Вакцина проти інфекційного бронхіту, одержана з ib-qx-подібних штамів

Реферат: Винахід належить до вірусів інфекційного бронхіту (IB), одержаних з генотипу IB-вірусу, відомого як IB-QX, або з вірусів, що генетично пов'язані із IB-QX, що у цій заявці мають назву IB-QX-подібних вірусів. IB-віруси можуть бути живими та атенуйованими або інактивованими. Живі атенуйовані IB-віруси за даним винаходом одержують послідовним пасажуванням IB-QXподібного вірусу і використовують для одержання вакцин від IB-QX та IB-QX-подібних вірусів. UA 103330 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ПРЕХРЕСНЕ ПОСИЛАННЯ НА РОДИННУ ЗАЯВКУ У цій заявці заявлено пріоритет згідно 35 U.S.C. 119(e) попередньої заявки США № 61/087,228, поданої 8 серпня 2008 р., повний опис якої включено до цієї заявки шляхом посилання. ГАЛУЗЬ ВИНАХОДУ Даний винахід стосується галузі вакцин від інфекційних захворювань птахів. Більш конкретно, даний винахід стосується нових вакцин від вірусу інфекційного бронхіту (IB). ПЕРЕДУМОВИ СТВОРЕННЯ ВИНАХОДУ Вірус інфекційного бронхіту (IB) є коронавірусом, що спричиняє респіраторні захворювання у домашніх птахів (наприклад, курчат). Симптоми IB захворювання включають, наприклад, респіраторний дистрес, знижену масу, зменшене яйцевідкладання, підвищену частоту патологічних яєць та підвищену смертність. Було ідентифіковано декілька різних генотипів та серотипів IB вірусів. Генотипування ІВ вірусів загалом проводять шляхом секвенування усього або частини гену, що кодує S1 (рибосомний) білок вірусу. S1 білок являє собою продукт N-кінцевого розщеплення більшого S глікопротеїна, кодованого геномним ІВ вірусом. Продукт C-кінцевого розщеплення S глікопротеїну має назву S2 білок. S1 білок відповідає за приєднання клітин та є основною антигенною детермінантою для IB вірусів. Ілюстративні генотипи (або "штами") ІВ вірусу включають 793B, Масачусетс, Італія-02, D274, Арканзас, B1648 та D1466. (Див., наприклад, Worthington та інші (June 2008), Avian Pathology 37:247-257). Новий генотип вірусу IB, позначений "QX" (що також має назву "QXIBV"), був вперше ідентифікований у Китаї наприкінці 1990-х років. (Див. Liu та інші (2006), Archives of Virology 151:1133-1148). Після ідентифікації оригінального QX генотипу, по всьому світові були ідентифіковані генотипи IB вірусу з високим ступенем подібності/ідентичності до QX на рівні S1 нуклеотидної послідовності. Такі "IB-QX-подібні" віруси (як далі визначено у цій заявці) були ідентифіковані, наприклад, у Франції, Німеччині, Нідерландах, Бельгії, Сполученому Королівстві, Італії та Польщі. Очевидно, IB-QX-подібні віруси являють серйозну загрозу для індустрії птахівництва. Не зважаючи на швидко зростаючу значущість ІВ вірусу цього типу, до цього часу, жодна вакцина, специфічна до IB-QX-подібних вірусів, не була доступна чи описана у рівні техніки. Було знайдено, що комерційно доступні IB вакцини (живі, атенуйовані штами) є неефективними для захисту курчат від IB-QX-подібних вірусів. Таким чином, існує потреба у цій галузі у нових композиціях вакцин та у способах вакцинації, що забезпечують специфічний захист від IB-QX та IB-QX-подібних вірусів. СТИСЛИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Даний винахід задовольняє вищезазначену потребу у цій галузі шляхом забезпечення IB вірусів, що є корисними, між іншим, як антигенні компоненти у композиціях вакцин, які захищають від інфікування IB-QX та IB-QX-подібними вірусами. Даний винахід включає живі, атенуйовані версії IB-QX-подібних вірусів. Такі живі, атенуйовані штами можуть бути одержані, наприклад, шляхом послідовного пасажування IB-QX-подібних вірусів до одержання адекватної атенуації. Даний винахід також включає інактивовані версії IB-QX-подібних вірусів. IB-QX-подібні віруси для застосування у контексті даного винаходу можуть бути одержані, наприклад, від депонованих штамів IB-QX-подібних вірусів, польових випадків інфекції IB-QX-подібних вірусів, або шляхом конструювання рекомбінантних IB вірусів, що експресують певні, попередньо визначені генні сегменти, такі, як конкретна S1 генна послідовність. Даний винахід також забезпечує композиції вакцин, що містять живі, атенуйовані або вбиті штами IB-QX-подібних вірусів, а також способи одержання живих, атенуйованих та/або вбитих штамів IB-QX-подібних вірусів. Даний винахід також забезпечує способи вакцинації птаха від інфекційного бронхіту шляхом введення птахові композиції вакцини, що містить живі, атенуйовані або вбиті штами IB-QX-подібних вірусів. Інші аспекти даного винаходу будуть очевидними з детального опису даного винаходу та Прикладів, наведених у цій заявці нижче. СТИСЛИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ Креслення відсутні. ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС Даний винахід забезпечує ізольовані IB віруси, одержані з IB-QX-подібних вірусів. Як вживають у цій заявці, термін "IB-QX-подібний вірус" означає будь-який вірус з S1 білком, кодованим нуклеотидною послідовністю, яка щонайменше на 95% ідентична нуклеотидній послідовності, що кодує S1 білок оригінального IB-QX штаму. Нуклеотидна послідовність, що кодує S1 білок оригінального IB-QX штаму, представлена SEQ ID NO:1 (Див. Таблицю 1) та доступна під номером доступу NCBI Genbank AF193423. 1 UA 103330 C2 Таблиця 1 Нуклеотидна послідовність S1 гену штаму IB-QX atgttggggaagtcactgtttttagtgaccattttgtgtgcactatgtagtgcaaatttgttcgattctgctaataat tatgtgtactactaccaaagtgcctttaggcctccaaatggatggcatttgcaagggggtgcttatgcagtagt gaattccactaattatagtaataatgcaggttctgcacctcagtgcactgttggtgttattaaggacgtctataat caaagtgcggcttctatagctatgacagcacctcttcagggtatggcttggtctaagtcacaattttgtagtgca cactgtaacttttctgaaattacagtttttgtcacacattgttatagtagtggtagcgggtcttgtcctataacaggc atgattccacgtgatcatattcgtatttctgcaatgaaaaatggttctttattttataatttaacagttagcgtatctaa ataccctaattttaaatcttttcaatgtgttaacaacttcacatctgtttatttaaatggtgatcttgtttttacttccaac aaaactactgatgttacgtcagcaggtgtgtattttaaagcaggtggacctgtaaattataatattatgaaagaa tttaaggttcttgcttactttgttaatggtacagcacaagatgtaattttgtgcgataattcccccaagggtttgcta gcctgtcaatataacactggcaatttttcagatggcttttatccttttactaatagtactttagttagggaaaagttca ttgtctatcgcgaaagtagtgttaatactactctggcgttaactaatttcacttttactaatgtaagtaatgcacagcc taatagtggtggtgttaatacttttcatttatatcaaacacaaacagctcagagtggttattataattttaatttgtcattt ctgagtcagtttgtgtataaggcaagtgattttatgtatgggtcttaccaccctagttgttcttttagaccagaaacca ttaatagtggtttgtggtttaattccttgtcagtttctcttacttatggacccctacagggagggtgtaagcaatctgtttt tagtggtaaggcaacgtgttgttatgcctactcttataatggcccaagggcatgtaaaggtgtttattcaggtgaatt aagcatgaattttgaatgtggattgctggtttatgttactaagagtcatggctctcgtatacagactagaacggagc ccttagtattaacgcaacacaattataataatattactttagataagtgtgttgcttataatatatatggcagagtagg ccaaggttttattactaatgtgactgattctgctgctaattttagttatttagcagatggtgggttagctattttagatacg tcgggtgccatagatgtttttgttgtaaagggcagctatggtcttaattattacaaggttaatccttgtgaagatgttaa ccaacagtttgtagtgtctggtggcaatatagttggcattcttacttctagaaatgaaacaggttctgaacaggttga gaaccagttttatgttaagttaaccaatagctcacatcgtcgcaggcgttctattggccaaaacgtaacaacttgc ccttatgtta (SEQ ID NO:1) 5 10 Таким чином, будь-який вірус з S1 білком, кодованим нуклеотидною послідовністю, яка на щонайменше 95% ідентична SEQ ID NO:1, є "IB-QX-подібним" вірусом для цілей даного винаходу. Приклади IB-QX-подібних вірусів наведені у Worthington та інші (червень 2008 р.), Avian Pathology 37:247-257, включаючи IB вірусні генотипи, позначені L-1148 (також наведені у Worthington та інші як "NL/L-1148/04"), 1449-2 (також наведені у Worthington та інші як "NL/L1449K/04"), 1449-10 (також наведені у Worthington та інші як "NL/L-1449T/04"), та Roberton (також наведені у Worthington та інші як FR/L-1450T/05). Ілюстративні IB-QX-подібні віруси, з яких можуть бути одержані ІВ віруси за даним винаходом, вказані у Таблиці 2, нижче. Для цілей даного винаходу, термін IB-QX-подібний вірус включає, між іншим, оригінальний QX IB вірус. Таблиця 2 Ілюстративні IB-QX-подібні віруси Позначення вірусу NL/L-1148/04 (L-1148) NL/L-1449K/04 (1449-2) NL/L-1449T/04 (1449-10) FR/L-1450L/05 (Roberton) FR/L-1450T/05 K10217-03 IS/1201 K1255-03 K3-3 CK/CH/LSD/031 CK/CH/LLN/981 QX LS2 A2 HBN NMC Номер доступу в Genbank NCBI (ген S1) DQ431199 EF079115 EF079116 EF079117 EF079118 AY790363 DQ400359 AY790364 AY790367 DQ167148 DQ167145 AF193423 AY278246 AY043312 DQ070837 DQ973113 2 UA 103330 C2 Таблиця 2 Ілюстративні IB-QX-подібні віруси Позначення вірусу IBVQ SH CK/CH/LXJ/021 LX4 CK/CH/LSHH/031 CK/CH/LJL/041 CK/CH/LHLJ/04XI CK/CH/LSHH/03II CK/CH/LHLJ/04V CK/CH/LHLJ/991 DB03 LH2 CK/CH/LHLJ/07V CK/CH/LHLJ/07I HH06 WF 5 10 15 20 25 30 Номер доступу в Genbank NCBI (ген S1) DQ480155 DQ480156 DQ167152 AY189157 DQ 167149 DQ 167144 DQ 167140 DQ 167150 DQ 167139 DQ167142 AB274271 AY180958 EU563943 EU563942 EF577030 DQ480151 Додатково до порівнянь послідовностей у S1 кодуючій послідовності, можуть бути застосовані інші способи для ідентифікації IB-QX-подібних вірусів. Такі способи можуть бути застосовані, наприклад, як попередні скринінги для ідентифікації кандидатних IB-QX-подібних вірусів з великого пулу вірусних проб. Якщо тести на віруси позитивні для IB-QX-подібних вірусів за одним з таких попередніх скринінгів, генотип такого вірусу може бути потім підтверджений S1 нуклеотидним генним секвенуванням та порівнянням, як описано у цій заявці у будь-якому місці. Ілюстративний "попередній" спосіб ідентифікації IB-QX-подібних вірусів (або передбачуваних IB-QX-подібних вірусів) являє собою нейтралізацію сироватки, де анти сироватку, взяту від тварини, інфікованої IB-QX або IB-QX-подібним вірусом, аналізують на предмет здатності нейтралізовувати кандидатний вірус. Позитивні результати нейтралізації можуть передбачати, що кандидатний вірус є IB-QX-подібним вірусом. Іншій ілюстративний, попередній спосіб скринінгу на IB-QX-подібні віруси, являє собою поліморфізм довжини фрагментів рестрикції (RFLP). У цій заявці, ДНК копія гену S1 від кандидатного вірусу одержана за допомогою ПЛР зворотної транскрипції. ДНК копію потім піддають дії рестриктази, що, як відомо, вирізає ген S1 IB-QX-подібного вірусу у положеннях, що не вирізані у S1 гені не-IB-QX-подібного вірусу (чи навпаки). Відмінності у рестриктазній дигестії можуть бути візуалізовані шляхом сортування за розміром одержаної в результаті дигестованої ДНК, наприклад, за допомогою гель-електрофорезу. Ізольовані IB віруси за даним винаходом можуть бути одержані з IB-QX-подібних вірусів, описаних у цій заявці, а також з будь-яких інших IB-QX-подібних вірусів, що можуть бути ізольовані з поля. Додаткові IB-QX-подібні віруси можуть бути одержані способами, відомими фахівцю у цій галузі. Наприклад, IB-QX-подібні віруси можуть бути одержані шляхом скринінгу проб (наприклад, ротоглоткових мазків), взятих від курчат, в яких підозрюють, або які інфіковані IB вірусом, або які іншим чином проявляють один чи більше симптомів інфекційного бронхіту. РНК ізолюють з таких проб та ДНК копію гену S1 або її частину генерують шляхом полімеразної ланцюгової реакції зворотної транскрипції (ПЛР зворотної транскрипції). S1 ДНК копію потім секвенують, та одержану таким чином нуклеотидну послідовність порівнюють з нуклеотидною послідовністю гену S1 IB QX (SEQ ID NO:1) та визначають відсоток ідентичності між двома послідовностями. У деяких ілюстративних втіленнях, даний винахід включає ізольовані IB віруси, одержані з IB-QX-подібного вірусу, що містить S1 білок з аналогічною амінокислотною послідовністю, що й S1 білок IB-QX-подібних вірусів L-1148 (SEQ ID NO:2), 1449-2 (SEQ ID NO:3), або 1449-10 (SEQ ID NO:4). Амінокислотні послідовності S1 протеїнів показані у Таблиці 3: 35 3 UA 103330 C2 Таблиця 3 Амінокислотні послідовності S1 білків ілюстративних IB-QX-подібних вірусів IB-QXподібний штам Амінокислотна послідовність гену S1 МЛVKSLFLVTILCALCSANLFDSDNNYVYYYQSAFRPPNGWHLQGGAYAVVNSTN YTNNAGSAHECTVGVIKDVYNQSVASIAMTAPLQGMAWSKSQFCSAHCNFSEITV FVTHCYSSGSGSCPITGMIPRDHIRISAMKNGSLFYNLTVSVSKYPNFKSFQCVNN FTSVYLNGDLVFTSNKTTDVTSAGVYFKAGGPVNYSIMKEFKVLAYFVNGTAQDVV LCDNSPKGLLACQYNTGNFSDGFYPFTNSTLVREKFIVYRESSVNTTLALTNFTFTN L-1148 VSNAQPNSGGVNTFHLYQTQTAQSGYYNFNLSFLSQFVYKASDFMYGSYHPSCSF RPETINSGLWFNSLSVSLTYGPLQGGCKQSVFSGKATCCYAYSYKGPMACKGVYS GELSTNFECGLLVYVTKSDGSRIQTRTEPLVLTQYNYNNITLDKCVAYNIYGRVGQG FITNVTDSAANFSYLADGGLAILDTSGAIDVFVVQGIYGLNYYKVNPCEDVNQQFVV SGGNIVGILTSRNETGSEQVENQFYVKLTNSSHRRRRSIGQNVTSCPYVSYGRFCI EPDGSLKMIVPEELKQFVAPLLNITESVLIPNSFNLTVPPRN (SEQ ID NO:2) МЛVKSLFLVTILCALCSANLFDSDNNYVYYYQSAFRPPNGWHLQGGAYAVVNSTN YTNNAGSAHGCTVGVIKDVYNQSVASIAMTAPLQGMAWSKSQFCSAHCNFSEITV FVTHCYSSGSGSCPITGMIPRDHIRISAMKNGSLFYNLTVSVSKYPNFKSFQCVNNF TSVYLNGDLVFTSNKTTDVTSAGVYFKAGGPVNYSIMKEFKVLAYFVNGTAQDVILC DNSPKGLLACQYNTGNFSDGFYPFTNSTLVREKFIVYRESSVNTTLALTNFTFTNVS 1449-2 NAQPNSGGVNTFHLYQTQTAQSGYYNFNLSFLSQFVYKASDFMYGSYHPSCSFRP ETINSGLWFNSLSVSLTYGPLQGGCKQSVFSGKATCCYAYSYKGPMACKGVYSGE LSTNFECGLLVYVTKSDGSRIQTRTEPLVLTQYNYNNITLDKCVAYNIYGRVGQGFIT NVTDSAANFSYLADGGLAILDTSGAIDVFVVQGIYGLNYYKVNPCEDVNQQFVVSGG NIVGILTSRNETGSEQVENQFYVKLTNSSHRRRRSIGQNVTSCPYVSYGRFCIEPDG SLKM (SEQ ID NO:3) МЛVKSLFLVTILCALCSANLFDSDNNYVYYYQSAFRPPNGWHLQGGAYAVVNSTN YTNNAGSAHECTVGVIKDVYNQSVASIAMTAPLQGMAWSKSQFCSAHCNFSEITV FVTHCYSGGSGSCPITGMIPRDHIRISAMKNGSLFYNLTVSVSKYPNFKSFQCVNN FTSVYLNGDLVFTSNKTTDVTSAGVYFKAGGPVNYSIMKEFKVLAYFVNGTAQDVI LCDNSPKGLLACQYNTGNFSDGFYPFTNSTLVREKFIVYRESSVNTTLALTNFTFT 1449-10 NVSNAQPNSGGVNTFHLYQTQTAQSGYYNFNLSFLSQFVYKASDFMYGSYHPSC SFRPETINSGLWFNSLSVSLTYGPLQGGCKQSVFSGKATCCYAYSYKGPMACKG VYSGELSTNFECGLLVYVTKSDGSRIQTRTEPLVLTQYNYNNITLDKCVAYNIYGR VGQGFITNVTDSAANFSYLADGGLAILDTSGAIDVFVVQGIYGLNYYKVNPCEDVN QQFVVSGGNIVGILTSRNETGSEQVENQFYVKLTNSSHRRRRSIGQNVTSCPYV SYGRFCIEPDGSLKMIVPEELKQFVAPLLN (SEQ ID NO:4) 5 10 15 20 Ізольовані IB віруси за даним винаходом можуть бути також одержані фахівцями у цій галузі за допомогою рекомбінантних, або "зворотногенетичних" способів. Наприклад, Casais та інші (2003) J. Virol. 77:9084-9089, описують конструкцію рекомбінантного IB вірусу, що експресує гетерологічний рибосомний ген. (Див. також Hodgson та інші (2004) J. Virol. 78:13804-13811). Ця система задіє застосування IB вірусного інфекційного клону, тобто, повнорозмірної IB вірусної кДНК, клонованої у такий вектор, як, наприклад, вірусний вектор коров’ячої віспи. (Див., наприклад, Casais та інші (2001) J. Virol. 