Спосіб введення молекули чужорідної днк в попередньо визначений сайт в геномі рослинної клітини

Реферат: Винахід належить до способу введення молекули чужорідної ДНК в попередньо визначений сайт в геномі рослинної клітини, який включає індукування двонитчастого розриву ДНК в попередньо визначеному сайті, введення вказаної молекули чужорідної ДНК у вказану рослинну клітину і відбір рослинної клітини, в якій вказана чужорідна ДНК є введеною у вказаний попередньо визначений сайт. Вказаний двонитчастий розрив ДНК індукується введенням реконструйованої однонитчастої мегануклеази або пари реконструйованих мегануклеаз, які сукупно розпізнають вказаний попередньо визначений сайт і індукують вказаний двонитчастий розрив, причому вказаним попередньо визначеним сайтом є нуклеотидна послідовність, відмінна від сайту розпізнавання для природної мегануклеази. UA 115961 C2 (12) UA 115961 C2 UA 115961 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь техніки Даний винахід стосується галузі агрономії. Більш конкретно, даний винахід пропонує способи і засоби для введення цільової модифікації, включаючи вставку, делецію або заміщення, в точно локалізовану нуклеотидну послідовність в геномі трансгенної рослини, де ця нуклеотидна послідовність міститься в межах елемента або фрагмента ДНК, часто використовуваного в перенесенні рослинних генів, такого як широко використовуваний селектований маркерний ген. Такі модифікації запускаються на першому етапі введенням двонитчастого розриву в розпізнавальну нуклеотидну послідовність за допомогою мегануклеаз, одержаних з природних мегануклеаз, які були реконструйовані, щоб розпізнавати сайт рестрикції і розщеплювати його. Рівень техніки Потреба вводити цільові модифікації в рослинні геноми, включаючи контроль над місцем інтеграції чужорідної ДНК в рослини, стає все більш нагальною, і в намаганні задовольнити цю потребу було розроблено кілька способів (для огляду дивись Kumar and Fladung, 2001, Trends in Plant Science, 6, pp. 155-159). Ці способи полягають в основному в початковому введенні двонитчастого розриву ДНК в цільовому місці. Було показано, що активація цільового локусу та/або репаративної або донорної ДНК шляхом введення двонитчастих розривів ДНК за допомогою рідкорозщеплюючих ендонуклеаз, таких як I-SceI, підвищує частоту гомологічної рекомбінації на кілька порядків величини (Puchta et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 93, spp 5055-5060; Chilton and Que, Plant Physiol., 2003; D'Halluin et al. 2008 Plant Biotechnol. J. 6, 93-102). Публікація WO 96/14408 описує виділену ДНК, кодуючу фермент I-SceI. Ця послідовність ДНК може бути включеною у вектори клонування і експресії, трансформовані клітинні лінії і трансгенні тварини. Такі вектори використовуються в картуванні генів і у спрямованій на сайт вставці генів. Публікація WO 00/46386 описує способи модифікації, репарації, ослаблення та інактивації гену або іншої хромосомної ДНК в клітині шляхом індукованого I-SceI двонитчастого розриву. Також описаними є способи лікування або профілактики генетичної хвороби у індивіда, який того потребує. Описані також химерні рестрикційні ендонуклеази. Крім того, були описані способи, які дозволяють конструювати рідкорозщеплюючі ендонуклеази для того, щоб змінювати специфічність цих ферментів до субстрату або послідовності, тим самим забезпечуючи введення двонитчастого розриву в локус, що становить інтерес, незалежно від присутності сайту розпізнавання для будь-яких з природних рідкорозщеплюючих ендонуклеаз рестрикції. В короткому викладі, химерні рестрикційні ферменти можуть бути отримані з використанням гібридів між доменом "цинковий палець", призначеним для розпізнавання конкретної нуклеотидної послідовності, і доменом відщеплення неспецифічної ДНК від природного рестрикційного ферменту, такого як FokI. Такі способи є описаними, наприклад, в публікаціях WO 03/080809, WO 94/18313 або WO 95/09233, а також в статтях Isalan et al., 2001, Nature Biotechnology 19, 656-660; Liu et al. 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 5525-5530). Інший спосіб одержання виготовлених на замовлення мегануклеаз, який здійснюється шляхом відбору з бібліотеки варіантів, є описаним в публікації WO 2004/067736. Мегануклеази на замовлення або реконструйовані мегануклеази зі зміненою специфічністю до послідовності і афінністю до зв'язування з ДНК можуть бути одержані також шляхом раціонального конструювання, як описано в публікації WO 2007/047859. Публікація WO 2007/049095 описує варіанти хомінг ендонуклеази "LADGLIDADG", що мають мутації в двох окремих субдоменах, кожний з яких зв'язує іншу частину модифікованого цільового напівсайту ДНК, так що такий варіант ендонуклеази є здатним розщеплювати цільову послідовність химерної ДНК, яка містить нуклеотиди, зв'язані кожнимсубдоменом. Публікації WO 2007/049156 і WO 2007/093836 описують варіанти хомінг ендонуклеази I-CreI, що мають нову специфічність щодо розщеплення, та їх застосування. Публікація WO 2007/047859 описує раціонально сконструйовані мегануклеази зі зміненою специфічністю до послідовності і афінністю до зв'язування з ДНК. Публікація WO 2006/105946 описує спосіб точного обміну в рослинних клітинах і рослинах цільової послідовності ДНК на послідовність ДНК, що становить інтерес, шляхом гомологічної рекомбінації, де селектований або відібраний скринінгом маркер, використовуваний під час фази гомологічної рекомбінації для тимчасового відбору явищ заміщення гену, згодом може бути видаленим, не залишаючи сліду і без вдавання до культури in vitro під час етапу видалення, з використанням описаної тут методики видалення відібраної ДНК шляхом специфічної до мікроспори експресії рідкорозщеплюючої ендонуклеази, що індукує двонитчастий розрив. 1 UA 115961 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Попередня заявка на патент США 60/828,042 і Європейська заявка на патент 06020370.0, а також публікація WO 2008/037436 описують варіанти способів і засобів за WO 2006/105946, де етап видалення фрагменту відібраної ДНК, індукований рідкорозщеплюючою ендонуклеазою, що викликає двонитчастий розрив, знаходиться під контролем промотору, специфічного для генеративної лінії. Інші варіанти здійснення цього способу базуються на не гомологічному кінцевому приєднанні репаративної ДНК на одному кінці і гомологічній рекомбінації на іншому кінці. Gao et al. 2009, The Plant Journal, pp. 1-11, описують спадковий цільовий мутагенез в кукурудзі з використанням реконструйованої ендонуклеази. Оскільки реконструйовані ендонуклеази походять від ендонуклеаз, що трапляються у природі, наявні потенційні сайти розпізнавання не є повністю випадковими, а очевидно мають певний ступінь схожості з тією нуклеотидною послідовністю, яка спочатку розпізнавалась тією природною ендонуклеазою, на якій базується реконструйована мегануклеаза. Як стверджували Gao et al., 2009 (supra), заснований на структурі спосіб конструювання білка для модифікації параметрів I-CreI щодо зв'язування з ДНК, полягає у візуальній перевірці ко-кристалічної структури I-CreI-ДНК, яка приводить до передбачення великої кількості амінокислотних заміщень, які змінюють базову преференцію I-CreI в конкретних позиціях в її сайті розпізнавання. Індивідуальні амінокислотні заміщення були піддані експериментальній оцінці, і ті з них, які забезпечували бажану зміну в базовій преференції, додавались до бази даних мутацій, що можуть бути "змішаними або дібраними" для генерації похідних I-CreI, які розпізнають дуже відмінні сайти ДНК. Теоретично, наявне в існуючій базі даних мутацій комбінаторне різноманіття є достатнім, щоб зорієнтувати сконструйовану ендонуклеазу приблизно через кожні 1000 пар основ у випадковій послідовності ДНК. Відповідно, все ще залишається потреба у функціональних реконструйованих мегануклеазах, які можуть розпізнавати сайт розпізнавання в елементі або ділянці ДНК, попередньо введених в трансгенну рослину у вигляді широко використовуваної частини трансгену, і індукувати двонитчастий розрив ДНК на цій ділянці з достатньою ефективністю, тим самим запускаючи події, необхідні, наприклад, для вставки чужорідної ДНК, делеції або заміщення, шляхом гомологічної рекомбінації або не гомологічного кінцевого приєднання в місці