надійної стерильної роботи і стерилізуються шляхом автоклавування або опромінення. Оптимальну смугу пропускання номінальної молекулярної маси вибирають виходячи з молекулярної маси білкового продукту, що становить інтерес, і вона повинна бути підтверджена стандартними експериментами, відомими фахівцям в даній галузі. Різноманітні мембранні матеріали, наприклад, поліефірсульфон, гідрофілізований поліефірсульфон або регенерована целюлоза, можуть застосовуватися доти, доки мембранний модуль загалом може стерилізуватися шляхом опромінення і/або автоклавування без пошкодження мембрани. Очікується, що гідрофільні матеріали можуть підвищити ефективність завдяки властивій їм меншій схильності до забруднення. Заявники виявили, що пристрій А виключно ефективний в тому випадку, якщо сумарна площа встановленої ультрафільтраційної мембрани в квадратних метрах знаходиться в межах 0,1-2 об'ємних швидкостей потоку продукту безперервного перфузійного ферментування в л/год. Наприклад, у разі швидкості потоку продукту безперервного перфузійного ферментування, що становить 1 л/год., сумарна площа встановленої мембрани повинна 2 становити 0,1-2 м . Заявники встановили, що пристрій А діє ще ефективніше, якщо площа встановленої ультрафільтраційної мембрани в квадратних метрах знаходиться в межах 0,3-1 об'ємної швидкості потоку продукту безперервного перфузійного ферментування в л/год. У одному з варіантів здійснення цього винаходу застосовуються комерційно доступні "одноразові" порожнистоволоконні мембранні модулі (фірма GE Healthcare, колишня Amersham Biosciences). Можуть, однак, застосовуватися герметизовані мембрани і модулі різних конструкцій, наприклад, спіральні модулі, герметизовані касети або капсули з підвищеним масопереносом внаслідок виникнення побічної течії (наприклад, вихрового потоку), обертові елементи (наприклад, ротаційні фільтри дискового типу) або вібраційні фільтри. Очікується, що особливо вигідним в пристроях, запропонованих даним винаходом, буде застосування герметизованих ультрафільтрувальних касет, оскільки вони забезпечують високі коефіцієнти масопереносу при відносно низькій необхідній швидкості перехресного потоку, що веде до зниження продуктивності насоса з одночасним зниженням складності системи і витрат на капітальні вкладення. Пристрій, запропонований даним винаходом, забезпечує не тільки безперервну, але і стерильну в істинному значенні цього слова роботу, в протилежність роботі лише в асептичних умовах. Заявникам вдалося добитися цього за допомогою конструювання всіх елементів системи, що контактують із продуктом, таким чином, щоб вони витримували не тільки очищення, але також і стерилізування шляхом автоклавування, обробки гострою парою in situ або гамма-опромінення. У представлених варіантах здійснення одноразові герметизовані модулі застосовуються для безперервного видалення (100) частинок, а також для безперервного ультрафільтрування (300). Перистальтичні насоси застосовуються щоб уникнути будь-якого контактування продукту з обертовими елементами і механічними сальниками. Більш того в представлених варіантах здійснення замість твердих труб застосовуються одноразові вузли, до складу яких входять гнучкі трубопроводи і м'які резервуари. Одноразові елементи, що контактують із продуктом (наприклад, шланги, м'які резервуари, модулі) або групи елементів заздалегідь збираються і стерилізуються як єдине ціле, спрощуючи тим самим, запуск і експлуатацію. Системи сконструйовані таким чином (наприклад, витяжна шафа з ламінарним потоком), щоб ступінь будь-якого потенційного контактування стерильної системи з навколишнім середовищем, наприклад, для відбору проб, заміни м'яких резервуарів або контрольно-вимірювальних приладів, зводився до мінімального рівня. У представлених варіантах здійснення даного пристрою розподільні магістралі сконструйовані з резервуванням для забезпечення перемикання з одного стерильного елемента (наприклад, м'якого резервуара для приймання продукту) на наступний без розкриття. Додаткова заміна шлангів, модулів або м'яких резервуарів, згідно з варіантом, якому віддається перевага, здійснюється за допомогою стерильних трубних зварювальних машин, а не стерильних з'єднувачів. 13 UA 107937 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Інші додаткові варіанти здійснення пристроїв, запропонованих даним винаходом, можуть також включати такі елементи, як резервуари з неіржавіючої сталі, корпуси фільтрів або шланги, які можуть стерилізуватися на місці, самостійно або в сполученні з одноразовими елементами доти, доки забезпечується надійність і стерильність довготривалої експлуатації. Додаткові варіанти здійснення пристрою А за даним винаходом призначені для обробки матеріалу, що надходить із численних ферментерів на більш великих виробничих установках (A3). Приклад в схематичному зображенні представлений на Фіг. 5. Додаткові варіанти здійснення призначені для підвищення сумарного коефіцієнта концентрації і ефективності відділення за допомогою послідовного об'єднання 2 ступенів системи (300) безперервного ультрафільтрування (А4, схематично представлений на Фіг. 5). Опис способу застосування пристрою А Безперервний процес перфузійного ферментування здійснюють протягом тривалого періоду часу (одна кампанія), тривалість якого, як правило, становить від 2 тижнів до 6 місяців або більш. Тканинну культуральну рідину (TCF), що містить продукт, клітини і дебрис клітин, безперервно обробляють за допомогою пристрою А. Одержують потік стерильного вільного від частинок концентрованого і частково очищеного продукту ("виділений продукт"), який безперервно виходить зі згаданого пристрою через його вихідний отвір (312). За допомогою насоса (101) системи (100) безперервного стерильного видалення частинок продукт безперервно прокачується через фільтрувальний вузол (103) із необхідною швидкістю Qh потоку продукту безперервного перфузійного ферментування. Вихідний потік системи безперервного фільтрування, тобто просвітлена тканинна культуральна рідина (cTCF), безперервно надходить у зрівняльний резервуар (201). cTCF із зрівняльного резервуара безперервно обробляється системою (300) безперервного стерильного ультрафільтрування при швидкості потоку, що дорівнює швидкості потоку, який виходить із системи безперервного перфузійного ферментування. Внаслідок невеликого розміру зрівняльного резервуара в порівнянні з встановленими швидкостями потоку, середній час перебування продукту в резервуарі утримується на мінімальному рівні, тобто менше за 12 год., згідно з варіантом, якому віддається перевага, менше за 4 год. і згідно з варіантом, якому віддається ще більша перевага, менше за 2 год. Відповідний перехресний потік і, тим самим, масоперенос, регулюються в ультрафільтраційному модулі за допомогою рециркуляційного насоса (301). Швидкість потоку осаду регулюється і контролюється за допомогою насоса (311) для перекачування осаду, завдяки чому забезпечується постійна і безперервна швидкість Qi потоку концентрованого виділеного продукту, що виходить із пристрою А через його вихідний отвір (312). Насос (305) для перекачування фільтрату застосовується для регулювання і контролювання швидкості Qp потоку фільтрату, який безперервно відбирається на боці виходу фільтрату ультрафільтраційного модуля(- їй), і який складається з води і компонентів розчину, які досить малі для проходження через ультрафільтраційну мембрану (наприклад, солі, невеликі білки). Швидкості потоків фільтрату (Qp) і осаду/виділеного продукту (Qi) ретельно регулюють і контролюють для того, щоб вони відповідали швидкості Qh потоку продукту ферментування, так щоб: Qp+Qi=Qh. Одночасно із цим, швидкості потоків регулюють і контролюють, так щоб досягався необхідний коефіцієнт концентрації cf із задоволенням умови: Qi=l/cf·Qh. Наприклад, для одержання необхідного коефіцієнта (10 у виділеному продукті) концентрації продукту в порівнянні з початковою концентрацією продукту Qi витримують на рівні Qi=1/10·Qh за допомогою насоса (311) для перекачування осаду/виділеного продукту, в той час як Qp витримують на рівні Qp=0,9·Qh за допомогою насоса (305) для перекачування фільтрату. Оскільки швидкість вихідного потоку контролюється за допомогою насосів (305) і (311), система ультрафільтрування автоматично відбирає потік Qp+Qi з невеликого зрівняльного резервуара (201). У разі застосування варіанта здійснення А2 (дивися праву частину Фіг. 2), стерильний потік буфера або води для ін'єкцій з резервуара 314 безперервно додають у систему безперервного ультрафільтрування з постійною швидкістю Qb потоку за допомогою насоса (313) для додаткового подавання буфера. Таким чином, стан виділеного продукту може вільно і безперервно регулюватися, наприклад, із точки зору іонної сили, рН, додання стабілізаторів тощо. Швидкість потоків, таким чином, контролюється на рівні Qp+Qi=Qh+Qb. 14 UA 107937 C2 5 10 15 20 У доповнення до цього, співвідношення швидкостей потоків можуть підбиратися таким чином, щоб був одержаний необхідний коефіцієнт концентрації cf шляхом задоволення умови Qi=l/cf·(Qh+Qb). Згідно з альтернативним варіантом, цей процес може застосовуватися лише для зміни умов (наприклад, рН, електропровідності) шляхом встановлення Qi=Qh+Qb. Новий спосіб застосування пристрою А відрізняється також від періодичних процесів ультрафільтрування (відомий рівень техніки) відносно заданої робочої точки самого ультрафільтрування. Традиційні періодичні процеси ультрафільтрування розраховані на певну пропускну спроможність через невелику площу мембрани протягом короткого періоду часу. Періодичний процес ультрафільтрування, таким чином, здійснюється, як правило, в граничній точці між ділянкою регулювання тиском та ділянкою регулювання масопереносом (дивися Фіг. 9). Наслідком цього є одержання бажано високого початкового питомого потоку, який, однак, значно і швидко (протягом періоду часу тривалістю від секунд до хвилин) знижується, оскільки концентраційна поляризація призводить до швидкого виникнення осмотичного протитиску і утворення обмежувального шару гелю (вторинна мембрана). Наслідком такої високої пристінкової концентрації макромолекул також є підвищена адсорбція сполук до внутрішньої і зовнішньої поверхні мембрани, тобто забруднення мембрани. Це забруднення згодом додатково знижує потік фільтрату. Заявники несподівано виявили, що у разі пристрою А у багато разів більш високе сумарне допустиме навантаження на площу встановленої ультрафільтраційної мембрани досягається при роботі на нижньому кінці кривої залежності потоку від тиску (дивися Фіг. 9). Нормалізована пристінкова концентрація cwall повністю затриманого компонента може описуватися таким чином: J kd 25 30 35 40 c wall  e  c bulk , де: 2 J - питомий потік фільтрату в л/год./м ; 2 kd - коефіцієнт масопереносу в л/год./м ; Cbulk - концентрація компонента в основній масі розчину. Подібно до періодичного ультрафільтрування, безперервне ультрафільтрування здійснюється при оптимізованому коефіцієнті масопереносу для зведення концентраційної поляризації до мінімального рівня. Однак, у протилежність до періодичного ультрафільтрування, заявники встановлюють потік J фільтрату на низькому кінці кривої залежності потоку від тиску (дивися Фіг. 9). Внаслідок експонентної залежності, пристінкова концентрація cwall на поверхні мембрани, таким чином, виявляється значно нижче, ніж вона була б у разі періодичного ультрафільтрування. Наприклад, представлений варіант здійснення способу за даним винаходом встановлює цільовий питомий потік фільтрату на рівні приблизно 1/10 досяжного коефіцієнта масопереносу, встановлюючи тим самим пристінкову концентрацію, що лише на 10 % перевищує встановлену концентрацію основного об'єму (або осідання). У приведеній нижче Таблиці 1 показаний приклад способу застосування пристрою А (варіант здійснення А1) для безперервного виділення білкового продукту із ферментера, що знаходиться в процесі розробки: Таблиця 1 Приклад способу застосування представленого варіанта здійснення пристрою А для безперервного виділення білкового продукту при безперервному перфузійному ферментуванні Робочий параметр Швидкість Qh потоку продукту безперервного перфузійного ферментування (контролюється насосом 101) Швидкість Qp потоку фільтрату (контролюється насосом 305) Швидкість Qi потоку осаду (виділеного продукту) (контролюється насосом 311) Питомий потік J фільтрату Коефіцієнт концентрації cf 45 Мета 5 л/год. (120 л/день) 4,75 л/год. 0,25 л/год. 2 2 л/год./м Двадцятикратний Для кожної окремої молекули продукту критерії довговічності можуть визначатися для установки стерильного безперервного ультрафільтрування, наприклад, на основі трансмембранного тиску. Після перевищення межі трансмембранного тиску, установка безперервного стерильного ультрафільтрування замінюється іншою ідентичною установкою без 15 UA 107937 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 порушення цілісності і стерильності системи. Це може здійснюватися аналогічно з установкою безперервного стерильного ультрафільтрування шляхом застосування або розподільних магістралей і стерильних з'єднувачів, або шляхом застосування одноразових шлангів і стерильних трубних зварювальних машин. Пристрій В Інтегрована система (100) безперервного видалення частинок На Фіг. 3 показані 2 варіанти здійснення пристрою В, запропонованого даним винаходом. Інтегрована система (100) безперервного видалення частинок безпосередньо приєднана до боку відбору продукту системи (1) безперервного перфузійного ферментування. Ця частина пристрою В ідентична пристрою А (дивися приведений вище докладний опис пристрою А і Фіг. 4). Зрівняльний резервуар (200) Вихідний отвір інтегрованої системи безперервного видалення частинок безпосередньо і постійно приєднаний до зрівняльного резервуара (201), як показано на Фіг. 3. Цей зрівняльний резервуар є стерильним резервуаром, наприклад, одноразовим м'яким резервуаром або резервуаром із неіржавіючої сталі з як мінімум одним вхідним отвором і одним вихідним отвором, причому останній, згідно з варіантом, якому віддається перевага, розташовано в донній частині резервуара. Можуть застосовуватися резервуари найрізноманітніших розмірів і конструкцій. Однак величина параметрів зрівняльного резервуара, згідно з варіантом, якому віддається перевага, підбирається таким чином, щоб він був невеликим в порівнянні з об'ємною пропускною спроможністю системи для підтримування часу перебування продукту в резервуарі на мінімальному рівні, тобто протягом менше за 26 год., згідно з варіантом, якому віддається перевага, протягом менше за 12 год. і згідно з варіантом, якому віддається ще більша перевага, протягом менше за 4 год. У пристрої В зрівняльний резервуар розміщується на вимірювальній месдозі або динамометричному елементі (202), як показано для варіантів здійснення В1 і В2 на Фіг. 3. Ця вимірювальна месдоза або динамометричний елемент забезпечує подавання вагового сигналу на комп'ютеризовану систему керування (не показана). У доповнення до цього, у варіанті здійснення пристрою (В2) за даним винаходом буферний резервуар (204) підключається до зрівняльного резервуара через перистальтичний насос (203). У робочих умовах подібний пристрій застосовують для регулювання властивостей вільного від частинок потоку продукту, наприклад, електропровідності (іонної сили) або рН, за допомогою додання компонентів для модифікування властивостей просвітленої тканинної культуральної рідини, одержаної із системи видалення частинок, наприклад, придатного буфера або розріджувача або придатного стабілізатора білка. У подібному випадку, до складу представленого варіанта здійснення також входить система (205) змішування і датчики для контролювання необхідної умови (206), наприклад, рН або електропровідності. У запропонованому варіанті здійснення застосовується магнітна мішалка; однак застосовуватися можуть також інші системи змішування, наприклад, вібратори або пульсуючі пристрої. У іншому варіанті здійснення пристрою за даним винаходом застосовуються 2 зрівняльних резервуара. У будь-який даний момент один зрівняльний резервуар безпосередньо приєднаний до системи (100) безперервного видалення частинок, приймаючи, тим самим, просвітлену рідину, в той час як інший зрівняльний резервуар приєднаний до системи (400) напівбезперервного концентрування/виділення та очищення, постачаючи, внаслідок цього, потік на цикл конвективного адсорбування/десорбування. Перемикання між зрівняльними резервуарами здійснюється за допомогою системи керування, застосовуючи масу приймального резервуара для включення перемикача після досягнення згаданим резервуаром максимального об'єму заповнення. Інтегрована система (400) напівбезперервного концентрування/ виділення та очищення До складу пристрою В, 2 варіанти здійснення якого представлені на Фіг. 3, входить інтегрована система (400) напівбезперервного конвективного адсорбування/десорбування. Інтегрована система напівбезперервного конвективного адсорбування/десорбування конструюється і величина її параметрів задається таким чином, щоб швидкість потоку навантаження (Qload) цієї системи була значно вище за швидкість потоку продукту безперервного перфузійного ферментування і швидкість процесу безперервного фільтрування (Qh), тобто Qload>>Qh. До складу варіантів здійснення системи (400) напівбезперервного концентрування/виділення та очищення входить завантажувальний насос (401), багатошляховий клапанний блок (402) і декілька буферних резервуарів (404), триходовий клапан (403), сполучений зі стерильним резервуаром (413) для приймання відходів і одним або декількома конвективними 16 UA 107937 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 адсорберними модулями (406), вхідний і вихідний манометри або датчики (405, 408), додаткові контрольно-вимірювальні прилади, наприклад, УФ-датчик (409), датчики (409, 410) рН і електропровідності, витратомір (412), а також ще один триходовий клапан (407), також сполучений з резервуаром (413) для приймання відходів і вихідним отвором (414) елюату продукту. До складу варіантів здійснення пристрою за даним винаходом також входить програмовна система керування і реєстрування даних (не показана), яка реєструє вхідні сигнали даних від контрольно-вимірювальних приладів (наприклад, однак, без обмеження, тиск, УФ випромінення, рН, електропровідність, швидкість потоку, масу зрівняльного резервуара) і керує автоматизованими клапанами і насосом відповідно до запрограмованих методик. Завантажувальний насос (401), згідно з варіантом, якому віддається перевага, є перистальтичним насосом для уникнення безпосереднього контактування продукту або стерильних буферів з якими-небудь ущільнювачами або механічними частинами. Заявники встановили, що подібному варіанту віддається перевага для забезпечення надійної тривалої роботи в стерильних умовах. У принципі, однак, можуть застосовуватися стерильні насоси інших конструкцій. Величина параметрів завантажувального насоса підбирається в залежності від об'єму встановленої матриці конвективного адсорбера (406) для забезпечення надійного регулювання в межах як мінімум 12 об'ємів матриці/хв. Наприклад, в одному з представлених варіантів здійснення застосовуються мембранні адсорберні капсули Mustang (фірма Pall Corp.), об'єм матриці яких становить приблизно 0,3 л. Отже, величина параметрів завантажувального насоса задається таким чином, щоб забезпечити швидкість потоку навантаження до 3,6 л/хв. Функція багатошляхового клапанного блока (402) полягає в забезпеченні перемикання між навантаженням, яке містить продукт, що одержується із зрівняльного резервуара (201), і кожним зі стерильних буферів і освітлювальних розчинів із резервуарів (404), що містять стерильний буфер. У представлених варіантах здійснення пристрою В застосовується ряд автоматичних пружинних клапанів, які перетискають ззовні шланг, приєднаний до кожного резервуара з буфером для перекриття і відкриття кожної лінії. Заявники відкрили, що ці пружинні клапани забезпечують особливо вигідне рішення для пристрою В, оскільки вони дозволяють уникнути якого б то не було контакту з продуктом і, внаслідок цього, не потребують очищення або стерилізування. Можуть, однак, застосовуватися різноманітні комерційно доступні клапани, придатні для стерильної обробки і відомі фахівцям у даній галузі, наприклад, мембранні клапани. У представленому варіанті здійснення, триходові клапани (403, 407) являють собою придатні для автоклавування мембранні клапани. У принципі, однак, можуть застосовуватися різноманітні комерційно доступні клапани, придатні для стерильної обробки, в тому числі, наприклад, пружинні клапани. Конвективний адсорберний модуль (406) містить хроматографічну матрицю з переважно конвективним масопереносом продукту на адсорбційну поверхню і, протилежно до традиційного хроматографування, стерилізується перед роботою шляхом автоклавування, обробки гострою парою або опроміненням. Переважно конвективний масоперенос дозволяє, протилежно до традиційного хроматографування в ущільненому шарі, працювати з дуже короткими циклами адсорбування/елюювання/регенерування, що і застосовується заявниками в пристрої, запропонованому даним винаходом, для здійснення напівбезперервної роботи. Згідно з представленим варіантом здійснення пристрою за даним винаходом до складу конвективного адсорбера (406) входить одна або декілька комерційно доступних мембранних адсорбційних капсул з іонообмінною хімією (Mustang, Pall Соrporation або Sartobind, Sartorius). У згаданому пристрої, однак, може застосовуватися інший мембранний адсорбційний матеріал і інші конфігурації, а також нові конвективні матриці, наприклад, монолітні матриці, оскільки, протилежно до традиційного хроматографування, виключене набивання смолою і матриці, як правило, можуть герметизуватися у вигляді готових до застосування модулів. Більш того хімічні взаємодії інших видів, включаючи конвективні афінні матриці, до складу яких входять специфічні зв'язуючі продукт ліганди, також забезпечують унікально високу ефективність пристрою, запропонованого даним винаходом. Згідно з одним із варіантів здійснення пристрою за даним винаходом численні конвективні адсорбційні модулі застосовуються в пристрої у вигляді вузла, що включає декілька паралельно з'єднаних агрегатів із послідовно розташованих конвективних адсорберів, подібно системі (100) безперервного видалення частинок. Весь вузол із всіма агрегатами, що входять до його складу, з послідовно розташованих конвективних адсорберів стерилізується як єдине ціле, завдяки чому в процесі роботи забезпечується можливість перемикання з одного агрегату з послідовно розташованих адсорберів на інший у випадку, якщо у першого закінчився період нормальної 17 UA 107937 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 експлуатації, що визначається, наприклад, заздалегідь встановленими критеріями, наприклад, протитиском при завантаженні або максимальною кількістю виконаних робочих циклів. До складу кожного агрегату з послідовно розташованих адсорберів входить один або декілька паралельно і/або послідовно сполучених конвективних адсорбційних модулів для збільшення в'яжучої здатності і/або підвищення пропускної спроможності. Важливо підкреслити, що пристрій, запропонований даним винаходом, забезпечує не тільки безперервну, але і стерильну, в істинному значенні цього слова, роботу, в протилежність роботі лише в асептичних умовах. Заявникам вдалося добитися цього шляхом конструювання всіх елементів системи, що контактують із продуктом, таким чином, щоб вони витримували не тільки очищення, але також і стерилізування шляхом автоклавування, обробки гострою парою in situ або гамма-опроміненням. У представлених варіантах здійснення, одноразові герметизовані модулі застосовуються для безперервного видалення частинок (100), а також для напівбезперервного стерильного конвективного адсорбування/десорбування (400). Перистальтичні насоси застосовуються щоб уникнути будь-якого контактування продукту з обертовими елементами і механічними ущільнювачами. Більш того в представлених варіантах здійснення замість твердих труб застосовуються одноразові вузли, до складу яких входять гнучкі трубопроводи і м'які резервуари. Одноразові елементи, що контактують із продуктом (наприклад, шланги, м'які резервуари, модулі) або групи елементів заздалегідь збираються і стерилізуються як єдине ціле, спрощуючи, тим самим, запуск і експлуатацію. Системи сконструйовані таким чином (наприклад, витяжна шафа з ламінарним потоком), щоб ступінь будь-якого потенційного контакту стерильної системи з навколишнім середовищем, наприклад, для відбору проб, заміни м'яких резервуарів або контрольно-вимірювальних приладів, зводився до мінімального рівня. У представлених варіантах здійснення даного пристрою, розподільні магістралі сконструйовані з резервуванням для забезпечення перемикання з одного стерильного елемента (наприклад, м'якого резервуара для приймання продукту) на наступний без розкриття. Додаткова заміна шлангів, модулів або м'яких резервуарів, згідно з варіантом, якому віддається перевага, здійснюється за допомогою стерильних трубних зварювальних машин, а не стерильних з'єднувачів. Інші додаткові варіанти здійснення пристроїв, запропонованих даним винаходом, можуть також включати такі елементи, як резервуари з неіржавіючої сталі, корпуси фільтрів або шланги, які можуть стерилізуватися на місці, самостійно або в сполученні з одноразовими елементами доти, доки забезпечується надійність і стерильність довготривалої експлуатації. Додаткові варіанти здійснення пристрою В за даним винаходом призначені для обробки матеріалу, що надходить від численних ферментерів з на більш великих виробничих установках (В3). Приклад в схематичному зображенні представлений на Фіг. 6. Додаткові варіанти здійснення пристрою В за даним винаходом призначені для підвищення сумарного коефіцієнта концентрації і ефективності відділення за допомогою послідовного з'єднання численних систем (400) конвективного адсорбування/десорбування з відповідними стерильними зрівняльними резервуарами (200), що знаходяться між ними (дивися Фіг. 6, В4). Розробляються інші додаткові варіанти здійснення пристроїв, запропонованих даним винаходом, для підвищення сумарного коефіцієнта концентрації і ефективності відділення за допомогою послідовного з'єднання системи (300) безперервного ультрафільтрування із системою (400) напівбезперервного конвективного адсорбування/десорбування через додатковий зрівняльний резервуар. Схематичне зображення прикладу варіанта здійснення представлене на Фіг. 7. Опис способу застосування пристрою В Безперервний процес перфузійного ферментування здійснюють протягом тривалого періоду часу (одна кампанія), тривалість якого, як правило, становить від 2 тижнів до 6 місяців або більш. Тканинну культуральну рідину (TCF), що містить продукт, клітини і дебрис клітин, безперервно обробляють за допомогою пристрою В. Одержують потік стерильного, вільного від частинок, концентрованого і частково очищеного продукту ("виділений продукт"), який безперервно виходить із згаданого пристрою через його вихідний отвір (414). За допомогою насоса (101) системи (100) безперервного стерильного видалення частинок, продукт ферментування безперервно прокачується через фільтрувальний вузол (103) з необхідною швидкістю Qh потоку продукту безперервного перфузійного ферментування. Вихідний потік системи безперервного фільтрування, тобто просвітлена тканинна культуральна рідина (cTCF), безперервно надходить в зрівняльний резервуар (201). Як тільки зрівняльний резервуар виявляється наповненим до заздалегідь визначеного рівня, сигнал маси або рівня автоматично запускає цикл адсорбування/десорбування інтегрованої системи стерильного напівбезперервного концентрування/виділення та очищення. Матеріал, 18 UA 107937 C2 5 10 15 20 25 30 35 зібраний в зрівняльному резервуарі, швидко завантажується в адсорбційну установку, тобто протягом 4 год., згідно з варіантом, якому віддається перевага, протягом 2 год. і згідно з варіантом, якому віддається ще більша перевага, протягом 1 год. або менш, з випорожненням, тим самим, зрівняльного резервуара. У представлених варіантах здійснення, приведених на Фіг. 3, збирання вільної від частинок просвітленої тканинної культуральної рідини (cTCF) продовжується весь час, в один і той самий зрівняльний резервуар невеликого розміру. Об'єм в зрівняльному резервуарі невеликого розміру, таким чином, коливається між мінімальною і максимальною величиною. У іншому варіанті здійснення, опис якого був приведений вище, збір по черзі перемикається між 2 ідентичними зрівняльними резервуарами. У той час як cTCF продовжує збиратися в зрівняльному резервуарі, на завантаженому адсорбері здійснюється ряд стадій заздалегідь визначеної методики хроматографування, призначених для десорбування цільового продукту в концентрованій, очищеній формі і підготовки адсорбера до подальшого циклу навантаження. Повний цикл, таким чином, включає навантаження, промивання, елюювання, регенерування і повторне зрівноваження, причому кожна зі згаданих операцій здійснюється з одним або декількома придатними буферами. Оскільки швидкість потоку в процесі здійснення згаданих стадій може бути високою внаслідок природи конвективних адсорберів, загальна тривалість циклу утримується на низькому рівні, тобто становить менше за 6 год., згідно з варіантом, якому віддається перевага, менше за 3 год. і згідно з варіантом, якому віддається ще більша перевага, менше за 1,5 год. Таким чином, інтегрована система сконструйована таким чином, що адсорберна установка готова до наступного циклу навантаження до того, як зрівняльний резервуар знову виявляється наповненим, що забезпечує можливість напівбезперервної роботи. У приведеній нижче Таблиці 2 показаний приклад способу застосування представленого варіанта здійснення пристрою В за даним винаходом для виділення рекомбінантного людського фактора VIII системи згортання крові (представлені дані великомасштабного виробництва). Згаданий спосіб виявився виключно вигідним. Вихід і продуктивність кожного циклу адсорбування/десорбування були подібні відповідним показникам періодичного процесу, причому сумарний вихід продукту зріс більш ніж на 10 % внаслідок нетривалого часу перебування продукту в установці і, тим самим, зведення до мінімуму його розпаду. Той самий спосіб виявився вельми корисним для виділення генноінженерних варіантів FVIII, в тому числі FVIII із делецією В-домена, який істотно відрізняється від непроцесованого FVIII за розміром і іншим характеристиками. Сподіваються, що цей спосіб виявиться також придатним для одержання інших білків і біомолекул. Сама по собі методика хроматографування (хімія і послідовність застосування буферів, об'єми навантаження і швидкість потоків) може бути розроблена в експериментах по періодичному хроматографуванню для кожної окремої молекули і в подальшому легко пристосовуватися для застосування з варіантами здійснення пристрою, запропонованого даним винаходом. 