75:12359-12369). Починаючи з IB вірусного інфекційного клону, можуть бути сконструйовані рекомбінантні ІB віруси, що експресують S1 білок будь-якого іншого IB вірусу. Таким чином, з використанням системи згідно Casais та інші або її варіації, можуть бути з легкістю одержані рекомбінантні IB віруси, що експресують S1 білок з будь-якого IB-QX-подібного вірусу (тобто, S1 білок, кодований полінуклеотидною послідовністю, яка на щонайменше 95% ідентична SEQ ID NO:1), таким чином, одержуючи рекомбінантні IB-QX-подібні віруси. Рекомбінантні IB-QX-подібні віруси, одержані таким чином, можуть бути застосовані у контексті даного винаходу аналогічно IB-QX-подібним вірусам, що зустрічаються у природі (наприклад, польові ізоляти), як детально описано у цій заявці. Як вживають у цій заявці, "відсоток ідентичності" означає відсоток нуклеотидів по відношенню до нуклеотидної послідовності, ідентичній нуклеотидам у послідовності, що розглядається (або її вказаній частині) після вирівнювання послідовностей та введення гепів, за 4 UA 103330 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 необхідністю, для досягнення максимального відсотку ідентичності послідовності, як згенеровано програмою WU-BLAST-2.0a19 (Altschul та інші (1997) J. Mol. Biol. 215:403-410; у цій заявці має назву "BLAST") з усіма пошуковими параметрами, встановленими за замовчуванням. Значення відсотку ідентичності нуклеотидної послідовності визначають за допомогою ряду ідентичних нуклеотидів, що співпадають, поділених на довжину послідовностей, для яких повідомлено відсоток ідентичності. Хоча IB-QX-подібні віруси відомі з рівня техніки, IB віруси, одержані з IB-QX-подібних вірусів, не були описані або запропоновані у рівні техніки та є, таким чином, об’єктом даного винаходу . Як вживають у цій заявці, термін "одержані з," по відношенню до IB вірусу, означає, що IB вірус є: (1) послідовно пасажованим нащадком IB-QX-подібного вірусу; або (2) IB-QX-подібного вірусу, що був підданий дії умов, що інактивують вірус або надають йому меншу вірулентність. Вірус, "одержаний з" IB-QX-подібного вірусу, може тому бути живим/атенуйованим чи інактивованим/вбитим. Як відмічено вище, IB вірус, одержаний з IB-QX-подібного вірусу, у деяких втіленнях, є нащадком, що був послідовно пасажованим, IB-QX-подібного вірусу. "Нащадок, що був послідовно пасажованим, IB-QX-подібного вірусу" визначають у цій заявці як вірус, який одержують після IB-QX-подібного вірусу, розмножують у середовищі, що сприяє вірусній реплікації, видаляють з такого середовища, а потім розмножують щонайменше один додатковий раз у такому самому або подібному середовищі. Кожен з циклів розмноження та видалення розглядають як одинарний "пасаж." Пасажований нащадок IB-QX-подібного вірусу є переважно атенуйованим, та атенуація є результатом послідовного пасажування. Ілюстративний спосіб послідовного пасажування IB вірусів (включаючи IB-QX-подібні віруси) включає застосування яєць запліднених домашніх птахів (наприклад, курячих яєць) як середовища, що сприяє вірусній реплікації. Наприклад, запліднені курячі яйця інокулюють з кількістю IB-QX-подібного вірусу через алантоїсну порожнину. Інокульовані яйця інкубують при, наприклад, 37C протягом 24 годин (або за інших придатних умов, часів та температур інкубації). Алантоїсну рідину збирають з яєць. На цій стадії, вірус пасажують "1X." Зібрану алантоїсну рідину від першого пасажу, відповідне розведення, потім інокулюють в нові запліднені яйця, які інкубують при, наприклад, 37C протягом 24 годин, та алантоїсну рідину збирають з такого другого набору яєць. На цій стадії, вірус був пасажований "2X." Безперервне пасажування, таким чином, може бути продовжено невизначений період часу. Альтернативні середовища, що сприяють вірусній реплікації, що можуть бути застосовані для пасажування IB вірусів, включають, наприклад, клітинні культури, такі, як культури курячих нирок або культури курячих зародкових фібробластів. Хоча інкубацію при 37C протягом 24 годин вказано у цій заявці як ілюстративну стадію інкубації для пасажування IB вірусів, фахівець у цій галузі зрозуміє, що можуть бути застосовані інші температури та/або часи інкубації. Наприклад, запліднені яйця можуть бути інкубовані при температурах в діапазоні від 20C до 42C. Час інкубації для пасажування вірусів може знаходитися у діапазоні від 4 годин до 4 днів, та більш переважно від 16 до 36 годин. го го Проби вірусу можуть бути проаналізовані після кожного пасажу (або після кожного 2 , 4 , го го 5 , 10 , та інш. пасажів) на ступінь вірулентності. Ступінь вірулентності може бути визначена шляхом, наприклад, введення пасажованого вірусу курчатам та оцінки різних параметрів, що вказують на інфекційний бронхіт. Ілюстративні параметри включають: (i) циліарну активність трахеальних експлантатів; (ii) клінічні ознаки, такі, як, наприклад, водні ексудати з ока або носа, термінальне дихання, або діарею; (iii) загальне паталогічне обстеження, наприклад, верхніх дихальних шляхів, нирок, селезінки та/або кишечника; та (iv) гістологію трахеї, легенів та нирок. Ілюстративні вимірювання кожного з цих параметрів наведені у Прикладі 2, нижче. Вірус IB, одержаний з IB-QX-подібного вірусу шляхом послідовного пасажування, вважають "атенуйованим", якщо один чи більше параметрів вказують на те, що інфекційний бронхіт зменшено, знищено чи покращено відносно відповідних параметрів, що спостерігаються у курчат, інфікованих батьківським (не-пасажованим) IB-QX-подібним вірусом. Порівняння може бути також зроблено із курчатами, інфікованими іншими відомими вірулентними штамами ІВ вірусу. Необмежуючий, ілюстративний спосіб оцінювання вірулентності послідовно пасажованого IB вірусу, одержаного з IB-QX-подібного вірусу, проілюстровано у Прикладі 2. Стисло, курчат, яких інокулювали послідовно пасажованим IB вірусом, одержаним з IB-QX-подібного вірусу, піддавали послідовному бальному оцінюванню, що відображало (i) циліарну активність трахеальних експлантатів, (ii) клінічні ознаки, та (iii) патологічне дослідження. Визначали загальну кількість балів [(i) + (ii) + (iii)]. Класифікацію вірулентності визначали таким чином: - "Не вірулентний," якщо загальна сума балів менша чи дорівнює загальній сумі балів для 5 UA 103330 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 неінфікованої контрольної групи; - "Помірний," якщо загальна сума балів перевищує загальну суму балів для неінфікованої контрольної групи, але менша або дорівнює загальній сумі балів для групи, яку інфікували відомим помірним штамом ІВ вірусу (наприклад, POULVAC IB H120 (штам Масачусетс), Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, IA). - "Помірно вірулентний," якщо загальна сума балів перевищує загальну суму балів для групи, яку інфікували відомим помірним штамом ІВ вірусу, але менша чи дорівнює загальній сумі балів для групи, яку інфікували відомим вірулентним штамом ІВ вірусу (наприклад, батьківським IB-QX-подібним штамом або іншим відомим вірулентним штамом, наприклад, штамом IB-M41). - "Вірулентний," якщо загальна сума балів дорівнює або перевищує загальну суму балів для групи, яку інфікували відомим вірулентним штамом ІВ вірусу. IB вірус, класифікований як "невірулентний" або "помірний" відповідно до вказаної вище класифікаційної схеми, є придатними як живий атенуйований вакцинний штам. За певних обставин, "помірний вірулентний" IB вірус може також бути корисним як живий атенуйований штам. Альтернативні способи оцінювання придатності послідовно пасажованих IB-QX-подібного вірусу як вакцинного штаму відомі з рівня техніки та проілюстровані у цій заявці, наприклад, у Прикладі 3. Як показано у Прикладі 3, бали джгутиків та морфологію нирок та трахеї застосовували для визначення ступеню атенуації після множинних пасажувань. Ці параметри можуть, у свою чергу, бути застосовані для визначення того, чи є даний штам придатним (наприклад, достатньо безпечним) для створення вакцини. Як відмічено вище, інша категорія ІВ вірусу, що "одержаний з" IB-QX-подібного вірусу, є IBQX-подібним вірусом, що був підданий умовам, які інактивують вірус або надають йому меншу вірулентність. На відміну до послідовно пасажованих IB вірусів, які є типово живими та атенуйованими, IB віруси у другій категорії типово розглядають як інактивовані або вбиті. Способи інактивації вірусів, включаючи IB віруси, відомі з рівня техніки. Таким чином, як ілюструє наведене вище обговорення, IB вірус за даним винаходом, одержаний з IB-QX-подібного вірусу, може бути інактивований чи атенуйований. У разі інактивації, ІВ віруси за даним винаходом можуть бути інактивовані шляхом контактування вірусів з інактивуючою сполукою, такою, як, наприклад, β-пропіолактон або формалін. При атенуації, ІВ віруси за даним винаходом можуть бути атенуйовані шляхом послідовного пасажування, починаючи з початкового пасажування IB-QX-подібного вірусу. ІВ віруси можуть бути пасажовані у будь-якому середовищі, що сприяє вірусній реплікації. Такі середовища включають, наприклад, запліднені яйця домашніх птахів. Запліднені яйця домашніх птахів включають, наприклад, запліднені курячі яйця, наприклад, вільні від специфічної патогенної мікрофлори (SPF) курячі яйця. Інші придатні середовища включають, наприклад, клітинні культури. Для атенуювання IB вірусів за даним винаходом, віруси можуть бути пасажовані будь-яку кількість разів. У деяких втіленнях, віруси пасажують щонайменше достатню кількість разів таким чином, що одержані у результаті віруси характеризують як "не вірулентні," "помірні," або (за певних обставин) "помірно вірулентні," за допомогою класифікаційної методології, що наведена у цій заявці. У деяких ілюстративних втіленнях, ІВ віруси за даним винаходом пасажують від 5 до 400 разів. Наприклад, ІВ віруси можуть бути пасажовані 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400 разів, чи більше за необхідністю чи за бажанням. ІВ віруси за даним винаходом є переважно ізольованими. Як вживають у цій заявці, термін "ізольований" означає, що віруси не містяться у тканинах живої тварини. Даний винахід включає декілька не обмежуючих робочих прикладів ізольованих вірусів інфекційного бронхіту, одержаних з IB-QX-подібних вірусів. Наприклад, IB-QX-подібного вірусу L-1148 пасажують 64 разів на 10-11 день запліднення вільних від специфічної патогенної го мікрофлори (SPF) курячих яєць. Для 65 пасажу, SPF яйця інокулюють з 0,2 мл 1000-кратного розведення алантоїсної рідини від рівня пасажу 64. Через 24 години інкубації при 37C, ий алантоїсну рідину збирають у пули. 65 пасажований матеріал у цій заявці має назву L1148(p65) (див. Приклад 3). Стерильні пули L-1148(p65) відбирають, змішують у пул, змішують зі стабілізатором, заповнюють ними віали на 3 мл (1 мл на віалу) та ліофілізують з одержанням основного висіяного вірусу IB QX L1148 MSV65. Проводять додаткові 15 пасажів, загалом 80 6 UA 103330 C2 им 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 пасажів, з одержанням L-1148(p80) (див. Приклад 3). Як із 65 пасажованим матеріалом, го алантоїсну рідину з 80 пасажу збирають у пул. Стерильні пули відбирають, змішують у пул, змішують зі стабілізатором, заповнюють ними віали на 3 мл (1 мл на віалу) та ліофілізують з одержанням основного висіяного вірусу IB QX L1148A MSV80. Кожен з IB QX L1148 MSV65 та IB QX L1148A MSV80 додатково пасажують ще п’ять разів з одержанням IB QX L1148A MSV65 X+5 та IB QX L1148A MSV80 X+5, відповідно. IB QX L1148 MSV65 був депонований у Європейській колекції клітинних культур, Porton Down, UK (ECACC) 10 червня 2009 р., від імені Fort Dodge Animal Health, та йому був призначений попередній номер доступу 09061002. IB QX L1148A MSV80 був депонований у Європейській колекції клітинних культур, Porton Down, UK (ECACC) 10 червня 2009 р., від імені Fort Dodge Animal Health, та йому був призначений попередній номер доступу 09061004. IB QX L1148A MSV65 x+5 був депонований у Європейській колекції клітинних культур, Porton Down, UK (ECACC) 10 червня 2009 р., від імені Fort Dodge Animal Health, та йому був призначений попередній номер доступу 09061003. IB QX L1148A MSV80 x+5 був депонований у Європейській колекції клітинних культур, Porton Down, UK (ECACC) 10 червня 2009 р., від імені Fort Dodge Animal Health, та йому був призначений попередній номер доступу 09061001. Додаткові необмежуючі приклади IB вірусів, одержаних з IB-QX-подібних вірусів, описані у цій заявці. Даний винахід включає композиції вакцин, що містять: (i) ізольований IB вірус, одержаний з IB-QX-подібного вірусу; та (ii) фармацевтично прийнятний носій. Фармацевтично прийнятний носій може бути, наприклад, водою, стабілізатором, консервантом, культуральним середовищем або буфером, або будь-якою комбінацією вказаних вище речовин. Композиції вакцин за даним винаходом можуть бути одержані у вигляді суспензії або ліофілізованої форми, або, альтернативно, у замороженій формі. При заморожуванні, гліцерин чи інші подібні агенти можуть бути додані для підвищення стабільності при заморожуванні. Композиція вакцини за даним винаходом може містить ад’ювант, зокрема, якщо IB вірус, що міститься у композиції, інактивований (тобто, вбитий). Ад’ювантом може бути акриловий полімер, диметил діоктадецил амоній бромид (DDA), або комбінація акрилового полімеру та DDA. Акриловий полімер, як вживають у цій заявці, являє собою будь-який полімер або співполімер, що містить акриловий фрагмент. Ілюстративні акрилові полімери включають, наприклад, поліакрилову кислоту, метакрилову кислоту, метакрилат, акриламід, акрилат, акрилонітрил, та алкілові естери поліакрилової кислоти. Приклади акрилових кополімерів включають, наприклад, полі(співполімер акриламіду з бутилом, метакрилатом), акриловуметакрилову кислоту, акрилоакриламід та полі (метакрилат). Приклади комерційно доступних акрилових полімерів включають карбопол (B. F. Goodrich Co., Cleveland, Ohio), карбосет (B. F. Goodrich Co., Cleveland, Ohio), неокрил (Avecia, Inc., Wilmington, Del.), та ойдрагит (Rohm Tech, Inc., Malden, Mass.). Особливо переважним акриловим полімером для застосування в емульсіях за даним винаходом є карбопол, що також має назву водорозчинного полімеру акрилової кислоти, перехресно зшитим з поліалілсахарозою. Ад’ювант може бути розчинним у воді або диспергуватися у воді. Ад’ювант може бути емульсією на основі олії, наприклад, емульсією типу «вода в олії», «олія у воді» або «вода в олії у воді». Емульсія типу «вода в олії» може додатково містити одну або більше поверхнево активних речовин, що розчиняються в олії, одну або більше поверхнево активних речовин, що розчиняються у воді, додаткові ад’юванти, додаткові компоненти водної фази, стабілізатори емульсій, або їх комбінації. Композиція вакцини за даним винаходом може містити, додатково до IB вірусу, одержаного з IB-QX-подібного вірусу, інші антигенні компоненти. Інші антигенні компоненти, включені у композиції вакцин, можуть бути одержані з інфекційних агентів, наприклад, інфекційних агентів курчат. Наприклад, композиції вакцин за даним винаходом можуть додатково містити щонайменше один додатковий живий атенуйований IB вірус, одержаний з не-IB-QX-подібного вірусу. Як вживають у цій заявці, "не-IB-QX-подібний вірус" означає будь-який IB вірус з S1 білком, кодованим нуклеотидною послідовністю, яка менш ніж на 95% ідентична нуклеотидній послідовності, що кодує S1 білок оригінального IB-QX штаму. Нуклеотидна послідовність, що кодує S1 білок оригінального IB-QX штаму, представлена SEQ ID NO:1 та доступна під номером