цього двонитчастого розриву. Ідентифікація такої пари сайту розпізнавання і реконструйованої мегануклеази посилює арсенал наявних інструментів для модифікації геному рослини у цільовий спосіб, дозволяючи здійснювати вставку, делецію або заміщення ДНК поблизу індукованого двонитчастого розриву ДНК в місці попередньо введеного трансгену без необхідності вдаватись до присутності історично введених сайтів розпізнавання для рідкорозщеплюючих ендонуклеаз, таких як, наприклад, I-SceI (які в природі в рослинних клітинах не трапляються). Ці та інші проблеми є вирішеними, як тут описано в різних докладних варіантах здійснення цього винаходу, а також у формулі винаходу. Суть винаходу В одному варіанті здійснення цього винаходу пропонується спосіб введення молекули чужорідної ДНК в попередньо визначений сайт в геномі трансгенної рослинної клітини, який включає наступні етапи: а. індукування двонитчастого розриву ДНК в попередньо визначеному сайті; b. введення молекули чужорідної ДНК в рослинну клітину; с. відбору рослинної клітини, в якій чужорідна ДНК є введеною в попередньо визначений сайт; і d. необов'язково регенерації цієї рослинної клітини в рослину, і характеризується тим, що цим попередньо визначеним сайтом є нуклеотидна послідовність, відмінна від сайту розпізнавання для мегануклеази, що трапляється в природі, і що цей попередньо визначений сайт є нуклеотидною послідовністю, яка звичайно вводиться як частина трансгену в трансгенній рослині і в якій двонитчастий розрив ДНК індукується введенням однонитчастої мегануклеази, що не трапляється у природі, або пари мегануклеаз, що не трапляються у природі, яка розпізнає або які сумісно розпізнають цей попередньо визначений сайт і яка індукує або які індукують двонитчастий розрив. В іншому варіанті здійснення цього винаходу пропонується спосіб введення молекули чужорідної ДНК в попередньо визначений сайт в геномі трансгенної рослинної клітини, який включає наступні етапи: а. індукування двонитчастого розриву ДНК в попередньо визначеному сайті; b. введення молекули чужорідної ДНК в рослинну клітину; 2 UA 115961 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 с. відбору рослинної клітини, в якій чужорідна ДНК є введеною в попередньо визначений сайт; і d. необов'язково регенерації цієї рослинної клітини в рослину, і характеризується тим, що цей попередньо визначений сайт міститься в межах ділянки, кодуючої фосфінотрицин ацетил-трансферазу від S. hygroscopicus (ділянка, кодуюча ген bar), яка може мати нуклеотидну послідовність SEQ ID №: 3, і що двонитчастий розрив ДНК індукується введенням однонитчастої мегануклеази або пари мегануклеаз, яка розпізнає або які сумісно розпізнають цей попередньо визначений сайт і індукує або індукують двонитчастий розрив. Попередньо визначений сайт може містити нуклеотидну послідовність SEQ ID №: 1 або SEQ ID №: 2. В ще іншому варіанті здійснення цього винаходу пропонується спосіб введення молекули чужорідної ДНК в попередньо визначений сайт в геномі трансгенної рослинної клітини, який включає наступні етапи: а. індукування двонитчастого розриву ДНК в попередньо визначеному сайті; b. введення молекули чужорідної ДНК в рослинну клітину; с. відбору рослинної клітини, в якій чужорідна ДНК є введеною в попередньо визначений сайт; і d. необов'язково регенерації цієї рослинної клітини в рослину, і характеризується тим, що цей попередньо визначений сайт містить нуклеотидну послідовність SEQ ID №: 1 або SEQ ID №: 2 і що двонитчастий розрив ДНК індукується введенням однонитчастої мегануклеази або пари мегануклеаз, яка розпізнає або які сумісно розпізнають цей попередньо визначений сайт і індукує або індукують двонитчастий розрив, такої як мегануклеаза або пара мегануклеаз, що походять від I-CreI (представленої послідовністю SEQ ID №: 16), і в якій наступні амінокислоти є присутніми в одній з субодиниць: S в позиції 32; Y в позиції 33; E в позиції 38; R в позиції 40; K в позиції 66; Q в позиції 80; T в позиції 42; R в позиції 77; R в позиції 68; R в позиції 70; Q в позиції 44; I в позиції 24; S в позиції 26; S в позиції 28 та R в позиції 30 або R в позиції 70; T в позиції 44; I в позиції 24; S в позиції 26; S в позиції 28; N в позиції 30; S в позиції 32; R в позиції 33; Q в позиції 38; Q в позиції 80; R в позиції 40; K в позиції 66; T в позиції 42; R в позиції 77 та R в позиції 68 (позиції, що відповідають амінокислотній послідовності I-Cre-I). Прикладами такої мегануклеази є білки, що містять амінокислотну послідовність SEQ ID №: 5 і SEQ ID №: 6, відповідно, кодовані нуклеїновою кислотою, яка містить нуклеотидну послідовність SEQ ID №: 4 від нуклеотидної позиції 2004 до нуклеотидної позиції 2525 або до 2522, або нуклеотидну послідовність SEQ ID №: 4 від нуклеотидної позиції 4885 до нуклеотидної позиції 5405 або до 5403. Однонитчастими мегануклеазами за цим винаходом може бути білок, що містить амінокислотну послідовність SEQ ID №: 18, кодований нуклеотидною послідовністю, що являє собою нуклеотидну послідовність SEQ ID №: 17 від нуклеотидної позиції 1267 до 1605 та від 1795 до 2541, або білок, що містить амінокислотну послідовність SEQ ID No.18 від амінокислотної позиції 1 до 167 та від 208 до 362, кодований нуклеотидною послідовністю, що являє собою нуклеотидну послідовність SEQ ID №: 17 від нуклеотидної позиції 1267 до 1605, від 1795 до 1956 та від 2071 до 2541. В будь-якому з варіантів здійснення чужорідна ДНК може бути розміщеною всередині репаративної ДНК, що містить щонайменше одну фланкуючу нуклеотидну послідовність, гомологічну попередній (проти ходу транскрипції) або наступній послідовності нуклеотидної послідовності SEQ ID №: 1 або SEQ ID №: 2. Ця чужорідна ДНК може містити ген селектованого маркера та/або експресований рослиною ген, що становить інтерес, такий як ген стійкості до гербіциду, ген стійкості до комах-шкідників, ген стійкості до хвороб, ген стійкості до абіотичного стресу, фермент, задіяний в біосинтезі олії, біосинтезі вуглеводів, фермент, задіяний в міцності волокон або довжині волокон, фермент, задіяний в біосинтезі вторинних метаболітів. Чужорідна ДНК може також бути інтегрованою як така, тобто без фланкуючих послідовностей з гомологією до ділянки біля попередньо визначеного цільового сайту (без будь-якої додаткової ДНК), для інтеграції шляхом не гомологічного кінцевого приєднання. Мегануклеаза або пара мегануклеаз можуть експресуватись з химерного гену або пари химерних генів, кожний з яких містить експресований рослиною промотор, функціонально зв'язаний з кодуючою ділянкою, що кодує дану мегануклеазу або одну з пари мегануклеаз, і додатково функціонально зв'язаний з ділянкою ДНК, задіяною в термінації транскрипції і поліаденілюванні, функціональною в рослинній клітині. Даний винахід пропонує також рослинні клітини, а також рослини і насіння або частини для розмноження, в які чужорідну ДНК було введено в попередньо визначений сайт і які були одержані методами, описаними тут. 3 UA 115961 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід пропонує також спосіб вирощування рослини, в яку чужорідну ДНК було введено в попередньо визначений сайт і яку було одержано методами, описаними тут, що включають етап нанесення хімічної сполуки на цю рослину або на субстрат, в якому ця рослина вирощується. Ще інший варіант здійснення цього винаходу стосується процесу одержання рослини, що містить чужорідну ДНК, інтегровану ділянку, який включає етап схрещування рослини, що містить суттєво рослинні клітини, одержані способами за цим винаходом, з іншою рослиною або з самою собою і необов'язково збирання насіння. Даний винахід стосується також процесу, який включає етап нанесення хімічної сполуки на рослину або насіння рослини, в яку чужорідну ДНК було введено в попередньо визначений сайт і які були одержані методами, описаними тут. Інший варіант здійснення цього винаходу стосується застосування мегануклеази або пари мегануклеаз, як тут описано, для введення чужорідної ДНК в ділянку, кодуючу ген bar, в рослинній клітині. Ще інший варіант здійснення цього винаходу стосується застосування виготовленої на замовлення мегануклеази для введення чужорідної ДНК, що становить інтерес, в попередньо визначений сайт в рослинній клітині. Короткий опис малюнків На Фіг. 1 схематично представлено сайт розпізнавання і взаємодії з амінокислотами різних мономерних одиниць BAY 39 і BAY40 мегануклеази. На Фіг. 2 показана амінокислотна послідовність мономерної одиниці 2 BAY 39/40 ("40") (зверніть увагу на те, що ця амінокислотна послідовність містить клітинний сигнал внутрішньоядерної локалізації SV40 (амінокислоти від 1 до 10)). На Фіг. 3 показана амінокислотна послідовність мономерної одиниці 1 BAY 39/40 ("39") (зверніть увагу на те, що ця амінокислотна послідовність містить клітинний сигнал внутрішньоядерної локалізації SV40 (амінокислоти від 1 до 10)). На Фіг. 4 показана амінокислотна послідовність однонитчастої мегануклеази BAY 39/40 (зверніть увагу на те, що ця амінокислотна послідовність містить клітинний сигнал внутрішньоядерної локалізації SV40 (амінокислоти від 1 до 10) і лінкерну ділянку (амінокислоти від 168 до 205)). На Фіг. 5 показане зіставлення нуклеотидної послідовності ампліконів ПЛР біля сайту розпізнавання ділянок, кодуючих ген bar, в чутливих до фосфінотрицину лініях, одержаних від трансгенної рослини, що містить експресований рослиною ген bar (домінуючий ген бактерії Streptomyces hygroscopius, кодуючий фосфінотрицин ацетил трансферазу) і експресовані рослиною гени для мономерних одиниць BAY39/40. 1. нуклеотидна послідовність контрольного зразка; 2. нуклеотидна послідовність лінії, стійкої до фосфінотрицину; 3-9: нуклеотидні послідовності ліній, чутливих до фосфінотрицину. Опис різних варіантів здійснення цього винаходу Даний винахід базується на тому спостереженні, що можна одержувати функціональні реконструйовані мегануклеази, що специфічно розпізнають і розщеплюють нуклеотидну послідовність (SEQ ID №: 1 і SEQ ID №: 2 - Фіг. 1), яку можна знайти в нуклеотидній послідовності кодуючої ділянки гену фосфінотрицин ацетил трансферази від Streptomyces hygroscopius (ген bar) (Thompson, C., Movva, R., Tizard, R., Crameri, R., Davies, J., Lauwereys, M. ans Botterman, J. (1987) Characterization of the herbicide-resistance gene bar from Streptomyces hygroscopicus. The EMBO Journal 6: 2519-2523 (Accession X05822), що є присутньою в широко використовуваному в трансгенезі рослин селектованому маркерному гені. Послідовність SEQ ID №: 3 представляє собою нуклеотидну послідовність гену bar. Комплемент сайту розпізнавання послідовності SEQ ID №: 1 (SEQ ID №: 2) відповідає нуклеотидній послідовності SEQ ID №: 3 від нуклеотиду 132 до 153. Отже, описані тут мегануклеази є здатними розпізнавати і розщеплювати нуклеотидну послідовність в трансгенних рослинах, що містять експресований рослиною ген, який має експресований рослиною промотор, функціонально зв'язаний з ділянкою ДНК, кодуючою ген фосфінотрицин ацетил трансферази від Streptomyces hygroscopius (ген bar), за якою йде функціональна в рослинах ділянка термінації транскрипції і поліаденілювання, при цьому ділянка, кодуюча bar, містить нуклеотидну послідовність, що є комплементом нуклеотидної послідовності SEQ ID №: 1, такої як SEQ ID №: 3. Ділянку, кодуючу bar, включали в цілу низку трансгенних рослин, які були, є або будуть комерціалізовані, включаючи рослини, що містять наступні події: Цикорій (Cichorium intybus): - Об'єкти RM3-3, RM3-4, RM3-6, як описано в регуляторному файлі 97-148-01p 4 UA 115961 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Олійний рапс (Brassica napus): - Об'єкт MS1, як описано в регуляторних файлах DD95-04 (CA) або 98-278-01p (US) - Об'єкт MS8, як описано в регуляторних файлах DD96-17 (CA) або 98-278-01p (US) або WO 2001/041558 - Об'єкт RF1, як описано в регуляторних файлах DD95-04 (CA) або 98-278-01p (US) - Об'єкт RF2, як описано в регуляторних файлах DD95-04 (CA) або 98-278-01p (US) - Об'єкт RF3, як описано в регуляторних файлах DD96-17 (CA) або 98-278-01p (US) або WO 2001/041558 - Об'єкти PHY14, PHY35, PHY36, як описано в японських регуляторних файлах Бавовник (Gossypium hirsutum): - Об'єкт LLcotton 25, як описано в регуляторних файлах 02-042-01p (US) або WO 2003/013224 - Об'єкт T303-40, як описано в WO2008/122406 - Об'єкт GHB119, як описано в регуляторному файлі 08-340-01p (US) або WO2008/151780 Кукурудза (Zea mays): - Об'єкт TC-6275 (=DAS-06275-8), як описано в регуляторному файлі 03-181-01p (US) - Об'єкт Bt176, як описано в регуляторному файлі 94-319-01p (US) - Об'єкт B16 (=DLL25), як описано в досьє зняття регуляції США 95-145-01p або WO9506128 - Об'єкт DBT418, як описано в досьє зняття регуляції США 96-291-01p (US) - Об'єкт ZMA101 - Об'єкт CBH351, як описано в досьє зняття регуляції США 97-265-01p (US) - Об'єкт MS3, як описано у файлі зняття регуляції США 95-228-01p (US) - Об'єкт MS6, як описано у файлі зняття регуляції США 98-349-01p (US) Рис (Oryza sativa): - Об'єкт LLRice62, як описано в досьє зняття регуляції США 98-329-01p або WO 2001/083818 - Об'єкт LLRICE601 як описано в досьє зняття регуляції США 06-234-01p або заявці на патент США 2008289060 Соєві боби (Glycine max): - Об'єкти W62 і W98, описані в регуляторному файлі 96-068-01p (US). Трансгенні рослини, що містять ці об'єкти, відповідно містять послідовність розпізнавання для описаних тут мегануклеаз і є придатними суб'єктами для способів за цим винаходом. Більше того, експресований рослинами ген bar загалом використовується як селектований маркер, і були створені численні трансгенні рослини, які також є придатними суб'єктами для способів за цим винаходом. Відповідно, в одному варіанті здійснення даний винахід стосується способу введення молекули чужорідної ДНК в попередньо визначений або попередньо вибраний сайт в (ядерному) геномі трансгенної рослинної клітини, який включає наступні етапи: а. індукування двонитчастого розриву ДНК в попередньо визначеному сайті; b. введення молекули чужорідної ДНК у вказану рослинну клітину; і с. відбору рослинної клітини, в якій чужорідна ДНК є введеною в попередньо визначений сайт; де попередньо визначений сайт є нуклеотидною послідовністю, відмінною від сайту розпізнавання для мегануклеази, що трапляється у природі, і є нуклеотидною послідовністю, що звичайно вводиться як частина трансгену в трансгенній рослині, і де двонитчастий розрив ДНК індукується введенням неприродної однонитчастої мегануклеази або пари мономерних одиниць неприродної мегануклеази, яка розпізнає або які сумісно розпізнають попередньо визначений сайт і яка індукує або які індукують двонитчастий розрив. Як він тут використовується, вираз "нуклеотидна послідовність, що звичайно вводиться як частина трансгену в рослинах" стосується нуклеотидної послідовності ділянки ДНК, яка раніше вже використовувалась як елемент химерного гену, введеного в рослини, завдяки чому трансгенні рослини є легко доступними і, зокрема, завдяки чому трансгенні рослини були, є або будуть комерціалізованими, вже отримали офіційні дозволи і є всім доступними. Існують кілька баз даних, які підсумовують і надають інформацію стосовно заявок на отримання офіційного дозволу, включаючи базу даних генетично модифікованих сільськогосподарських культур Центру оцінки ризику для оточуючого середовища, до якої можна звертатись в режимі он-лайн (http://www.cera-gmc.org/?action=gm_crop_database&), або підсумковий перелік звернень щодо надання нерегульованого статусу або звернень, що розглядаються APHIS (Служба інспекції здоров'я тварин і рослин), до якого теж можна звертатись в режимі он-лайн (http://www.aphis.usda.gov/brs/not_reg.html). 5 UA 115961 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Ділянки ДНК, які звичайно вводяться як частина трансгену в рослини, містять ділянки промотору, такого як промотор 35S транскрипту CaMV 35S (Odell et al. (1985), Nature 313: 810812); промотор FMV 35S (Richins R.D., Scholthof H.B., Shepherd R.J. (1987) Sequence of the figwort mosaic virus (caulimovirus group). Nucleic Acids Research 15: 8451-8466); промотор малої субодиниці гену Rubisco Arabidopsis thaliana (Krebbers E., Seurinck J., Herdies L., Cashmore A. R., Timko M. P. (1988). Four genes in two diverged subfamilies encode the ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase small subunit polypeptides of Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology, 11, 745759); промотор вірусу мозаїки прожилок виноградного листа Casava (Verdaguer et al. (1996) Plant Mol. Biol. 31: 1129 або Verdaguer et al. (1998) Plant Mol. Biol. 37: 1055); промотор Actin2 від Arabidopsis (An Y.Q., McDowell J.M., Huang S., McKinney E.C., Chambliss S., Meagher R.B. (1996) Strong, constitutive expression of the Arabidopsis ACT2/ACT8 actin subclass in vegetative tissues. The Plant Journal 10: 107-121) or rice (McElroy D., Zhang W., Cao J., Wu R. (1990) Isolation of an efficient actin promoter for use in rice transfomation. The Plant Cell 2: 163-171); промотор гістон H3 або промотор гістон H4 (Chabouté M, Chaubet N, Philipps G, Ehling M and Gigot C (1987) Genomic organization and nucleotide sequences of two histone H3 and two histone H4 genes of Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol. 8: 179-191); промотор гену убіквітин-1 кукурудзи (Zea mays) (Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 675); 5' UTR leader sequences such as the cab22L leader (Harpster M, Townsend J, Jones J, Bedbrook J and Dunsmuir P.(1988) Relative strengths of the 35S cauliflower mosaic virus, 1', 2' and nopaline synthase promoters in transformed tobacco, sugarbeet and oilseed rape callus tissue. Mol Gen Genet. 212:182-190); or 5' tev (Carrington J and Freed D (1990) Capindependent enhancement of translation by a plant potyvirus 5' nontranslated region. J Virol 64(4): 1590-1597); ген нопалін синтази 3' кінця (Depicker A., Stachel S., Dhaese P., Zambryski P., Goodman H.M. (1982). Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence. Journal of Molecular and Applied Genetics 1, 561-573); ген октопін синтази 3' кінця (De Greve H., Dhaese P., Seurinck J., Lemmers M., Van Montagu M., Schell J. (1982). Nucleotide sequence and transcript map of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid-encoded octopine synthase gene. Journal of Molecular and Applied Genetics, 1, 499-511); термінатор CaMV35S (Sanfaçon et al. (1991) Genes Dev. 5: 141), ділянка термінації транскрипції і поліаденілювання гену 7 вектору октопінового типу T-ДНК (D'Haese et al., 1983, The EMBO Journal, 2, 419-426), і селектовані маркери, такі як bar (Thompson, C., Movva, R., Tizard, R., Crameri, R., Davies, J., Lauwereys, M. ans Botterman, J. (1987) Characterization of the herbicide-resistance gene bar from Streptomyces hygroscopicus. The EMBO Journal 6: 2519-2523 (Accession X05822)); pat (Wohlleben, W., Arnold, W., Broer, I., Hillemann, D., Strauch, E. and Puhler, A. Nucleotide sequence of the phosphinothricin Nacetyltransferase gene from Streptomyces viridochromogenes Tu494 and its expression in Nicotiana tabacum. Gene 70 (1), 25-37 (1988)); 2mepsps (sequence 4 from patent US6566587 or EMBL number AR337832); CP4 (Padgette S.R., Re D., Barry G., Eichholtz D., Delannay X., Fuchs R.L., Kishore G.M., Fraley R.T. (1996). New weed control opportunities: development of soybeans with a Roundup Ready gene. In Herbicide-Resistant Crops: Agricultural, Environmental, Econ…., neo Accession V00618; Beck et al. (1982) Gene 19(3) p327-336); або hpt (Kaster et al., (1983), NAR 11, 6895-6911). Кращою ділянкою ДНК в контексті даного винаходу є нуклеотидна послідовність кодуючої ділянки гену bar, як вже зазначалось. Описані тут реконструйовані мегануклеази базуються на природній мегануклеазі I-CreI, яка використовується в якості клітинного каркасу. I-CreI - це хомінг-ендонуклеаза, знайдена в хлоропластах Chlamydomonas rheinhardti (Thompson et al. 1992, Gene 119, 247-251). Ця ендонуклеаза є гомодимером, який розпізнає псевдопаліндромний, з 22 пар основ сайт ДНК в гені 23SrРНК і створює двонитчастий розрив ДНК, який використовується для введення інтрону. I-CreI є представницею групи ендонуклеаз, що несуть єдиний мотив LAGLIDADG. Ферменти LAGLIDADG містять одну або дві копії цього консенсусного мотиву. Ферменти з єдиним мотивом, такі як I-CreI, функціонують як гомодимери, тоді як ферменти з подвійним мотивом є мономерами з двома окремими доменами. Відповідно, при реконструюванні мегануклеаз на каркасі I-CreI для того, щоб вони розпізнавали нуклеотидну послідовність з 22 пар основ, що становить інтерес, створюють дві мономерні одиниці, кожна з яких розпізнає частину сайту розпізнавання з 22 пар основ, що в сукупності є необхідним для того, щоб індукувати двонитчастий розрив у сайті розпізнавання з 22 пар основ (WO 2007/047859). Такої спільної дії можна досягти, зв'язавши ці дві мономерні одиниці в єдину однонитчасту мегануклеазу, або шляхом стимулювання утворення гетеродимерів, як описано, наприклад, в WO 2007/047859. Амінокислотна послідовність природного мономеру I-CreI пропонується як послідовність SEQ ID №: 16. Для реконструювання мономерних одиниць I-CreI у такий спосіб, щоб їх 6 UA 115961 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 гетеродимери розпізнавали нуклеотидну послідовність SEQ ID №: 1 та/або 2, наступні амінокислоти мають бути присутніми в названих далі позиціях: 1. в одиниці 1 мегануклеази: a. S в позиції 32; b. Y в позиції 33; c. E в позиції 38; d. R в позиції 40; e. K в позиції 66; f. Q в позиції 80; g. T в позиції 42; h. R в позиції 77; i. R в позиції 68; j. R в позиції 70; k. Q в позиції 44; l. I в позиції 24; m. S в позиції 26; n. S в позиції 28; o. R в позиції 30. 2. в одиниці 2 мегануклеази: p. R в позиції 70; q. T в позиції 44; r. I в позиції 24; s. S в позиції 26; t. S в позиції 28; u. N в позиції 30; v. S в позиції 32; w. R в позиції 33; x. Q в позиції 38; y. Q в позиції 80; z. R в позиції 40; aa. K в позиції 66; bb. T в позиції 42; cc. R в позиції 77; dd. R в позиції 68. Схематично їх представлено на Фіг. 1. Реконструйований фермент, що викликає двонитчастий розрив, може містити, хоча і не обов'язково, клітинний сигнал внутрішньоядерної локалізації (NLS), такий як NLS великого Тантигену SV40 [Raikhel, Plant Physiol. 100: 1627-1632 (1992) і наведені посилання] [Kalderon et al. Cell 39: 499-509 (1984)]. Цей клітинний сигнал внутрішньоядерної локалізації може локалізуватись будь-де в білку, але звичайно розміщується на його N-термінальному кінці. Клітинний сигнал внутрішньоядерної локалізації може заміщувати одну або більше амінокислот ферменту, що індукує двонитчастий розрив. Слід зазначити, що, коли реконструйована мегануклеаза оснащується NLS на N-кінці білка, таким як NLS SV40 з 10 або 12 амінокислот, позиції амінокислот повинні відповідно зміститись (збільшитись). Подібно до цього, у випадку, коли дві мономерні одиниці з'єднуються в однонитчасту мегануклеазу, позиція другої одиниці також буде зміщуватись. Відповідні амінокислотні позиції по відношенню до амінокислотної послідовності I-CreI можна також ідентифікувати шляхом визначення оптимального зіставлення, як буде описано далі. Має бути очевидним, що в однонитчастій реконструйованій мегануклеазі порядок одиниць не має значення, тобто або одиниці 1 і 2 дійсно трапляються в такому порядку в єдиному ланцюгу амінокислот, або одиниця 2 передує одиниці 1 в єдиному ланцюгу амінокислот - це не має значення для того, щоб ці дві одиниці в сукупності були здатними розпізнавати цільову послідовність. Реконструйовані мегануклеази, придатні для використання за цим винаходом, можуть містити амінокислотну послідовність, як її представлено в SEQ ID №№: 5 і 6 (мономерні одиниці, які можуть розщеплювати сайт розпізнавання як гетеродимер), або можуть містити амінокислотну послідовність, як її представлено в SEQ ID №: 18 (однонитчаста мегануклеаза, що містить дві одиниці, представлені амінокислотами від 1 до 167 і від 208 до 362, відповідно, зв'язані лінкерною послідовністю, представленою амінокислотами від 168 до 205), або можуть містити амінокислотну послідовність, яка відповідає послідовності SEQ ID №: 18 від 1 до 167 і від 206 до 362 (відповідно, одиниці 1 і 2 однонитчастої мегануклеази без лінкеру). 7 UA 115961 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Для зручності, реконструйовані мегануклеази можна отримувати шляхом експресії експресованих рослиною рекомбінантних генів, які кодують такі мегануклеази. З цією метою ділянку ДНК, що містить нуклеотидну послідовність, кодуючу реконструйовану мегануклеазу або мономерну одиницю мегануклеази, можна функціонально зв'язати з експресованим рослиною промотором і ділянкою ДНК, задіяною в термінації транскрипції і поліаденілюванні і введеною в рослину або рослинні клітини. Рекомбінантні гени, кодуючі реконструйовані мегануклеази, можуть вводитись тимчасово або стабільно. Для цілей даного винаходу термін "промотор, функціональний в рослині" і "експресований рослиною промотор" означають промотор, що є здатним запускати транскрипцію в рослині, рослинній тканині, органі рослини, частині рослини або рослинній клітині. Це включає будь-який промотор рослинного походження, але також і будь-який промотор нерослинного походження, що є здатним спрямовувати транскрипцію в рослинній клітині. Промотори, якими можна скористатись в цьому відношенні, є конститутивними промоторами, такими як промотор транскрипту 35S мозаїчного вірусу цвітної капусти (Hapster et al.,1988, Mol. Gen. Genet. 212: 182-190), промотор 19S CaMV (патент США № 5,352,605; WO 84/02913; Benfey et al., 1989, EMBO J. 8:2195-2202), промотор № 4 або № 7 вірусу підземної конюшини (WO 96/06932), промотор малої субодиниці Rubisco (патент США № 4,962,028), убіквітиновий промотор (Holtorf et al., 1995, Plant Mol. Biol. 29:637-649), промотори гену Т-ДНК, такі як промотори октопін синтази (OCS) і нопалін синтази (NOS) від Agrobacterium, та інші промотори генів, конститутивна експресія яких в рослинах є відомою спеціалістам в цій галузі. Додатковими промоторами, якими можна скористатись в цьому відношенні, є специфічні до тканини або специфічні до органу промотори, переважно промотори, специфічні до насіння, такі як альбуміновий промотор 2S (Joseffson et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:12196-12201), фазеоліновий промотор (патент США № 5,504, 200; Bustos et al., 1989, Plant Cell 1.(9):839-53), легуміновий промотор (Shirsat et al., 1989, Mol. Gen. Genet. 215(2):326-331), промотор "невідомого насіннєвого білка" (USP) (Baumlein et al., 1991, Mol. Gen. Genet. 225(3):459-67), напіновий промотор патент США № 5,608,152; Stalberg et al., 1996, Planta 199:515-519), олеозиновий промотор Arabidopsis (WO 98/45461), промотор Bce4 Brassica (WO 91/13980) та інші промотори генів, специфічна до насіння експресія яких в рослинах є відомою спеціалістам в цій галузі. Іншими промоторами, які можуть бути використані, є специфічні до тканини або специфічні до органу промотори, такі як промотори, специфічні до органу примордій (An et al., 1996, Plant Cell 8: 15-30), промотори, специфічні до стебла (Keller et al., 1988, EMBO J. 7(12): 3625-3633), промотори, специфічні до листя (Hudspeth et al., 1989, Plant Mol. Biol. 12: 579-589), промотори, специфічні до мезофілу (такі як промотори Rubisco, що індукують ся світлом), промотори, специфічні до корінців (Keller et al., 1989, Genes Dev. 3: 1639-1646), промотори, специфічні до клубнів (Keil et al., 1989, EMBO J. 8(5): 1323-1330), промотори, специфічні до судинної тканини (Peleman et al., 1989, Gene 84: 359-369), промотори, селективні у відношенні тичинки (WO 89/10396, WO 92/13956), промотори, специфічні до зони розтріскування (WO 97/13865), і т.п. Нуклеотидні послідовності, кодуючі реконструйовані мегануклеази, придатні для використання за цим винаходом, можуть містити нуклеотидну послідовність SEQ ID №: 4 від нуклеотидної позиції 2004 до нуклеотидної позиції 2525 або 2522 або нуклеотидну послідовність SEQ ID №: 4 від нуклеотидної позиції 4885 до нуклеотидної позиції 5405 або 5403. Для полегшення клонування і здійснення інших методик з рекомбінантною ДНК може бути доцільним включити інтрон, функціональний в рослинах, в ділянку, кодуючу мегануклеазу, зокрема в однонитчасту мегануклеазу. Такий інтрон може, наприклад, містити нуклеотидну послідовність SEQ ID №: 17 від нуклеотидної позиції 1606 до нуклеотидної позиції 1794. Ділянку ДНК, кодуючу реконструйовану мегануклеазу, можна оптимізувати для експресії в рослинах шляхом адаптації вмісту GC (гуаніну і цитозину), використання кодонів, елімінації небажаних нуклеотидних послідовностей. Кодуючу ділянку можна додатково оптимізувати для експресії в рослинах, і синтетична кодуюча ділянка може мати нуклеотидну послідовність, яку було створено для задоволення наступних критеріїв: а) нуклеотидна послідовність кодує функціональну реконструйовану хомінг-ендонуклеазу, як тут описано; b) нуклеотидна послідовність має вміст GC від близько 50 % до близько 60 %; с) нуклеотидна послідовність не являє собою нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, яка складається з GATAAT, TATAAA, AATATA, AATATT, GATAAA, AATGAA, AATAAG, AATAAA, AATAAT, AACCAA, ATATAA, AATCAA, ATACTA, ATAAAA, ATGAAA, AAGCAT, ATTAAT, ATACAT, AAAATA, ATTAAA, AATTAA, AATACA і CATAAA; 8 UA 115961 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 d) нуклеотид не містить нуклеотидної послідовності, вибраної з групи, яка складається з CCAAT, ATTGG, GCAAT і ATTGC; е) нуклеотидна послідовність не являє собою нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, яка складається з ATTTA, AAGGT, AGGTA, GGTA або GCAGG; f) нуклеотидна послідовність не містить GC видовження, що складається з 7 послідовних нуклеотидів, вибраних з групи G або C; g) нуклеотидна послідовність не містить АТ видовження, що складається з 5 послідовних нуклеотидів, вибраних з групи А або Т; і h) нуклеотидна послідовність не містить кодонів, кодуючих Leu, Ile, Val, Ser, Pro, Thr, Ala, які містять дуплети TA або CG в позиціях 2 і 3 (тобто, нуклеотидна послідовність не містить кодонів TTA, CTA, ATA, GTA, TCG, CCG, ACG і GCG). Приклад такої оптимізованої послідовності є представленим SEQ ID №: 17 від нуклеотидної позиції 1267 до 1605 і від нуклеотидної позиції 1795 до 2541 (де нуклеотидна послідовність, кодуюча лінкер, присутній між двома одиницями мегануклеази, представлена нуклеотидами від 1957 до 2070). Має бути зрозумілим також, що терміни, використовувані для опису способу, такі як "введення фрагмента ДНК", а також "регенерація рослини з клітини", не означають, що такий фрагмент ДНК обов'язково має вводитись методами трансформації. Дійсно, спеціалісту в цій галузі має бути відразу очевидно, що молекула ДНК, яка становить інтерес, може вводитись також методами виведення або схрещування від однієї рослини іншій. Однак буде ясно, що молекула ДНК, яка становить інтерес, може бути введеною в рослинні клітини будь-яким методом, відомим в цій галузі, включаючи опосередковану Agrobacterium трансформацію, але також методами прямого перенесення ДНК. Трансформуюча молекула ДНК може бути перенесеною в рослинні клітини з використанням будь-якого звичайного методу, включаючи, але не обмежуючись ним, метод прямого перенесення ДНК. Як він тут використовується, вираз "пряме перенесення ДНК" означає будь-який метод введення ДНК в рослинні клітини, який не передбачає використання природного Agrobacterium spp. і який є здатним забезпечити введення ДНК в рослинні клітини. Це включає методи, добре відомі в цій галузі, такі як введення ДНК в протопласти за допомогою електропорації, введення ДНК за допомогою електропорації в інтактні рослинні клітини або частково зруйновані тканини або рослинні клітини, введення ДНК в протопласти під дією агентів, таких як PEG (поліетилен гліколь) і т.п., застосування силіконових ниткоподібних кристалів і бомбардування мікрочастками, покритими ДНК (балістична трансфекція). Здатність індукувати двонитчастий розрив у попередньо вибраному сайті відкриває кілька потенційних застосувань. Чужорідну ДНК, що становить інтерес, можна вводити в попередньо вибраний сайт шляхом гомологічної рекомбінації або в процесі не гомологічного кінцевого приєднання. Двонитчастим розривом можна скористатись також для індукування утворення малих делецій або вставок в попередньо вибраному сайті, тим самим потенційно інактивуючи химерний ген, що містить нуклеотидну послідовність цього попередньо вибраного сайту. Двонитчастий розрив у попередньо вибраному сайті буде також полегшувати заміну ділянки ДНК поблизу цього сайту на ділянку ДНК, що становить інтерес, наприклад як описано в WO 06/105946, WO 08/037436 або WO 08/148559. Щоб ввести чужорідну ДНК в попередньо вибраний сайт за допомогою гомологічної рекомбінації, ця чужорідна ДНК має міститись в репаративній ДНК, де чужорідна ДНК фланкується щонайменше однією фланкуючою ділянкою ДНК, що має нуклеотидну послідовність, подібну до нуклеотидної послідовності, розміщеної вище або нижче попередньо вибраного сайту. Репаративна ДНК може містити чужорідну ДНК, вставленою між двома фланкуючими ділянками ДНК - вище і нижче чужорідної ДНК, які є подібними до нуклеотидної послідовності ділянки ДНК, розміщеної вище або нижче попередньо вибраного сайту. Як варіант, чужорідна ДНК може бути інтегрованою як така, тобто без фланкуючих послідовностей з гомологією до ділянки біля попередньо вибраного, цільового сайту (без будь-якої додаткової ДНК), для інтеграції за допомогою не гомологічного кінцевого приєднання. Як він тут використовується, вираз "фланкуюча ділянка ДНК" - це ДНК з нуклеотидними послідовностями, що мають гомологію з ділянками ДНК, розміщеними відповідно вище або нижче цільової послідовності ДНК або попередньо вибраного сайту. Це дозволяє краще контролювати вставку чужорідної ДНК або молекули ДНК, що становить інтерес. Дійсно, інтеграція за допомогою гомологічної рекомбінації забезпечує точне приєднання фрагмента чужорідної ДНК до ядерного геному рослини до рівня нуклеотиду. Фланкуючі ділянки ДНК можуть мати різну довжину, але щонайменше мають біля 10 нуклеотидів у довжину. Однак фланкуюча ділянка може бути настільки довгою, наскільки це 9 UA 115961 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 практично можливо (наприклад, приблизно до 100-150 кб, так як повні бактеріальні штучні хромосоми (ВАС)). Переважно, фланкуюча ділянка буде мати від приблизно 50 пар основ до приблизно 2000 пар основ. Більше того, ділянки, фланкуючі чужорідну ДНК, що становить інтерес, не обов'язково повинні бути ідентичними ділянкам ДНК, фланкуючим попередньо вибраний сайт, і можуть мати ідентичність послідовностей від приблизно 80 % до приблизно 100 %, переважно від приблизно 95 % до приблизно 100 %, з ділянками ДНК, фланкуючими попередньо вибраний сайт. Чим довшою є фланкуюча ділянка, тим менш суворими є вимоги до гомології. Більше того, краще, щоб ідентичність послідовностей була найвищою, практично можливою поблизу місця розміщення точної вставки чужорідної ДНК. Крім того, для здійснення заміни цільової послідовності ДНК без зміни послідовності ДНК суміжних послідовностей ДНК, фланкуючі послідовності ДНК переважно мають бути ідентичними ділянкам ДНК, фланкуючим попередньо вибраний сайт. Більше того, ділянки, фланкуючі чужорідну ДНК, що становить інтерес, не обов'язково повинні мати гомологію з ділянками, безпосередньо фланкуючими попередньо вибраний сайт, але можуть мати гомологію з ділянкою ДНК ядерного геному, більш віддаленою від попередньо вибраного сайту. Тоді вставка чужорідної ДНК буде мати своїм результатом видалення цільової ДНК між попередньо вибраним місцем вставки і ділянкою гомології ДНК. Іншими словами, цільова ДНК, розміщена між ділянками гомології, буде заміщеною на чужорідну ДНК, що становить інтерес. Отже, шляхом вибору відповідної конфігурації чужорідної ДНК для репарації двонитчастого розриву ДНК, введенням молекули чужорідної ДНК у відповідності до методів за цим винаходом, на додачу до вставок, також можна здійснювати цільові заміни або цільові делеції геномної ділянки, розміщеної між ділянками гомології. Чужорідна ДНК, що вставляється, може містити також селектований або отриманий скринінгом маркер, який може видалятись або не видалятись після вставки. "Селектований або отриманий скринінгом маркер", як цей вираз тут використовується, має звичайне в цій галузі значення і включає, не обмежуючись ними, експресовану рослинами фосфінотрицин ацетилтрансферазу, неоміцинову фосфотрансферазу, гліфосат оксидазу, стійкий до гліфосату фермент EPSP, ген нітрілази, мутантний ген ацетолактат синтази або ацетогідроксикислої синтази, -глюкоронідазу (GUS), гени R-локусу, зелений флуоресцентний білок і т.п. Відбір рослинної клітини або рослини, в які за допомогою гомологічної рекомбінації через фланкуючі ділянки ДНК було введено селектований або отриманий скринінгом маркер і решту молекули чужорідної ДНК, можна здійснити, наприклад, шляхом скринінгу на відсутність послідовностей, наявних в трансформуючій ДНК, але розміщених поза фланкуючих ділянок ДНК. Дійсно, присутність послідовностей з трансформуючої ДНК поза фланкуючих ділянок ДНК буде вказувати на те, що походження трансформованих рослинних клітин пов'язане з випадковою вставкою ДНК. З цією метою селектовані або отримані скринінгом маркери можуть включатись в молекулу трансформуючої ДНК поза фланкуючих ділянок ДНК, що потім можна використати для ідентифікації тих рослинних клітин, які не мають селектованих або отриманих скринінгом маркерів, розміщених ззовні трансформуючої ДНК, і які можуть виникнути внаслідок гомологічної рекомбінації через фланкуючі ділянки ДНК. Як варіант, молекула трансформуючої ДНК може містити селектовані маркери поза фланкуючих ділянок ДНК, що дозволяє здійснити відбір за відсутністю таких генів (негативних генів селектованих маркерів). Має бути зрозумілим, що способи за цим винаходом дозволяють вставляти будь-яку ДНК, що становить інтерес, включаючи ДНК, що містить нуклеотидну послідовність з конкретною сигнатурою нуклеотидної послідовності, наприклад для наступної ідентифікації. ДНК, що становить інтерес, може бути також одним або більше експресованими рослиною генами, включаючи, без обмеження ними, ген стійкості до гербіцидів, ген стійкості до комах, ген стійкості до хвороб, ген стійкості до абіотичного стресу, фермент, задіяний в біосинтезі олії або біосинтезі вуглеводів, фермент, задіяний в міцності та/або довжині волокон, фермент, задіяний в біосинтезі вторинних метаболітів. Гени стійкості до гербіцидів містять ген, кодуючий фермент 5-енолпірувілшикимате-3фосфат синтазу (EPSPS). Прикладами таких генів EPSPS є ген AroA (мутант CT7) бактерії Salmonella typhimurium (Comai et al., 1983, Science 221, 370-371), ген CP4 бактерії Agrobacterium sp. (Barry et al., 1992, Curr. Topics Plant Physiol. 7, 139-145), гени, кодуючі EPSPS петунії (Shah et al., 1986, Science 233, 478-481), EPSPS томату (Gasser et al., 1988, J. Biol. Chem. 263, 42804289) або EPSPS коракану (WO 01/66704). Ним може бути також мутований EPSPS, як описано, наприклад, в EP 0837944, WO 00/66746, WO 00/66747 або WO 02/26995. Рослини, стійкі до гліфосату, також можуть отримуватись шляхом експресії гену, який кодує фермент гліфосат оксидо-редуктазу, як описано в патентах США №№: 5,776,760 і 5,463,175. Рослини, стійкі до 10 UA 115961 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 гліфосату, також можуть отримуватись шляхом експресії гену, який кодує фермент гліфосат ацетилтрансферазу, як описано, наприклад, в WO 02/36782, WO 03/092360, WO 05/012515 і WO 07/024782. Рослини, стійкі до гліфосату, також можуть отримуватись шляхом відбору рослин, що містять природні мутації вищезгаданих генів, як описано, наприклад, в WO 01/024615 або WO 03/013226. Гени EPSPS, які надають стійкості до гліфосату, є описаними, наприклад, в заявках на патенти США №№: 11/517,991, 10/739,610, 12/139,408, 12/352,532, 11/312,866, 11/315,678, 12/421,292, 11/400,598, 11/651,752, 11/681,285, 11/605,824, 12/468,205, 11/760,570, 11/762,526, 11/769,327, 11/769,255, 11/943801 або 12/362,774. Інші гени, які надають стійкості до гліфосату, є описаними, наприклад, в заявках на патенти США №№: 11/588,811, 11/185,342, 12/364,724, 11/185,560 або 12/423,926. Інші гени стійкості до гербіцидів можуть кодувати фермент, який забезпечує детоксикацію гербіциду, або мутантний фермент глютамін синтази, що є стійким до пригнічення, наприклад такий, як описаний в заявці на патент США №: 11/760,602. Одним таким ефективним ферментом для детоксикації є фермент, кодуючий фосфінотрицин ацетилтрансферазу (такий як білок bar або pat від видів Streptomyces). Фосфінотрицин ацетилтрансферази є описаними, наприклад, в патентах США №№: 5,561,236; 5,648,477; 5,646,024; 5,273,894; 5,637,489; 5,276,268; 5,739,082; 5,908,810 і 7,112,665. Гени стійкості до гербіцидів можуть забезпечити стійкість також до гербіцидів, які пригнічують фермент гідроксифенілпіруватдиоксигеназу (HPPD). Гідроксифенілпіруватдиоксигенази - це ферменти, що каталізують реакцію, в якій пара-гідроксифенілпіруват (НРР) трансформується на гомогентізат. Рослини, стійкі до HPPD-інгібіторів, можуть трансформуватись за допомогою гену, кодуючого природний резистентний фермент HPPD, або гену, кодуючого мутований або химерний фермент HPPD, як описано в WO 96/38567, WO 99/24585, а також WO 99/24586, WO 2009/144079, WO 2002/046387 або US 6,768,044. Стійкості до HPPD-інгібіторів можна досягти також шляхом трансформування рослин генами, кодуючими певні ферменти, які забезпечують утворення гомогентизату не дивлячись на пригнічення нативного ферменту HPPD HPPD-інгібітором. Такі рослини і гени є описаними у WO 99/34008 і WO 02/36787. Стійкість рослин до HPPD-інгібіторів можна підвищити також шляхом трансформування рослин геном, кодуючим фермент, що має активність префенат дезгідрогенази (PDH), на додачу до гену, кодуючого фермент, стійкий до HPPD, як описано в WO 2004/024928. Крім того, рослини можуть отримати більшу стійкість до гербіцидів HPPDінгібіторів, якщо до їх геному додати ген, кодуючий фермент, здатний метаболізувати або розкладати HPPD-інгібітори, такий як ферменти CYP450, показані в WO 2007/103567 і WO 2008/150473. Ще інші гени стійкості до гербіцидів кодують варіантні ферменти ALS (відомі також як ацетогідроксикисла синтаза, AHAS), як описано, наприклад, у Tranel і Wright (2002, Weed Science 50:700-712), а також в патентах США №№: 5,605,011, 5,378,824, 5,141,870 і 5,013,659. Отримання рослин, стійких до сульфонілсечовини, і рослин, стійких до імідазолінону, є описаним в патентах США №№: 5,605,011; 5,013,659; 5,141,870; 5,767,361; 5,731,180; 5,304,732; 4,761,373; 5,331,107; 5,928,937 і 5,378,824; а також в міжнародній публікації WO 96/33270. Інші гени стійкості до імідазолінону є описаними також, наприклад, в WO 2004/040012, WO 2004/106529, WO 2005/020673, WO 2005/093093, WO 2006/007373, WO 2006/015376, WO 2006/024351 і WO 2006/060634. Додаткові гени стійкості до сульфонілсечовини і імідазолінону є описаними, наприклад, в WO 07/024782 і в заявці на патент США №: 61/288958. Ген стійкості до пошкоджень комахами може містити кодуючу послідовність, яка кодує: 1) інсектицидний кристалічний білок від Bacillus thuringiensis або його інсектицидну частину, такий як інсектицидні кристалічні білки, перелічені Crickmore et al. (1998, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 62: 807-813), поновлені Crickmore et al. (2005) в номенклатурі токсинів Bacillus thuringiensis, доступній он-лайн: http://www.lifesci.sussex.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/), або їх інсектицидні частини, наприклад, білки класів Cry Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1B, Cry1C, Cry1D, Cry1F, Cry2Ab, Cry3Aa, або Cry3Bb або їх інсектицидні частини (наприклад, EP 1999141 і WO 2007/107302), або такі білки, кодовані синтетичними генами, як, наприклад, описані в заявці на патент США №: 12/249,016; або 2) кристалічний білок від Bacillus thuringiensis або його частину, який є інсектицидним в присутності другого іншого кристалічного білка від Bacillus thuringiensis або його частини, такий як бінарний токсин, що складається з кристалічних білків Cry34 і Cry35 (Moellenbeck et al. 2001, Nat. Biotechnol. 19: 668-72; Schnepf et al. 2006, Applied Environm. Microbiol. 71, 1765-1774), або бінарний токсин, що складається з білків Cry1A або Cry1F і білків Cry2Aa або Cry2Ab або Cry2Ae (заявка на патент США №: 12/214,022 і EP 08010791.5); або 11 UA 115961 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3) гібридний інсектицидний білок, який містить частини різних інсектицидних кристалічних білків від Bacillus thuringiensis, такий як гібрид білків 1), описаних вище, або гібрид білків 2), описаних вище, наприклад білок Cry1A.105, отриманий шляхом зміни генетичного матеріалу кукурудзи MON89034 (WO 2007/027777); або 4) будь-який білок від 1) до 3), описаних вище, в якому певні, зокрема від 1 до 10, амінокислоти були заміщені іншою амінокислотою, щоб отримати підвищену інсектицидну активність по відношенню до цільових видів комах, та/або розширити діапазон цільових видів комах, які піддаються його дії, та/або внаслідок змін, введених в кодуючу ДНК при клонуванні або трансформації, такий як білок Cry3Bb1, отриманий шляхом змін генетичного матеріалу кукурудзи MON863 або MON88017, або білок Cry3A, отриманий шляхом зміни генетичного матеріалу кукурудзи MIR604; або 5) секретований білок від Bacillus thuringiensis або Bacillus cereus або його інсектицидна частина, такий як вегетативні інсектицидні білки (VIP), перелічені в: http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html, наприклад білки з класу білків VIP3Aa; або 6) секретований білок від Bacillus thuringiensis або Bacillus cereus, що є інсектицидним в присутності другого секретованого білка від Bacillus thuringiensis або Bacillus cereus, такий як бінарний токсин, який складається з білків VIP1A і VIP2A (WO 94/21795); або 7) гібридний інсектицидний білок, що містить частини від різних секретованих білків від Bacillus thuringiensis або Bacillus cereus, такий як гібрид білків 1), описаних вище, або гібрид білків 2), описаних вище; або 8) будь-який білок від 5) до 7), описаних вище, в якому певні, зокрема від 1 до 10, амінокислоти були заміщені іншою амінокислотою, щоб отримати підвищену інсектицидну активність по відношенню до цільових видів комах, та/або розширити діапазон цільових видів комах, які піддаються його дії, та/або внаслідок змін, введенихв кодуючу ДНК при клонуванні або трансформації (все ще кодуючу інсектицидний білок), такий як білок VIP3Aa, отриманий шляхом зміни генетичного матеріалу бавовнику COT102; або 9) секретований білок від Bacillus thuringiensis або Bacillus cereus, що є інсектицидним в присутності кристалічного білка від Bacillus thuringiensis, такий як бінарний токсин, який складається з VIP3 і Cry1A або Cry1F (заявки на патент США №№: 61/126083 і 61/195019), або бінарний токсин, який складається з білка VIP3 і білків Cry2Aa або Cry2Ab або Cry2Ae (заявка на патент США №: 12/214,022 і EP 08010791.5); 10) вищеописаний білок 9), в якому певні, зокрема від 1 до 10, амінокислоти були заміщені іншою амінокислотою, щоб отримати підвищену інсектицидну активність по відношенню до цільових видів комах, та/або розширити діапазон цільових видів комах, які піддаються його дії, та/або внаслідок змін, введених в кодуючу ДНК при клонуванні або трансформації (все ще кодуючу інсектицидний білок). "Резистентний до комах" ген, як цей вираз тут використовується, додатково містить трансгени, що містять послідовність, яка після експресії продукує двонитчасту РНК, яка після поїдання комахою-шкідником рослин пригнічує ріст цієї комахи-шкідника, як описано, наприклад, в WO 2007/080126, WO 2006/129204, WO 2007/074405, WO 2007/080127 і WO 2007/035650. Гени стійкості до абіотичного стресу містять: 1) трансген, здатний зменшувати експресію та/або активність гену полі(АДФ-рибози) полімерази (PARP) в рослинних клітинах або рослинах, як описано в WO 00/04173, WO/2006/045633, EP 04077984.5 або EP 06009836.5. 2) трансген, здатний зменшувати експресію та/або активність генів, кодуючих PARP рослин або рослинних клітин, як описано, наприклад, в WO 2004/090140. 3) трансген, кодуючий функціональний в рослині фермент реутилізаційного шляху синтезу нікотинамід аденін динуклеотиду, який містить нікотинамідазу, нікотинат фосфорибозилтрансферазу, мононуклеотид нікотинової кислоти аденіл трансферазу, нікотинамід аденін динуклеотид синтазу або нікотин амід фосфорибозилтрансферазу, як описано, наприклад, в EP 04077624.7, WO 2006/133827, PCT/EP07/002433, EP 1999263 або WO 2007/107326. Ферменти, задіяні в біосинтезі вуглеводів, містять ті, що описані, наприклад, в EP 0571427, WO 95/04826, EP 0719338, WO 96/15248, WO 96/19581, WO 96/27674, WO 97/11188, WO 97/26362, WO 97/32985, WO 97/42328, WO 97/44472, WO 97/45545, WO 98/27212, WO 98/40503, WO99/58688, WO 99/58690, WO 99/58654, WO 00/08184, WO 00/08185, WO 00/08175, WO 00/28052, WO 00/77229, WO 01/12782, WO 01/12826, WO 02/101059, WO 03/071860, WO 2004/056999, WO 2005/030942, WO 2005/030941, WO 2005/095632, WO 2005/095617, WO 2005/095619, WO 2005/095618, WO 2005/123927, WO 2006/018319, WO 2006/103107, WO 12 UA 115961 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2006/108702, WO 2007/009823, WO 00/22140, WO 2006/063862, WO 2006/072603, WO 02/034923, EP 06090134.5, EP 06090228.5, EP 06090227.7, EP 07090007.1, EP 07090009.7, WO 01/14569, WO 02/79410, WO 03/33540, WO 2004/078983, WO 01/19975, WO 95/26407, WO 96/34968, WO 98/20145, WO 99/12950, WO 99/66050, WO 99/53072, US 6,734,341, WO 00/11192, WO 98/22604, WO 98/32326, WO 01/98509, WO 01/98509, WO 2005/002359, US 5,824,790, US 6,013,861, WO 94/04693, WO 94/09144, WO 94/11520, WO 95/35026 або WO 97/20936, або ферменти, задіяні в продукції поліфруктози, зокрема інуліну і леван-типу, як описано в EP 0663956, WO 96/01904, WO 96/21023, WO 98/39460 і WO 99/24593, продукції альфа-1,4глюканів, як описано в WO 95/31553, US 2002031826, US 6,284,479, US 5,712,107, WO 97/47806, WO 97/47807, WO 97/47808 і WO 00/14249, продукції альфа-1,6 розгалужених альфа-1,4глюканів, як описано в WO 00/73422, продукції альтернату, як описано, наприклад, в WO 00/47727, WO 00/73422, EP 06077301.7, US 5,908,975 і EP 0728213, продукції гіалуронану, як описано, наприклад, в WO 2006/032538, WO 2007/039314, WO 2007/039315, WO 2007/039316, JP 2006304779 і WO 2005/012529. Даний винахід пропонує також спосіб введення делеції в попередньо визначеному або попередньо вибраному сайті в (ядерному) геномі трансгенної рослинної клітини, який включає етапи: а. індукування двонитчастого розриву ДНК в попередньо визначеному сайті; і b. відбору рослинної клітини, що має делецію у вказаному попередньо визначеному сайті; де попередньо визначений сайт є нуклеотидною послідовністю, відмінною від сайту розпізнавання для природної мегануклеази, і є нуклеотидною послідовністю, що звичайно вводиться як частина трансгену в трансгенну рослину, і де двонитчастий розрив ДНК індукується введенням неприродної однонитчастої мегануклеази або пари мономерних одиниць неприродної мегануклеази, яка розпізнає або які сукупно розпізнають попередньо визначений сайт і яка індукує або які індукують двонитчастий розрив. В одному варіанті здійснення цього винаходу пропонуються химерні гени, кодуючі реконструйовані мегануклеази, як тут описано, де такий химерний ген містить експресований рослиною промотор, функціонально зв'язаний з ділянкою ДНК, кодуючою білок, що містить амінокислотну послідовність, яка відповідає амінокислотній послідовності I-CreI, у вигляді каркасу, що містить S в позиції 32; Y в позиції 33; E в позиції 38; R в позиції 40; K в позиції 66; Q в позиції 80; T в позиції 42; R в позиції 77; R в позиції 68; R в позиції 70; Q в позиції 44; I в позиції 24; S в позиції 26; S в позиції 28 і R в позиції 30 або R в позиції 70; T в позиції 44; I в позиції 24; S в позиції 26; S в позиції 28; N в позиції 30; S в позиції 32; R в позиції 33; Q в позиції 38; Q в позиції 80; R в позиції 40; K в позиції 66; T в позиції 42; R в позиції 77 і R в позиції 68 (позиції по відношенню до амінокислотної послідовності I-CreI, які відповідають амінокислотним позиціям в реконструйованих мегануклеазах, можуть бути визначені шляхом зіставлення), такий як білок, що містить амінокислотну послідовність SEQ ID №: 5 або SEQ ID №: 6, або білок, що містить амінокислотну послідовність SEQ ID №: 18, або білок, що містить амінокислотну послідовність SEQ ID №: 18 від позиції 1 до 167 і амінокислотну послідовність SEQ ID №: 18 від позиції 206 до 362. Має бути зрозумілим, що засоби і способи за цим винаходом можуть використовуватись по відношенню до будь-якої рослини, включаючи кукурудзу, тютюн, зернові рослини, включаючи пшеницю, овес, ячмінь, жито, рис, газонну траву, сорго, просо або цукрову тростину. Способи за цим винаходом можуть бути застосовані також для будь-якої рослини (Angiospermae або Gymnospermae), включаючи, але не обмежуючись ними, бавовник, канолу, олійний рапс, соєві боби, овочі, картоплю, Lemna spp., Nicotiana spp., Arabidopsis, люцерну, ячмінь, боби, кукурудзу, бавовник, льон, горох, рапс, рис, жито, соняшник, сорго, соєві боби, сафлор, тютюн, пшеницю, спаржу, буряк і цукровий буряк, броколі, капусту, моркву, цвітну капусту, селеру, огірок, баклажан, салат-латук, цибулю, олійний рапс, перець, картоплю, гарбуз, редиску, шпинат, кабачок, томат, цукіні, мигдаль, яблуко, абрикос, банан, чорну смородину, чорницю, какао, вишню, кокос, журавлину, фінік, виноград, грейпфрут, гуаву, ківі, лимон, лайм, манго, диню, нектарин, помаранч, папайю, маракуйю, персик, арахіс, грушу, ананас, фісташковий горіх, сливу, малину, полуницю, мандарин, грецький горіх і кавун. Метою цього винаходу було також забезпечити рослинні клітини і рослини, створені з використанням способів за даним винаходом. Гамети, насіння, ембріони - зиготні або соматичні, потомство або гібриди рослин, що містять явища вставки ДНК, які продукуються традиційними методами виведення, також є включеними в об'єм даного винаходу. Такі рослини можуть містити гетерологічну або чужорідну послідовність ДНК, вставлену в цільову послідовність або замість неї, і будуть відрізнятись від рослин-предків тільки присутністю цієї гетерологічної ДНК або послідовності ДНК після обміну. 13 UA 115961 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Рослини, отримані описаними тут способами, можуть далі схрещуватись традиційними методами виведення з іншими рослинами, щоб отримати потомство рослин, що містять явища вставки цільової ДНК, здійсненої у відповідності до даного винаходу. Рослини і насіння за цим винаходом можуть додатково оброблятись хімічною сполукою, такою як хімічна сполука, вибрана з наступних переліків: - Гербіциди для плодів/овочів: Атразин, Бромацил, Діурон, Гліфосат, Лінурон, Метрібузин, Сімазин, Трифлуралін, Флуазіфоп, Глюфозинат, Галосульфурон Гован, Паракват, Пропізамід, Сетоксидим, Бутафенацил, Галосульфурон, Індазіфлам; - Інсектициди для плодів/овочів: Алдікарб, Bacillus thuriengiensis, Карбарил, Карбофуран, Хлорпиріфос, Сайперметрин, Дельтаметрин, Абамектин, Сайфлутрин/бета-сайфлутрин, Есфенвалерат, Лямбда-сайгалотрин, Ацеквіноцил, Біфеназат, Метоксифенозид, Новалурон, Хромафенозид, Тіаклоприд, Дінотефуран, Флуакрипірим, Спіродиклофен, Гамма-сайгалотрин, Спіромезіфен, Спіносад, Ринаксипір, Сайазипір, Трифлумурон, Спіротетрамат, Імідаклоприд, Флубендіамід, Тіодікарб, Метафлумізон, Сульфоксафлор, Сайфлуметофен, Ціанопірафен, Клотіанідин, Тіаметоксам, Спіноторам, Тіодікарб, Флоніуамід, Метіокарб, Емамектин-бензоат, Індоксакарб, Фенаміфос, Пиріпроксифен, Фенбутатин-оксид; - Фунгіциди для плодів/овочів: Аметоктрадин, Азоксистробін, Бентіавалікарб, Боскалід, Каптан, Карбендазим, Хлороталоніл, Коппер, Ціазофамід, Сайфлуфенамід, Саймоксаніл, Сайпроконазол, Сайпродиніл, Діфеноконазол, Діметоморф, Дітіанон, Фенамідон, Фенгексамід, Флуазинам, Флудіоксоніл, Флуопіколід, Флуопірам, Флуоксастробін, Флуксапіроксад, Фолпет, Фосетил, Іпродіон, Іпровалікарб, Ізопіразам, Крезоксим-метил, Манкозеб, Мандіпропамід, Металаксил/мефеноксам, Метірам, Метрафенон, Міклобутаніл, Пенконазол, Пентіопірад, Пікоксистробін, Пропамокарб, Пропіконазол, Пропінеб, Проквіназид, Протіоконазол, Піраклостробін, Пиріметаніл, Квіноксифен, Спіроксамин, Сульфур, Тебуконазол, Тіофанатметил, Трифлоксистробін; - Гербіциди для зернових культур: 2.4-D, амідосульфурон, бромоксиніл, карфентразон-e, хлоротолурон, хлорсульфурон, клодінафоп-p, клопіралід, дікамба, діклофоп-m, діфлуфенікам, феноксапроп, флорасулам, флукарбазон-na, флуфенацет, флупірсульфурон-m, флуроксипір, флуртамон, гліфосат, йодосульфурон, йоксиніл, ізопротурон, mcpa, мезосульфурон, метсульфурон, пендіметалін, піноксаден, пропоксикарбазон, просульфокарб, піроксулам, сульфосульфурон, тіфенсульфурон, тралкоксидим, тріасульфурон, трибенурон, трифлуралін, тритосульфурон; - Фунгіциди для зернових культур: Азоксистробін, Біксафен, Боскалід, Карбендазим, Хлороталоніл, Сайфлуфенамід, Сайпроконазол, Сайпродиніл, Дімоксистробін, Епоксіконазол, Фенпропідин, Фенпропіморф, Флуопірам, Флуоксастробін, Флуквінконазол, Флуксапіроксад, Ізопіразам, Крезоксім-метил, Метконазол, Метрафенон, Пентіопірад, Пікоксистробін, Прохлораз, Пропіконазол, Проквіназид, Протіоконазол, Піраклостробін, Квіноксмфен, Спіроксамін, Тебуконазол, Тіофанат-метил, Трифлоксистробін; - Інсектициди для зернових культур: Діметоат, Лямбда-сайгалотрин, Дельтаметрин, альфаСайперметрин, -сайфлутрин, Біфентрин, Імідаклоприд, Клотіанідин, Тіаметоксам, Тіаклоприд, Ацетаміприд, Дінетофуран, Клорфиріфос, Піримікарб, Метіокарб, Сульфоксафлор; - Гербіциди для кукурудзи: Атразин, Алахлор, Бромоксиніл, