Спосіб десіалування біологічних молекул з використанням каталітично активних антитіл

Спосіб десіалування біологічних молекул, який включає інкубацію біологічних молекул з десіалуючим агентом, який відрізняється тим, що як десіалуючий агент використовують каталітично активні антитіла з сіалідазною (нейрамінідазною) активністю. UA (11) 96404 (21) u201010900 (22) 10.09.2010 (24) 25.10.2011 (46) 25.10.2011, Бюл.№ 20, 2011 р. (72) БІЛИЙ РОСТИСЛАВ ОЛЕКСАНДРОВИЧ, СТОЙКА РОСТИСЛАВ СТЕПАНОВИЧ, КІТ ЮРІЙ ЯРОСЛАВОВИЧ (73) ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ КЛІТИНИ НАН УКРАЇНИ (56) Varki and Varki, Diversity in cell surface sialic acid presentations: implications for biology and disease. Lab Invest, 2007. 87.851-7. Meesmann, Fehr, Kierschke, Herrmann, Bilyy, Heyder, Blank, Krienke, Lorenz and Schiller, Decrease of sialic acid residues as an eat-me signal on the surface of apoptotic lymphocytes. J Cell Sci, 2010. 123 (abstract). Anthony R.M.et al. A RECOMBINANT IgG Fc THAT RECAPITULATES THE ANTIINFLAMMATORY ACTIVITY OF IVIG. Science, 2008, V.320, P.373376. Warren, The Thiobarbituric Acid Assay of Sialic Acids. Journal of Biological Chemistry, 1959. 234.19711975. US 6387674 B1, 14.05.2002. ЕР 0870014 B1, 21.02.2007. Magorivska, Bilyy, Havrylyuk, Chop'yak, Stoika and Kit, Anti-histone H1 IgGs from blood serum of C2 2 (19) 1 3 лінів IgG (1-2 молекули сіалових кислот на молекулу IgG) визначає їх прозапальні чи протизапальні властивості [Anthony, Nimmerjahn, Ashline, Reinhold, Paulson and Ravetch, Recapitulation of IVIG anti-inflammatory activity with a recombinant IgG Fc. Science, 2008. 320.373-6]. Таким чином, впливаючи на рівень десіалування біологічних молекул, можливо впливати на їх функції, та функції клітин, до складу яких вони входять, наприклад, індукувати фагоцитоз клітин, модулювати про- чи протизапальні властивості антитіл, тощо. Найбільш поширеним на сьогодні способом відщеплення сіалової кислоти (десіалування) від вуглеводних залишків біологічних молекул є нагрівання піддослідних зразків (клітин, препаратів білків до або після їх розділення) в присутності сильних кислот, наприклад 0,1н H2SO4 при температурі 80 °С [Warren, The Thiobarbituric Acid Assay of Sialic Acids. Journal of Biological Chemistry, 1959. 234.1971-1975]. Суттєвим недоліком даного підходу є необхідність використання низьких значень рН, за яких окрім гідролізу сіалових кислот може відбуватися незворотня денатурація макромолекул, що призводе до втрати їх біологічної активності. Відомий спосіб використання каталітично активних антитіл для розщеплення білкових субстратів [Патент США 6387674, від 14.05.2002, МПК C12N9/00; А61К38/00; C12N9/00, Catalytic monoclonal antibodies with protease activity for selective lysis of protein component of plaques aggregates pathological conditions] чи інших біологічних молекул [Патент ЄС ЕР0870014, Від 21.02.2007, МПК C12N 9/00, C12N 9/88, С12Р 7/26, Aldolase Catalytic Antibody]. Суть даних винаходів полягає в інкубації заданого субстрату з попередньо отриманими каталітичними антитілами (абзимами), здатними розщеплювати даний субстрат. При цьому згадані абзими або виділяються з природних джерел [Magorivska, Bilyy, Havrylyuk, Chop'yak, Stoika and Kit, Anti-histone H1 IgGs from blood serum of systemic lupus erythematosus patients are capable of hydrolyzing histone H1 and myelin basic protein. Journal of Molecular Recognition, 2010. 23.495-502], або їх утворення індукується штучно [Smirnov, Vorobiev, Friboulet, Avalle, Thomas, Knorre, Gabibov and Ponomarenko, The antiidiotypic approach to obtaining a proteolytic antibody. Dokl Biochem Biophys, 2008, 420, P.1057]. На відміну від протеолітично активних антитіл (протабзимів), на даний час невідомі абзими здатні здійснювати реакцію відщеплення сіалових кислот - десіалування. Найбільш близьким за технічною суттю до запропонованого є спосіб десіалування клітинних об'єктів із використанням нейрамінідаз (сіалідаз) гідролітичних ферментів, здатних каталітично відщеплювати сіалову кислоту [Baenziger and Fiete, Structure of the complex oligosaccharides of fetuin. Journal of Biological Chemistry, 1979. 254.789-795]. Суть методу полягає в інкубації сіаловмісних молекул (у складі інтактних клітин чи окремих попередньо розділених білків, глікосфінголіпідів, тощо) із бактерійними чи вірусними нейрамінідазами. Недоліком даного способу є те, що як десіалуючий 96404 4 агент використовуються нейрамінідази бактерій чи вірусів, оскільки евкаріотичні нейрамінідази наразі не є доступні в комерційних масштабах, а використання бактерійних/вірусних нейрамінідаз в системах in vivo у ссавців ускладнене через високу імуногенність (токсичність) вірусних і бактерійних нейрамінідаз для ссавців, що потребує додаткових етапів очистки продуктів реакції. В основу винаходу поставлено задачу розробити спосіб десіалування біомолекул з використанням каталітично-активних антитіл (абзимів), імуносумісних із організмом людини. Поставлена задача вирішується так, що у способі десіалування біологічних молекул, який включає інкубацію молекул з десіалуючим агентом, згідно з винаходом, як десіалуючий чинник використовують каталітично активні антитіла з сіалідазною (нейрамінідазною) активністю. Спосіб десіалування біологічних молекул з використанням каталітично активних антитіл полягає в наступному. Авторами вперше для десіалування біологічних молекул запропоновано використовувати каталітично-активні антитіла (абзими) із сіалідазною активністю. Виділення фракції каталітично активних антитіл класу IgG (абзимів) здійснювали наступним чином. Із сироваток хворих на множинну мієлому виділяли фракцію тотальних імуноглобулінів, які осаджувалися розчином сульфату амонію, 50 % від насиченості, за стандартними методиками, як описано [Friemel, Immunologische Arbeitsmethoden. 1991. 570]. Проводили скринінг нейрамінідазної активності у фракцій імуноглобулінів, для цього з кожної фракції відбирали 50 мкг білка, розчиняли в 0,2М ацетатному буфері, рН 4,2, що містив 5мМ СаСl2 та МgСl2, до зразку додавали 4-MUNA (4метилумбеліферил--D-N-ацетилнейрамінової кислоти, 4-methylumbelliferyl--D-Nacetylneuraminic acid, BioSynth, Швейцарія), у кінцевій концентрації 25 мкМ, та інкубували 3 год. Розчеплення 4-MUNA сіалідазами веде до утворення флуоресцентного продукту реакції 4метилумбеліферону. Стандарт 4метилумбеліферону (Сігма, США) використовували для калібрування. Реакцію зупиняли 5-ти кратним об'ємом гліцин-карбонатного буферу, рН 10,7 та визначали флуоресценцію за допомогою флуорометра Turner Quantech FM109510 (США) при довжині хвилі збудження 325 нм та емісії 450 нм. Із проб, що містили високу сіалідазну активність (>75 mU/мг білка) виділяли фракцію IgG за допомогою афінної хроматографії на протеїн-G-сефарозі за стандартними методиками [Friemel, Immunologische Arbeitsmethoden. 1991. 570]. В отриманій фракції визначали сіалідізну активність IgG як описано вище. Отриманий абзим із сіалідазною активністю використовували для: 1. Десіалування еритроцитів людини. Еритроцити людини, 2%, суспензію інкубували з 0.1 мг/мл абзиму упродовж 3-х годин. Спостерігали десіалування еритроцитів, яке визначали за зростанням аглютинації пектином PNA, специфічним до десіалових поверхневих гліканів. 2. Десіалування сіалованих імуноглобулінів. Сіаловані імуноглобуліни IgG інкубували з отрима 5 ними абзимами з сіалідазною активністю упродовж 3-х годин. Спостерігали десіалування IgG, яке визначали імуноферментним аналізом за зв'язуванням лектину SNA-біотин, при інкубуванні з авідинпероксидазою. 3. Десіалування гангліозидів. Суміш фракцій гангліозидів, виділених з мозку миші, інкубували отриманими абзимами з сіалідазною активністю упродовж 3-х годин. Спостерігали десіалування гангліозиду GD3 з перетворенням у гангліозид GM3. Запропонований метод відрізняється від раніше описаних тим, що в ньому як десіалуючий агент використовують абзими з сіалідазною активністю. Використання як десіалуючого агента абзимів з сіалідазною активністю робить можливим їх застосування в системах in vivo, оскільки проти гомологічних (того ж виду) антитіл не виникає імунна реакція. На Фіг. 1. зображено: Аглютинацію еритроцитів людини лектином PNA під впливом 1) IgG із крові хворого на множинну мієлому, що мають сіалідазну активність, 2) IgG із крові клінічно здорового донора, що не мають сіалідазної активності, 3) забуференого фізіологічного розчину (ЗФР, негативний контроль), 4) нейрамінідази Clostridium perfringens, 10 mU (позитивний контроль). Пектин PNA аглютинує десіаловані еритроцити (дифузна маса), за відсутності аглютинації еритроцити осідають на дно лунки (центральна червона точка), ступінь десіалування можна оцінити за концентрацією лектину, що спричиняє аглютинацію. На Фіг. 2. зображено: Рівень сіалілування імуноглобулінів IgG у 1) фракції сіалованих імуноглобулінів (після збагачення на афінній колонці з лектином SNA), 2) фракції каталітично активних антитіл з сіалідазною активності, 3) імуноглобулінів після змішування фракцій 1 + 2 (сіалованих імуноглобулінів та каталітично активних антитіл з сіалідазною активністю), 4) фракції несіалованих імуноглобулінів (незв'язана фракція після збагачення на афінній колонці з лектином SNA). Взаємодія сіалованих імуноглобулінів із абзимами, що мають сіалідазну активність, веде до зменшення рівня сіалільних залишків. На Фіг. 3. зображено: Тонкошарова хроматограма суміші гангліозидів виділених з мозку миші, розділених в системі (хлороформ:метанол:вода 60:35:8) як описано [Прохорова М. И., Методы биохимических исследований (липидный и энергетический обмен). 1982.]. 1) гангліозиди, 2) гангліозиди після інкубації з 2 мкг абзиму з сіалідазною активністю (18 год при 37°С), 3) гангліозиди після інкубації з нейрамінідазою з С perfringens, 5 mU. В фракціях 2) і 3) спостерігають зникнення сіалованого гангліозиду GD3 та появу його десіалованої форми GM3 та сіалової кислоти. Гангліозиди ідентифікували за значеннями Rf. Можливість реалізації способу показано на наступних прикладах. Приклад 1. Десіалування еритроцитів людини. Свіжо виділені еритроцити людини групи А(0) тричі відмивають ЗФР, готують 2 % суспензію еритроцитів. В лунку U- подібного імунологічного планшету вносять 20 мкл розчину лектину PNA, здатного 96404 6 аглютинувати десіаловані еритроцити [Nakano, Fontes Piazza and Avila-Campos, A rapid assay of the sialidase activity in species of the Bacteroides fragilis group by using peanut lectin hemagglutination. Anaerobe, 2006. 12.238-41] (в першу лунку ряду вносять лектин в концентрації 1000 мкг/мл, в кожну наступну - у вдвічі меншій концентрації), в лунки одного ряду вносять 20 мкл абзиму з сіалідазною активністю в концентрації 1 мг/мл (виділеним як описано вище, який має наступні параметрами кінетичної реакції, визначеної за розщепленням 4MUNA за стандартними методиками: Km = 59,8 -1 мкМ, Kcat = 23,14 хв ), в лунки іншого ряду вносять 20 мкл імуноглобуліну IgG, що не має сіалідазної активності в концентрації 1 мг/мл, в лунки іншого ряду вносять 20 мкл ЗФР, в лунки іншого ряду вносять 10 мU нейрамінідази С. perfringens. В усі лунки вносять 20 мкл 2 % суспензії еритроцитів, планшет інкубують упродовж 3-х годин при 37 °С. За дії абзиму з сіалідазою активністю та нейрамінідази С. perfringens спостерігають десіалування еритроцитів (Фіг. 1), яке виявляють за утворенням дифузної зони аглютинації, неаглютиновані еритроцити осідають на дно в центрі лунки, ступінь десіалування можна оцінити за концентрацією лектину, що спричиняє аглютинацію. Приклад 2. Десіалілування імуноглобулінів IgG людини. Використовують сіаловані та несіаловані імуноглобуліни G, виділені як описано [Kaneko, Nimmerjahn and Ravetch, Anti-inflammatory activity of immunoglobulin G resulting from Fc sialylation. Science, 2006. 313.670-3]. На лунки імунологічного планшету наносять у 0,1 карбонатному буфері: 1) фракції сіалованих імуноглобулінів (100 мкг/лунку), 2) фракції каталітично активних антитіл з сіалідазною активності (100 мкг/лунку), 3) попередньо інкубовану протягом ночі суміш імуноглобулінів після змішування фракцій 1 (100 мкг/лунку) та фракції 2 (100 мкг/лунку), (суміш сіалованих імуноглобулінів та абзимів з сіалідазною активністю), 4) фракції несіалованих імуноглобулінів (100 мкг/лунку). Планшет інкубують 12 годин при 4 °С, після чого тричі промивають ЗФР, в кожну лунку вносять 5 мкг сіалоспецифічного лектину SNA, міченого біотином, інкубують 2 год. при 37 °С, тричі відмивають ЗФР, в кожну лунку вносять 1 мкг авідинпероксидази, інкубують 1 год. при 37 °С, тричі відмивають ЗФР. Пероксидазу детектують додаючи 0,1 % розчин ABTS (2,2'-азіно-біс(3-етилбензотіазолін-6-сульфонової кислоти) діамонієвої солі) та 0,03 % Н2О2 та вимірючи оптичну густину при 405 нм за допомогою фотометричного аналізатора мікропланшетів (ВіоТек, США). Нормалізацію сигналу здійснюють використовуючи рівень сигналу лектину SNA, доданого в пусту лунку. Взаємодія сіалованих імуноглобулінів із абзимами, що мають сіалідазну активність (Фіг. 2) веде до зменшення рівня сіалільних залишків (фракція 3). Приклад 3. Десіалування гангліозидів. Гангліозиди, виділені з мозку миші як описано [Прохорова М. И., Методы биохимических исследований (липидный и энергетический обмен). 1982.], в кількості 5 мкг інкубують з 2 мкг абзиму з сіалідазною активністю (18 год. при 37 °С) або з 5 mU нейрамінідази з С. perfringens, (18 год. при 37 °С). Гангліозиди, 7 гангліозиди, інкубовані з абзимом, та гангліозиди, інкубовані з нейрамінідазою, наносять на пластинку для тонкошарової хроматографії (ALUGRAM® SIL G, Roth, Німеччина) та проводять хроматографічне розділення в системі (хлороформ:метанол:вода 60:35:8), гангліозиди виявляють в парах резорцину та ідентифікують за значеннями Rf як описано [Прохорова М. И., Мето 96404 8 ды биохимических исследований (липидный и энергетический обмен). 1982.]. В фракціях гангліозидів, інкубованих з абзимами, що мають сіалідазну активність, та інкубованих з нейрамінідазою, спостерігають зникнення дисіалованого гангліозиду GD3 та появу моносіалованого гангліозиду GM3 і сіалової кислоти (Фіг. 3). 9 Комп’ютерна верстка Д. Шеверун 96404 Підписне 10 Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601