доступу NCBI Genbank AF193423. Таким чином, будь-який вірус з S1 білком, кодованим нуклеотидною послідовністю, яка менш ніж на 95% ідентична SEQ ID NO:1, є "не-IB-QXподібним" вірусом для цілей даного винаходу. Ілюстративні не-IB-QX-подібні віруси включають такі штами, як Масачусетс, Арканзас, Джорджія-98, Італія-02, 793-B, D274, D1466, або такими, що мають S1 генотип будь-якого зі вказаних вище не-IB-QX-подібних вірусів. Композиції вакцин 7 UA 103330 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 за даним винаходом можуть містити одну або більше комерційно доступних IB вакцинних штамів додатково до IB вірусу, одержаного з IB-QX-подібного вірусу. У деяких втіленнях за даним винаходом, композиція вакцини може містити додатковий антигенний компонент, одержаний з інфекційного компонента, який не є IB вірусом. Наприклад, композиція вакцин за даним винаходом може додатково містити живий атенуйований або інактивований вірус птахів, такий, як вірус хвороби Ньюкасла, вірус хвороби Марека, вірус інфекційного бурситу, реовірус, вірус пташиного грипу, вірус анемії кур, або вірус пташиного енцефаломієліту. Даний винахід також включає способи одержання живих атенуйованих IB вірусів. Живі атенуйовані віруси, одержані відповідно до цього аспекту даного винаходу є корисними для, між іншим, вакцинування курчат від IB вірусу. Способи відповідно до цього аспекту даного винаходу включають пасажування IB-QX-подібного вірусу. Наприклад, IB-QX-подібний вірус може бути пасажований у запліднені яйця птахів (наприклад, запліднені курячі яйця), або у клітинні культури (наприклад, клітинні культури курячих нирок). Кількість разів пасажування IB-QXподібного вірусу для надання йому атенуйювання може бути визначена, виходячи з доктрин, вказаних у цій заявці. Наприклад, після пасажування IB-QX-подібного вірусу, одержаний у результаті IB вірус може бути введений курчатам, та курчат потім оцінюють на предмет, наприклад, джгутикової активності трахеальних експлантатів, клінічні симптоми, макропатологію та/або гістологічні симптоми інфекційного бронхіту. Пасажований IB вірус, що продукує зменшені або менш тяжкі показання до IB порівняно з батьківським IB-QX-подібним вірусом, з якого він був одержаний (або порівняно з іншими відомими реперними IB штамами) розглядають як атенуйований штам, для цілей даного винаходу. Відповідно до деяких втілень, способи за даним винаходом включають пасажування IB-QX-подібного вірусу, доки одержаний у результаті вірус не буде підпадати у категорію "не вірулентний" або "помірний" відповідно до методології розподілу по категоріям, вказаним у цій заявці. Даний винахід також включає способи вакцинації птаха від інфекційного бронхіту. Способи відповідно до цього аспекту даного винаходу включають інфікування птаха IB вірусом, одержаним з IB-QX-подібного вірусу. Способи відповідно до цього аспекту даного винаходу можуть включати введення будь-якої вакцини, що містить будь-який IB вірус, одержаний з IBQX-подібного вірусу як описано у цій заявці. Композиції вакцин за даним винаходом можуть бути введені будь-яким чином, так, що активні або антигенні компоненти негайно або з часом входять у контакт із слизовими оболонками дихальних шляхів птахів. Таким чином, композиція вакцини може бути введена птахам, наприклад, інтраназально, перорально, та/або інтраокулярно. Композиції вакцин для введення птахам можуть бути складені так, як описано вище та/або у формі, придатній для введення розпилюванням, включаючи аерозольне (для інтраназального введення) чи у питній воді (для перорального введення). Композиції вакцин за даним винаходом можуть бути також введені підшкірно, внутріньомязово або in ovo. (Див. патент США № 7,208,164). Відповідно до цього аспекту даного винаходу, композиції вакцин, що містять IB вірус, одержаний з IB-QX-подібного вірусу, можуть бути введені птахові у віці від 1 дня до 18 тижнів. При введенні in ovo, композиція вакцини може бути введена, наприклад, у другій половині терміну інкубації. Наприклад, у випадку курчат, яйця загалом інокулюють, починаючи з дня інкубації 12 до приблизно дня інкубації 20. Переважно, інокуляція відбувається меж днем 14 до приблизно дня 19. Більш переважно, курячі яйця інокулюють у приблизно дні 15-18. Наступні приклади є ілюстративними, але не обмежуючими, прикладами способів та композицій за даним винаходом. Інші придатні модифікації та адаптації багатьох станів та параметрів, що зазвичай застосовують у молекулярній біології та хімії, є очевидними для фахівців у цій галузі з огляду даного опису та у межах обсягу та суті даного винаходу. ПРИКЛАДИ Приклад 1: ІДЕНТИФІКАЦІЯ IB-QX-ПОДІБНИХ ВІРУСІВ Цей приклад забезпечує спосіб визначення того, або є кандидатний вірус IB IB-QX-подібним вірусом. Кандидатні IB віруси можуть бути одержані з багатьох джерел, включаючи, наприклад, мазки тканин, одержані з тварин, що демонструють один чи більше симптомів інфекційного бронхіту, або з публічного депозиторію. Як вживають у цій заявці, "IB-QX-подібний вірус" є вірусом інфекційного бронхіту з S1 нуклеотидною послідовністю, яка на щонайменше 95% ідентична S1 нуклеотидній послідовності первісно ідентифікованого IB-QX штаму. S1 нуклеотидна послідовність оригінального IB-QX штаму являє собою SEQ ID NO:1, та може бути знайдена під номером доступу NCBI Genbank AF193423. Для того, щоб з’ясувати, чи є кандидатний вірус IB-QX-подібним вірусом, РНК виділяли з 8 UA 103330 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 проби, що містила частинки кандидатного вірусу (наприклад, мазки тканин) за допомогою стандартних способів виділення РНК. Наприклад, РНК може бути екстрагована за допомогою гуанідіній ізотіоціанату, фенол-хлороформного способу. (Chomcznski and Sacchi (1987), Analytical Biochemistry 162:156-159; Li та інші (1993), Avian Pathology 22:771-783). Додатково, деякі набори для виділення РНК є комерційно доступними та придатними для цього. РНК потім застосовують у полімеразно-ланцюговій реакції зворотної транскрипції (ПЛР зворотної транскрипції) з одержанням ампліфікованої ДНК копії повного гену S1 або так званої "гіперваріабельної ділянки" гену S1. Праймери, які застосовують у ПЛР зворотної транскрипції є переважно праймерами, загальними для більшості відомих штамів ІВ вірусу. Ілюстративні праймери, разом із відомими способами ПЛР зворотної транскрипції, що можуть бути застосовані для ампліфікації гіперваріабельної ділянки гену S1 кандидатних IB вірусів вказані, наприклад, у Worthington та інші (June 2008), Avian Pathology 37:247-257, and Jones та інші (2005), Veterinary Record 156:646-647. У Worthington et al., родинну ПЦР здійснюють з наступною РТ реакцією з одержанням ДНК копії S1 гіперваріабельної ділянки, що має приблизно 393 основних пар. Повнорозмірне S1 секвенування може біти здійснено за способом відповідно до Adzhar та інші (1996), Avian Pathology 25:817-836. Альтернативні праймери та умови ПЛР зворотної транскрипції є придатними для ампліфікації S1 або його частин та можуть бути легко розроблені фахівцями у цій галузі за допомогою загальнодоступної інформації щодо секвенування для IB вірусів. Після визначення нуклеотидної послідовності усього гена S1, або його частини (наприклад, гіперваріабельної ділянки), кандидатного IB вірусу, цю послідовність порівнюють з генною послідовністю S1 для штаму IB-QX (SEQ ID NO:1) для визначення відсотку ідентичності. Якщо нуклеотидна послідовність гена S1 або його гіперваріабельна ділянка, кандидатного вірусу IB щонайменше на 95% ідентична нуклеотидній послідовності S1 гену IB-QX (SEQ ID NO:1), то кандидатний IB вірус розглядають як IB-QX-подібний вірус. Ілюстративні способи визначення того, чи є кандидатний IB вірус IB-QX-подібним вірусом також описані у, наприклад, Gough та інші (2008), Veterinary Record 162:99-100, та DomanskaBlicharz та інші (2006), Veterinary Record 158:808, обидві з яких повністю включені до цієї заявки шляхом посилання. Приклад 2: AТЕНУАЦІЯ IB-QX-ПОДІБНИХ ВІРУСІВ ВВЕДЕННЯ У даному прикладі підсумовано експерименти, в яких IB-QX-подібні віруси були паса жовані багато разів у запліднені курячі яйця та атенуація одержаних у результаті вірусів була показана у курчат. МАТЕРІАЛИ ТА СПОСОБИ Віруси інфекційного бронхіту Три штами IB-QX-подібних вірусів, позначені як L-1148, 1449-2, та 1449-10, застосовували у цьому прикладі. Всі ці три штами ідентифікували як IB-QX-подібні за допомогою S1 генного секвенування та нуклеотидного порівняння IB-QX та інших IB-QX-подібних вірусів. (Див. Worthington та інші (June 2008), Avian Pathology 37:247-257). Штам L-1148 та штам 1449-10 кожен пасажували 50 разів у запліднені курячі яйця; Штам 1449-2 пасажували 5 разів у запліднені курячі яйця. Штами, одержані з цих багаторазових пасажувань, позначали як L-1148(p50), 1449-10(p50), та 1449-2(p5), відповідно. Таким чином, L1148(p50) був одержаний з L-1148; 1449-10(p50) був одержаний з 1449-10; та 1449-2(p5) був одержаний з 1449-2. План дослідження Курчатам вводили L-1148(p50), 1449-10(p50), та 1449-2(p5) віруси, разом із відомими помірним (IB-H120, вакцинний штам) та вірулентним (IB-M41) IB штамами. Контрольну неінфіковану групу також включили у дослідження. План дослідження підсумовано у Таблиці 4: 50 9 UA 103330 C2 Таблиця:4 План дослідження Група 1 2 3 4 5 контрольна 5 10 15 20 25 30 35 Кількість курчат 10 10 10 10 10 10 Тварини та тваринництво Шістдесят SPF-курчат було застосовано у цьому прикладі. У віці 15 днів, 50 курчат розділяли на п’ять груп (1-5) та поміщали в ізолятори. 10 курчат, які використовували як контрольні, залишалися у своїх загонах. Для акліматизації, курчат, яких переводили до ізоляторів, залишали на три дня. Їжа та вода були доступні за бажанням. Усіх курчат спостерігали на предмет клінічних ознак IB протягом усього дослідження. Введення вірусів За допомогою шприца на 1 мл, 5 курчатам підряд вводили IB вірус шляхом введення 0,1 мл у кожне око кожного з курчат. У випадку IB-M41 курчата одержували 0,25 мл у кожне око. Усім 6.0 курчатам вводили приблизно 10 EID50 IB вірусу у віці 18 днів. Вірусні штами зберігали при – 70°C та розводили у живильному бульйоні до відповідної концентрації перед інфікуванням. Негайно після введення вірусів курчатам, пробу застосованого вірусу зберігали у стерильній пляшці при –70°C для повторного титрування. Джгутикова активність трахеальних експлантатів Через чотири дні після інфікування, досліджували циліарну активність трахеальних експлантатів. Курчат придушували газовою сумішшю 34% O2 та 66% CO2. При досягненні стану повної анестезії, курчат вбивали вдиханням 100% CO 2. Відразу після смерті видаляли трахеї (від основи голів до 0,5 см проксимально від нижньої гортані). Відразу після видалення трахеї її промивали фосфатно-буферним середовищем (PBS) при 37°C за допомогою шприцу без голки та зберігали у PBS при 37°C до подальшої обробки. Поперечні секції 0,6 мм трахеї одержували за допомогою подрібнювача тканин McIlwain (Mickle Laboratory Engineering Co. Ltd., Surrey, United Kingdom). Поперечні секції трахеї поміщали у 2 мл PBS при 37°C у чашку Петрі та досліджували під мікроскопом протягом 4 хвилин. Циліарну активність 3 секцій у верхній частині, 4 секцій у середній частині та 3 секцій у нижній частині трахеї досліджували за допомогою мікроскопії з невеликим збільшенням (400x). Циліарну активність кожної трахеальної секції досліджували протягом 20 хвилин після вбивства птаха. Циліарну активність оцінювали у балах за шкалою від 0 (100 відсотків джгутикової активності) дo 4 (0 відсотків джгутикової активності). Для кожної групи середній циліостаз потім розраховували шляхом ділення суми трахеальних секцій, які демонстрували зупинку активності, на кількість курчат у кожній групі. Розрахований середній циліостаз у кожній групі порівнювали із середнім циліостазом груп, яким вводили Poulvac IB 120 та IB-M41, та з невакцинованою групою. IB-M41 класифікували як вірулентний та IB вірус у Poulvac IB H120 – як помірний. Клінічні симптоми Зоотехніки спостерігали птахів щодня на предмет клінічних ознак протягом усього дослідження. Клінічні ознаки, віднесені до IB інфекції, оцінювали таким чином: Клінічний симптом, що спостерігається Водні ексудати з ока чи носа Задишка Діарея 40 Штам інфікування L-1148(p50) 1449-10(p50) 1449-2(p5) IB-H120 IB-M41 неінфікована Бал Відсутній Присутній 0 2 0 4 0 1 Дослідження макропатології Некропсію здійснювали для кожного з курчат для визначення будь-яких ненормальностей, що могли бути результатом інфекції IB. Відхилення оцінювали таким чином: - Верхні дихальні шляхи: нормальний аспект = 0; слиз = 1; бронхіт/трахеїт = 2. - Нирки: нормальний аспект = 0; здуті чи бліді, з уратними кристалами = 1. 10 UA 103330 C2 5 10 15 20 25 30 35 - Селезінка: нормальний аспект = 0; здуті = 1. - Кишечник: нормальний аспект = 0; патології = 2. Гістологія трахеї, легенів та нирок Проби трахеї, легенів та нирок були взяті через 4 днів після інфікування вірусами. Усі проби піддавали гістологічному дослідженню. Імуногістохімічне забарвлення IBV епітопу 48.4 (нуклеопротеїну) застосовували для усіх проб для детекції IBV. Оцінювання Вірулентність ІВ вірусів у SPF курчат визначали за допомогою: - Джгутикової активності трахеальних експлантатів; - Присутності та серйозності клінічних симптомів; та - Патології, виявленої при патологічному дослідженні. Вірулентність IBV у SPF курчат класифікували як: - Не вірулентний, якщо загальна сума балів групи менша чи дорівнює загальній сумі балів неінфікованої групи; - Помірний, якщо загальна сума балів групи перевищує загальну суму балів контрольної групи та менша чи дорівнює загальній сумі балів групи, якій вводили Poulvac IB H120; - Помірно вірулентний, якщо загальна сума балів групи перевищує загальний бал групи, якій вводили Poulvac IB H120 та менша чи дорівнює загальній сумі балів групи, якій вводили IB M4.; - Вірулентний, якщо загальна сума балів групи дорівнює чи перевищує загальну суму балів групи, якій вводили IB-M41. Тест не вважають валідним, якщо більш ніж 10 відсотків курчат помирають з причин, не віднесених до вакцинного вірусу. У цьому Прикладі, вакциновий вірус вважають достатньо безпечним якщо: - жодні з курчат не проявляють значні клінічні симптоми пташиного інфекційного бронхіту чи вмирають з причин, віднесених до вакцинового вірусу; - Середній бал циліостазу не перевищує 25; та - Найбільш помірні запальні ураження спостерігають протягом гістологічного дослідження нирок. Віруси, які були класифіковані як помірно вірулентні чи вірулентні та що не відповідали вищезазначеним вимогам, є, проте, потенційно придатними для застосування як вірус для інфікування. РЕЗУЛЬТАТИ Титрування ІВ вірусів після інфікування курчат Титри різних IB вірусів після інфікування курчат представлені у Таблиці 5. Як показано у цій 6,0 таблиці, курчатам вводили IB вірус, що перевищував 10 EID50 в усіх випадках. Таблиця 5 Титри IBV після інфікування курчат Група 1 2 3 4 5 40 45 Вірус L-1148(p50) 1449-10(p50) 1449-2(p5) IB-H120 IB-M41 Титр у 10log EID50 на мл або на віалу Проба 1 Проба 2 Середнє значення 6,83 6,67 6,75 7,00 6,33 6,67 6,50 6,67 6,59 6,33 6,00 6,17 6,50 7,33 6,92 Клінічні симптоми, джгутикова активність та патологічне дослідження Жодне з курчат не померло протягом дослідження. Тільки дуже помірне окулоназальне ексудативне завантаження (невеликі краплини в носових отворах) та задишка після обробки курчат спостерігали у деяких курчат, яким вводили IB 1449-10(p50). Циліостаз не спостерігали у будь-якого з контрольних курчат, але його було очевидно продемонстровано у курчат, яким вводили IB-M41. Три з 10 курчат, яким вводили Poulvac IB H120 вірус, демонстрували повний циліостаз. Кількість трахеальних секцій із циліостазом збільшувалася, якщо курчатам вводили IBV 1148(p50) (6 секцій), IBV 1449-2(p5) (20 секцій) та IBV 1449-10(p50) (41 секцій). Протягом патологічного дослідження курчат, було знайдено, що у курчат, яким вводили IB 1449-2(p5), Poulvac IB H120 або IB-M41, катаральний ексудат був присутній у трахеях. В одного курча, якому вводили IB 1449-2(p5), були знайдені бліді нирки, що здулися. 11 UA 103330 C2 Виходячи зі джгутикової активності, клінічних симптомів та результатів після смерті підсумовано у Таблиці 6, було зроблено класифікацію IB-QX-подібних-похідних вірусів. Штам L1148(p50) класифікували як помірний, IBV 1449-10(p50) як помірно вірулентний, and IBV 14492(p5) як злегка вірулентний порівняно із Poulvac IB H120 та IB-M41. 5 Таблиця 6 Класифікація ІВ вірусів після інфікування SPF курчат Бал* Група 1 2 3 4 5 6 10 15 20 25 30 35 40 45 Вірус L-1148(p50) 1449-10(p50) 1449-2(p5) IB-H120 IB-M41 інфікування відсутнє Середній бал C(n) циілостазу 2 24(1) 16 164(4) 8 80(2) 12 120(3) 40 400(10) 0 S 0 24 0 0 0 0 0 5 1 4 Усього (C+S+P) 24 188 85 121 404 0 0(0) P 0 0 Класифікація Помірний Помірно вірулентний Помірний Помірний Вірулентний Не вірулентний * Бали засновані на: (C) джгутиковій активності трахеальних експлантатів, (n) = кількість уражених курчат; курчата вважають ураженими, якщо щонайменше дві трахеальні сегменти демонструють циліостаз. (S) Клінічних симптомах. (P) Патологічному дослідженні. Гістологія трахеї, легенів та нирок Жодна патологія не була знайдена у трахеях курчат, яким вводили L-1148(p50), 1449-2(p5) та IB-H120. Після інфікування 1449-10(p50) місцевий трахеїт з некрозом був знайдений в одній з чотирьох трахей. Усі трахеї курчат, яким вводили IB-M41, демонстрували гострий трахеїт. IBV може бути детектований лише у трахеях курчат, інфікованих IB-M41. Жодна патологія не була знайдена та жодні IBV не були детектовані у легенях жодних курчат. Гістологія нирок курчат, яким вводили L-1148(p50) та 1449-10(p50), продемонструвала легку інфільтрацію мононуклеарних та плазма целюлярних клітин у деяких випадках. Тубулярний епітелій не був уражений. За допомогою імуногістохімії жодні IBV-антигени були детектовані в епітеліальних клітинах трубочок проб нирок, взятих через 4 дня після інфікування. Жодні IBV не можуть бути детектовані у нирках будь-яких груп після імуногістохімічного забарвлення. Обговорення IBV спочатку інфікує трахеальну слиз а потім реплікує епітелій інших органів, наприклад, клітини трубчастого епітелію нирки та епітелію яейцепроводу. Реплікація IBV в епітеліальних клітинах може призводити до виродження клітин та наступних патологічних змін в органах/тканинах. Чи будуть мати місце клінічні симптоми, залежить від декількох факторів, таких, як вірулентність IBV, інфіковані органи, наявність вторинної інфекції та загальний стан здров'я курча. Це спостерігають у трахеях курчат, яким вводили IBV, де джгутикова активність погіршена в усіх (IBV-M41), 40% (1449-10(p50)), 20% (1449-2(p5)) та 10% (IBV L-1148(p50)) тварин. Катаральний ексудат був присутній у трахеях курчат, яким вводили IBV 1449-2(p5), Poulvac IB H120 та IB-M41. Тільки коли курчатам вводили IBV 1449-10(p50), спостерігали помірні клінічні симптоми, які, як припускали, були результатом циліостазу та наступного накопичення слизу. Приймаючи до уваги, що курчатам вводили високі дози IBV, результати даного Прикладу є багатообіцяючими. Відсутність клінічних симптомів після інфікування курчат IBV L-1148(p50) та IBV 1449-2(p5) найбільш вірогідно, відображає факт того, що клінічні симптоми, спричинені відповідними польовими штамами, є помірними. Тільки помірні респіраторні симптоми спостерігали після інфікування SPF курчат IBV 1449-10(p50), що демонструє атенуацію даного штаму, оскільки польовий штам IBV 1449-10 був вірулентний. Висновок Як показано у цьому Прикладі, IB-QX-подібні віруси можуть бути атенуйовані множинним пасажуванням. Одержані в результаті атенуйовані штами, одержані з IB-QX-подібних вірусів, є багатообіцяючими як нові вакцинні штами від інфекційного бронхіту. Пасажовані віруси, одержані з IB-QX-подібних вірусів, що спричиняють помірно вірулентні впливи при інфікуванні 12 UA 103330 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 курчат, будуть корисними як матеріал для інфікування для дослідження та додаткової розробки нових IB вакцин, особливо вакцини від IB-QX-подібних вірусів. Приклад 3: ДОДАТКОВЕ ПАСАЖУВАННЯ ТА БЕЗПЕКА IB-QX-ПОДІБНОГО ШТАМУ L-1148 Введення У цьому Прикладі, штам L-1148 IB-QX-подібного вірусу пасажували багато разів у запліднені курячі яйця. Безпеку вірусів при різних рівнях пасажування оцінювали шляхом вимірювання ступеню циліостазу та морфології нирок у курчат. Як проілюстровано нижче, багаторазове пасажування штаму L-1148 призвело до одержання атенуйованого штаму, придатного як вакцина проти інфекцій IB-QX-подібних вірусів. Пасажування L-1148 у запліднених SPF курячих яйцях Для пасажування вірусу, застосовували 10 - 11 денні запліднені вільні від специфічної патогенної мікрофлори (SPF) курячі яйця. Штам L-1148 спочатку пасажували сім разів у SPF курячі яйця. Для перших 5 пасажів нерозведену алантоїсну рідину інокулювали. Пасажи здійснювали лише з алантоїсними рідинами з яєць з живими ембріонами. Це призвело до приблизно 50% мертвих ембріонів. Було вирішено продовжувати пасажування з 100-кратно розведеними алантоїсними рідинами у фізіологічному сольовому розчині, з одержанням меншої кількості мертвих ембріонів. Пасажи продовжували до пасажу 73. Після збору пасажу 73 стало відомо, що там було наявно забруднення вірусом хвороби Ньюкасла (ND) у IB L-1148 штамі. Проби крові від курчат вакцинували пасажем 50 штаму IB L-1148, що містив антитіла від ND вірусу. Аналіз ПЛР зворотної транскрипції проб пасажу 8 виявив, що штам IB L-1148 був контамінований цим вірусом з початку. Було вирішено зупинити пасажування та очистити штам вірусу IB L-1148 від забруднень. Деконтамінація L-1148 пасажів Проби були взяті з пасажів 22, 47 та 73 та оброблені ND специфічною антисироваткою. Стисло, проби алантоїсної рідина змішували з пробами ND специфічної поліклональної антисироватки при об’ємному співвідношенні алантоїсні рідина : сироватка, що становило 1 : 2. Суміш інкубували при 37°C протягом однієї години с наступним інкубуванням протягом усієї ночі при 4°C. Після інкубації 10-кратного розведення одержували серії та 5 яєць на розведення інокулювали кожне 0,1 мл. Після 2 днів алантоїсні рідини збирали та збирали проби з найвищого розведення, які все ще були позитивними для IB за допомогою ПЛР зворотної транскрипції. Яйця з мертвими ембріонами відбраковували. Алантоїсну рідину знову обробляли ND анти сироваткою, як вказано вище, та серії розведення знов інокулювали в яйцях. Після інкубації, знов збирали найвище розведення, що все ще було позитивним для IB за допомогою ПЛР зворотної транскрипції, розділяли на частини та заморожували та зберігали при -70°C. Наступний процес деконтамінації призводив до очищених та клонованих пасажів 24, 49 та 7 75. Партію при рівні пасажування 25 одержували шляхом інокуляції 10 -кратного розведення в яйцях, 0,2 мл на яйце, та збирали через 48 годин інкубації при 37°C. Алантоїсну рідину розділяли на невеликі частини та зберігали при -70°C. Партію пасажу 50 одержували відповідно до такої самої процедури. Пасаж 75 додатково пасажували до пасажу 80. Алантоїсні рідини пасажу 80 збирали у пул, розділяли на невеликі частини та заморожували та зберігали при 70°C. Аналіз безпеки Безпеку різних рівнів пасажування штаму IB L-1148 у курчат аналізували декілька разів. Також у дослідження був включений неатенуйований IB-QX-подібний штам 1449-10, разом із вірулентним масачусетс-подібним штамом IB-M41 та помірним вакцинним штамом Poulvac IB H120. SPF курчата у віці 1 дня застосовували для кожного тесту. Тести здійснювали відповідно до стандартних процедур. Стисло, за допомогою шприцу на 1 мл, 5 курчатам підряд вводили IB вірус шляхом введення 0,1 мл у кожне око кожного з курчат. У випадку IB-M41 курчата одержували 0,25 мл у кожне око. Ліофілізований вірус відновляли у воді для ін’єкцій та додаткові розведення готували у живильному бульйоні. Потім птахів спостерігали щоденно на предмет клінічних симптомів. Через п’ять днів після інфікування вірусом, циліарну активність трахеальних експлантатів досліджували для 5 курчат. Трахеї видаляли у курчат, яких піддавали евтаназії, та одержували поперечні секції трахеї по 0,6 мм, 3 секцій верхньої частини, 4 секцій середньої частини та 3 секцій нижньої частини трахеї. Поперечні секцій трахеї поміщали у чашку Петрі, що містила 2 мл PBS при 37°C, та досліджували під мікроскопом протягом 4 хвилин. Циліарну активність оцінювалиу балах мікроскопічно, за шкалою від 0 (100 відсотків джугитикової активності) дo 4 (0 відсотків джугитикової активності). Для кожної групи був розрахований середній циліостаз шляхом розділення суми трахеальних секцій, що проявляли 13 UA 103330 C2 5 зупинку активності, на кількість курчат у кожній групі. Проби трахей, легенів та нирок були взяті від тварин, яких піддавали евтаназії. Усі проби досліджували гістологічно. Імуногістохімічне забарвлення IBV епітопу 48,4 (нуклеопротеїн) було проведено для детекції IB вірусу. Результати підсумовані у Таблиці 7. Таблиця 7 Підсумовані результати тестів безпеки різних пасажувань L-1148 Проаналізований вірус Титр* Циліарний бал 1449-10 5,6 39 1449-10 3,0 32 IB H120 6,0 18 L-1148(p8) 6,0 39 L-1148(p25) 6,0 18 L-1148(p40) 6,0 21 L-1148(p50) 6,0 31 IB-M41 3,3 37 IB-M41 3,3 40 IB H120 6,0 16 L-1148(p25) L-1148(p50) L-1148(p80) L-1148(p65) Дослідження 6,0 6,0 6,0 6,0 13 22 3 18 A B C * Титр виражений у 10 15 20 25 30 Нирки бліді, здуті, тяжкий нефрит бліді, здуті, тяжкий нефрит помірний нефрит бліді, здуті, помірний нефрит бліді, здуті, помірний нефрит бліді, здуті, помірний нефрит бліді, здуті, помірний нефрит відсутні бліді, помірний нефрит бліді, помірний нефрит помірний нефрит помірний нефрит помірний нефрит відсутні Трахея нормальна нормальна нормальна нормальна нормальна нормальна нормальна нормальна нормальна слиз, трахеїт слиз, трахеїт трахеїт нормальна 1x слиз 10 log EID50 на дозу Результати вказують на те, що IB-M41 (вірулентний штам) мав високий бал циліостазу; максимальний бал, що міг бути досягнутий, становив 40. Штам IB 1449-10 також мав високий циліарний бал. Вакцинний штам IB H120 мав нижчий бал, що відповідало нормативним вимогам (наприклад, менш ніж 25). Пасаж 8 штаму IB L-1148 мав високий бал 39 у дослідженні A. Існувало сильне зменшення до 18 на рівні пасажу 25. На рівні пасажів 40 та 50 відбувалося збільшення балів циліостазу до 31 для p50 у дослідженні A. Проби штаму IB L-1148, що аналізували у дослідженні A, усі були забруднені ND вірусом. Рівні пасажів 25 та 50 знову аналізували після очищення від ND контамінації. У цьому випадку бали циліостазу були очевидно нижчими та знаходилися у прийнятному діапазоні для вакцинного штаму. У дослідженні B також аналізували пасаж 80. Це пасаж призводив до дуже низького балу циліостазу, значно нижче, ніж IB H120. Передбачали, що рівні пасажу 80 можуть бути атенуйовані більше потрібного для безпеки вакцинного штаму. Таблиця 7 також демонструє результати досліджень нирок та трахеї. Помірний нефрит розглядали як прийнятний, доки він був короткотривалим. Трахеїт розглядали як прийнятний тільки якщо він був короткотривалим, аналогічно для слизу у трахеї. Результати демонструють, що пасажі 8, 25, 40 та 50 IB L-1148 впливали на нирки, подібно до реперного вакцинного штаму IB H120, але не так тяжко як IB штам 1449-10. Пасаж 80 також мав аналогічний вплив на нирки. Після аналізу результатів Досліджень A та B, було вирішено одержати партію IB L-1148 на рівні пасажу 65 (тобто, L-1148(p65)) та оцінити безпеку одержаних у результаті вірусів. Пасажи одержували з пасажів 50 - 64 шляхом інокуляції кожного з яєць 0,1 мл 100-кратними розведеннями зведеними у пул надосадовими алантоїсними рідинами з попереднього пасажу, до рівня пасажу 64. Велику партію одержували на рівні пасажу 65, за GMP. Кожне з яєць інокулювали 0,2 мл 1000-кратного розведення алантоїсної рідини з рівня пасажу 64. Після 24 14 UA 103330 C2 5 10 15 20 годин інкубації при 37°C, алантоїсну рідину збирали у пули. Проба була взята з одного з пулів, титрована та піддана аналізу безпеки. Результати підсумовані у Таблиці7 (Дослідження C). Результати демонструють, що середній бал циліостазу становив18, що аналогічно результату попереднього аналізу для IB H120. Нефрит не спостерігали та деяку кількість слизу було знайдено у трахеї у тільки одного з 15 курчат. Висновок Цей Приклад демонструє, що безпечні вакцинні штами від IB-QX-подібних вірусів можуть бути одержані шляхом пасажування IB-QX-подібного штаму у запліднені курячі яйця багато разів. У цьому Прикладі, рівні пасажів від 25 до 80 призвели до одержання атенуйованих вірусів, що мали профілі безпеки порівняні з відомою прийнятною IB вакциною. Приклад 4: ЕФЕКТИВНІСТЬ ВАКЦИН, ОДЕРЖАНИХ З IB-QX-ПОДІБНОГО ШТАМУ L-1148 У цьому Прикладі, оцінювали ефективність двох вакцинних штамів, одержаних з IB-QXподібного штаму L-1148. Аналізували вакцинні штами L-1148(p65) та L-1148(p80) (див. Приклад 3). Одноденні курчат SPF типу потомства вакцинували розпиленням (0,5 мл на дозу). Через 4.0 три тижні після вакцинації курчатам вводили кожному дозу 10 EID50 IB штаму D388 ( вірулентний IB-QX-подібний штам, виділений у Нідерландах). Циліарну активність трахеальних експлантатів досліджували через 5 днів після інфікування. Відразу після смерті трахею видаляли, промивали та зберігали у фізіологічному сольовому розчині при 37°C до додаткової обробки. Невеликі поперечні секцій трахеї розрізали вручну. Циліарну активність 3 секцій верхньої частини, 4 секцій середньої частини та 3 секцій нижньої частини трахеї досліджували за допомогою мікроскопії з невеликим збільшенням. Циліарну активність оцінювали у балах за допомогою таких класифікаційних критеріїв: Бал 0 Критерії >50% трахеальної секції демонструє циліарну активність.