40 Таблиця 2 Приклад способу застосування представленого варіанта здійснення пристрою В для безперервного виділення FVIII і варіантів FVIII при безперервному перфузійному ферментуванні Параметр Швидкість Qh потоку продукту безперервного процесу перфузійного ферментування [л/день] Зрівняльний резервуар: максимальний робочий об'єм Vs [л] Об'єм навантаження [об'єми матриці] Об'єм адсорбційної матриці, встановленої в пристрої В [мл] Швидкість потоку навантаження [об'єми матриці/хв] Об'єм навантаження [л] Час навантаження [хв] Сумарний час хроматографування [год.] (методика, що включає навантаження, промивання, елюювання і декілька стадій регенерування/повторного урівноваження) Час простою адсорбера/циклу [год.] Циклів/період часу тривалістю 24 год. Час збору [год.] Приблизний середній час перебування матеріалу в пристрої (час збору + час навантаження + час елюювання) 19 Мета 2000 200 600 260 12 156 50 1,5 0,372 12,8 1,872 2,7 UA 107937 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Для кожної окремої молекули продукту критерії довговічності можуть визначатися для конвективної адсорбційної установки, наприклад, на основі тиску в процесі навантаження або виділення. Як правило, визначається і оцінюється максимальна кількість циклів nmax. Після того як адсорбційна установка була застосована при напівбезперервній роботі протягом n max циклів, її замінюють іншою ідентичною адсорбційною установкою без порушення цілісності і стерильності системи. У представлених варіантах здійснення це здійснюється аналогічно з установкою безперервного стерильного фільтрування за допомогою застосування або розподільних магістралей і стерильних з'єднувачів, або за допомогою застосування одноразових шлангів і стерильних трубних зварювальних машин. У разі застосування варіанта здійснення пристрою за даним винаходом показаного на Фіг. 3 з правого боку, стерильний потік буфера, розчину для регулювання рН, стабілізувального розчину або води для ін'єкцій додається постійно або періодично зі стерильного резервуара (204) за допомогою насоса (203) для додаткового введення буфера. Таким чином, стан cTCF може вільно регулюватися, наприклад, із точки зору іонної сили, рН, додання стабілізаторів тощо. Пристрої, запропоновані даним винаходом, і відповідні способи застосування згаданих пристроїв вирішують проблеми традиційних процесів виділення, описані вище (дивися загальні передумови створення винаходу). У всіх варіантах здійснення пристроїв А і В та відповідних способах застосування згаданих пристроїв час перебування продукту в потенційно шкідливому середовищі мінімізовано, що істотно підвищує вихід і якість нестійких по своїй суті складних біологічних продуктів. Продуктивність установки може бути збільшена, а вартість продукту знижена. Більш того пристрої і відповідні способи ліквідують необхідність в холодильних ємностях або охолоджуваних резервуарах значних розмірів для проміжного зберігання великих об'ємів продукту, що знижує витрати на капітальні вкладення в установку і дозволяє повністю реалізувати переваги перфузійного ферментування, що полягають в компактності і мобільності. Варіанти здійснення пристроїв, запропонованих даним винаходом, і відповідні способи знижують витрати на робочу силу в порівнянні з традиційною трудомісткою періодичною обробкою, завдяки високому ступеню автоматизації. Нові пристрої надають можливість безперервної роботи 24 год. на добу, протягом тривалих періодів часу, з досягненням максимальної продуктивності і коефіцієнта використання обладнання. Крім того, пристрої, запропоновані даним винаходом, ліквідують матеріально-технічні труднощі на установках, що включають один або декілька ферментерів. Варіанти здійснення можуть обробляти матеріал, що одержується за допомогою одного або декількох процесів перфузійного ферментування. Важливо зазначити, що оскільки нові пристрої і способи дають можливість здійснення роботи в повністю стерильних умовах, ліквідуються проблеми, пов'язані з мікробним забрудненням і ендотоксинами, чого не можна було досягнути шляхом асептичної обробки з подальшим простим стерильним фільтруванням. У доповнення до цього, пристрої, запропоновані даним винаходом, дозволяють уникнути або мінімізувати потребу в оцінці ступеня очищення завдяки застосуванню одноразових деталей. Завдяки унікальним характеристикам пристроїв і способів, запропонованих даним винаходом, кожний одноразовий модуль, а також шланги, м'які резервуари і вузли, можуть застосовуватися протягом тривалого періоду часу (протягом всієї кампанії), що різко знижує витрати і істотно підвищує привабливість утилізації одноразових деталей з економічної точки зору. Представлені варіанти здійснення пристроїв А і В, запропоновані даним винаходом, і відповідні способи виявилися вельми придатними для виробництва рекомбінантного фактора VIII системи згортання крові, а також генноінженерних варіантів FVIII, включаючи, але без обмеження, FVIII з делецією В-домена. Передбачається, однак, що цей винахід виявиться однаково придатним для одержання інших білків і біологічних молекул, зокрема, складних і по своїй суті нестійких білків, наприклад, фактора VII, фактора IX, фактора X тощо. Переваги пристрою А і відповідного способу. На Фіг. 8 показаний приклад несподіваного збільшення пропускної спроможності фільтра, яке було виявлене заявниками для інтегрованої системи (100) безперервного видалення частинок. На Фіг. 10 показаний типовий розподіл часу перебування матеріалу в установці і середній час перебування продукту в системі (300) безперервного ультрафільтрування варіанта здійснення пристрою А за даним винаходом, визначений за допомогою адсорбування УФ 20 UA 107937 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 випромінення осадом при 280 нм з модельним білком у типових умовах. Як показано, середній час перебування продукту в системі становить приблизно всього 40 хв. Таким чином, сумарний час перебування продукту в представленому варіанті здійснення пристрою А, від трубопроводу для відведення із ферментера продукту до кінцевого концентрованого осаду (ізоляту), становить 1-2 год. або менш. Це менше 1/10 часу перебування матеріалу (28 год. або більш) в традиційному періодичному процесі виділення, в якому продукт (клітини, що виросли в культурі) збирають протягом як мінімум 24 год. (до декількох днів), після чого продукт обробляють, як правило, протягом щонайменше 4-10 год. На Фіг. 11 показане порівняння одержаного сумарного виходу рекомбінантного фактора системи згортання крові (rFVIII) у разі безперервного перфузійного ферментування без плазмового білка як у разі традиційного процесу періодичного виділення (періодичне фільтрування плюс періодичне ультрафільтрування), так і у разі застосування пристрою А за даним винаходом і відповідного способу. Як показано на згаданій фігурі, безперервний процес за даним винаходом забезпечує значно більш високий вихід продукту, наслідком чого може бути збільшення виробничих потужностей і зниження витрат виробництва. У разі застосування пристрою А згідно зі способом, запропонованим даним винаходом, трансмембранний тиск інтегрованого безперервного ультрафільтрування згодом зростає, в той 2 час як питомий потік на мембрані (в л/год./м /бар) знижується при постійній об'ємній пропускній спроможності. Це характерно для всіх ультрафільтрувальних процесів і зумовлено такими ефектами, як концентраційна поляризація, утворення шару гелю і забруднення. Однак, протилежно до періодичного ультрафільтрування, як видно з прикладу, приведеного на Фіг. 12, зміни тиску і питомого потоку у разі пристрою А відбуваються надто повільно, забезпечуючи можливість безперервної роботи протягом тижнів, перш ніж виникне необхідність очищення або заміни мембран. У доповнення до цього ступінь зміни і ефективність роботи абсолютно нечутливі до вироблюваного продукту або лінії клітин, використовуваної при безперервному перфузійному ферментуванні (Фіг. 12). Таким чином, пристрій А, запропонований даним винаходом, і відповідний спосіб також ідеально підходять як загальна основа для швидкого виробництва різних білків, оскільки вони надійно і передбачувано працюють із різними цільовими білками від різних ліній клітин. Несподівано заявники встановили, що негативні ефекти утворення шару гелю і забруднення у разі пристрою А зводяться фактично до такого низького рівня, що може бути оброблений набагато більший об'єм на площу встановленого ультрафільтра, перш ніж виникне необхідність в очищенні або заміні фільтрів. Фіг. 13 демонструє надійну довгострокову працездатність пристрою А, запропонованого даним винаходом. Приблизно через 25 днів трансмембранний тиск несподівано виявив тенденцію до стабілізації в квазістаціонарному стані, що дозволяло передбачити ще більш високу довгострокову працездатність. На 27 день швидкість потоку осаду була цілеспрямовано подвоєна для перевірки ефекту більш високої пропускної спроможності. Через 34 дні зробили коротке промивання за допомогою стерильного 0,5 М розчину NaOH не розкриваючи системи, тим самим підтримуючи цілісність і стерильність всієї системи загалом. Після цього трансмембранний тиск знову стабілізувався або щонайменше збільшувалося, однак із надзвичайно низькою швидкістю. Після 70 днів безперервної стерильної роботи швидкість рециркуляційного потоку була цілеспрямовано знижена наполовину для перевірки впливу на працездатність системи. Як і очікувалося, трансмембранний тиск почав збільшуватися з дещо більшою швидкістю внаслідок зниженого масопереносу, що, таким чином, підвищило пристінкову концентрацію на поверхні мембрани. 2 Однак перш ніж система була відключена, вона успішно і надійно відпрацювала 95 днів. На 1 м площі мембрани загалом припадало біля 4500 оброблених літрів із мінімальними витратами ручної праці (лише щоденний відбір проб). Для порівняння, оптимізований традиційний процес періодичного ультрафільтрування при такому самому варіанті застосування має в 45 разів 2 менше допустиме навантаження (приблизне 100 л/м ) і вимагає як мінімум повного часу роботи 1-2 операторів. Здивування викликає також і те, що вибірковість пристрою А за даним винаходом зокрема його інтегрованої системи (300) безперервного ультрафільтрування, виявилася значно вище за вибірковість традиційного періодичного процесу. Фахівцям в даній галузі добре відомо, що в процесі традиційного періодичного ультрафільтрування із затриманих макромолекул на початковій стадії процесу утворюється вторинна мембрана (шар гелю), яка зменшує смугу пропускання середньої молекулярної маси. У результаті затримується як цільова молекула, так і забруднюючі білки меншого розміру, що робить практично неможливим значне одночасне очищення. Таким чином, у разі традиційного періодичного ультрафільтрування рідко виявляється можливим розділення білків, що мають коефіцієнт відмінності з точки зору їх 21 UA 107937 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 молекулярної маси менший за 10. Однак, як показано на Фіг. 14, у разі інтегрованого процесу безперервного ультрафільтрування за даним винаходом можна відрегулювати умови для ефективного розділення IL-2SA (приблизно 16 кДа) і зеленого флуоресцентного білка GFP (2730 кДа). Ось ця ефективність розділення, більш висока, ніж очікувалося, і дає можливість для здійснення одночасного концентрування і очищення. Переваги пристрою В і відповідного способу Фіг. 15 ілюструє робочі характеристики пристрою В, запропонованого даним винаходом. Застосовуючи комерційний конвективний адсорбер (Mustang Q, Pall Corporation, 15-шаровий модуль), здійснили біля 100 послідовних циклів адсорбування/десорбування, концентруючи і очищаючи рекомбінантний варіант FVIII з культури, одержаної за допомогою процесу безперервного перфузійного ферментування. Середній одержаний вихід становив приблизно 95 % (розкид є наслідком аналітичних відмінностей), в той час як тиск залишався відносно постійним протягом всієї кількості здійснених циклів. Таким чином, може бути точно вказано, що до заміни адсорберної установки може бути здійснено щонайменше 100 послідовних циклів. Як було показано в докладному описі способу застосування пристрою В за даним винаходом сумарний середній час перебування продукту в представленому варіанті здійснення становить менше за 3 год., перш ніж він виявляється елюйованим в концентрованій, очищеній і стабілізованій формі у відповідному буфері. Це значно менше часу перебування в традиційному періодичному процесі виділення (більш за 24 год.), здійснюваному один раз на день, наслідком чого є значно більш високий вихід лабильних по своїй суті білкових продуктів. У представленому варіанті здійснення, опис якого приведений вище, протягом дня здійснюється приблизно 13 циклів, що в контексті Фіг. 15 означає, що адсорберний вузол напівбезперервної дії буде потребувати заміни лише кожного 7-8 дня, що здійснюється без порушення стерильності і безперервності роботи. На Фіг. 16 показаний приклад УФ-профілю і профілю електропровідності протягом одного типового циклу адсорбування/десорбування і регенерування пристрою В. Видно, що може завантажуватися більш за 450 об'ємів адсорбера (CVs), в той час як продукт елююється у вигляді дуже гострого піку. Вміст забруднювачів в потоку істотно знижується протягом стадії навантаження, а також протягом промивання і очищення (фаза регенерування). Фіг. 17 ілюструє ефективність очищення процесу за даним винаходом, який включає напівбезперервне конвективне адсорбування/десорбування. Як приклад показаний електрофорез у поліакриламідному гелі в присутності додецилсульфату натрію ізоляту варіанта FVIII. Як видно, фракції елюату, що включають 95 % завантаженого варіанта FVIII (що визначається окремим аналізом активності), містять значно менше білка, ніж навантаження, і є, таким чином, очищеними. У елюаті (ізоляті) не спостерігається додаткових смуг розкладання, що вказує на прекрасну якість продукту. Підводячи підсумок, пристрій В, запропонований даним винаходом, може забезпечувати подібну ж ефективність очищення, що і порівнянні періодичні процеси, одночасно із цим зводячи до мінімального рівня втрати виходу нестійких по своїй суті білкових продуктів, а також проблеми з якістю продукту внаслідок зведення часу перебування продукту в установці до мінімального рівня. Одночасно із цим різко знижуються витрати на робочу силу внаслідок високого ступеня автоматизації, властивого процесу, запропонованому даним винаходом, що вимагає мінімального втручання оператора. Незважаючи на те, що цей винахід був описаний з деякими подробицями як ілюстрація і приклад із метою розуміння, фахівцям у цій галузі буде очевидна можливість практичного внесення певних змін і модифікацій. Отже, опис і приклади не повинні розглядатися, як такі, що обмежують обсяг винаходу, який визначається прикладеною формулою винаходу. Відповідно, зрозуміло і те, що варіанти здійснення цього винаходу, що наведені в описі і пропонують вдосконалений спосіб фільтрування для одержання високого виходу молекули, що становить інтерес, із даного потоку живильних речовин, виконують виключно ілюстративну роль застосування принципів цього винаходу. З приведеного опису буде очевидна можливість внесення змін у форму, способи застосування і варіанти використання розкритих елементів винаходу без відступу від суті винаходу або обсягу прикладеної формули винаходу. 55 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 60 1. Процес виділення білка, що становить інтерес, із гетерогенної тканинної культуральної рідкої суміші та його очищення, який включає: (a) одержання за допомогою безперервного процесу перфузійного ферментування гетерогенної тканинної культуральної рідкої суміші, яка містить білок, що становить інтерес; 22 UA 107937 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 (b) переміщення згаданої тканинної культуральної рідкої суміші в обладнання для виконання безперервного процесу видалення частинок, інтегрованого з безперервним процесом перфузійного ферментування; (c) видалення великодисперсних забруднювачів із згаданої гетерогенної тканинної культуральної рідкої суміші в ході безперервного процесу видалення частинок з одержанням просвітленої тканинної культуральної рідини, яка містить білок, що становить інтерес; (d) переміщення згаданої просвітленої тканинної культуральної рідини в обладнання для виконання безперервного процесу виділення та очищення, інтегрованого з безперервним процесом видалення частинок, причому цей безперервний процес виділення та очищення являє собою ультрафільтрування; і (е) виділення білка, що становить інтерес, із просвітленої тканинної культуральної рідини та його очищення в ході безперервного процесу виділення та очищення, при цьому просвітлену тканинну культуральну суміш фільтрують з питомою швидкістю потоку, що забезпечує пристінкову концентрацію, яка перевищує концентрацію осаду на мембрані менш ніж на 20 %; причому питому швидкість потоку згаданої суміші в ході безперервного процесу перфузійного ферментування, безперервного процесу видалення частинок і безперервного процесу виділення та очищення підтримують на по суті постійному рівні. 2. Процес за п. 1, який додатково включає фільтрування просвітленої тканинної культуральної суміші з питомою швидкістю потоку, що забезпечує пристінкову концентрацію, що перевищує концентрацію осаду на мембрані менш ніж на 15 %. 3. Процес за п. 1, який додатково включає фільтрування просвітленої тканинної культуральної суміші з питомою швидкістю потоку, що забезпечує пристінкову концентрацію, що перевищує концентрацію осаду на мембрані менш ніж на 10 %. 4. Процес за п. 1, який додатково включає фільтрування згаданої просвітленої тканинної культуральної рідини через ультрафільтраційну мембрану, що має площу в квадратних метрах, що дорівнює приблизно 0,1-2 об'ємним витратам продукту, що одержується за допомогою процесу перфузійного ферментування, в літрах на годину. 5. Процес за п. 1, який додатково включає фільтрування згаданої просвітленої тканинної культуральної рідини через ультрафільтраційну мембрану, що має площу в квадратних метрах, що дорівнює приблизно 0,3-1 об'ємній витраті продукту, що одержується за допомогою процесу перфузійного ферментування, в літрах на годину. 6. Процес за п. 1, який відрізняється тим, що трансмембранний тиск в процесі безперервного ультрафільтрування з плином часу зростає. 7. Процес за п. 1, який відрізняється тим, що швидкості потоку фільтрату (Qp) і безперервного потоку виділеного продукту (Qi) протягом безперервного процесу виділення та очищення регулюють, так щоб вони по суті відповідали швидкості Qh потоку продукту ферментування протягом безперервного перфузійного ферментування, так щоб: Qp+Qi=Qh, де Qр підтримують по суті постійною. 8. Процес за п. 7, який відрізняється тим, що швидкості потоків Qh та Qi регулюють і контролюють, так щоб досягався необхідний коефіцієнт концентрації cf із задоволенням умови: Qi=l/cf·Qh. 9. Процес за п. 1, який відрізняється тим, що білок, що становить інтерес, вибраний з групи, яка включає рекомбінантний фактор VIII системи згортання крові, генноінженерні варіанти FVIII, які включають FVIII з делецією В-домена, фактор Vll, фактор IX та фактор X. 23 UA 107937 C2 24 UA 107937 C2 25 UA 107937 C2 26 UA 107937 C2 27 UA 107937 C2 28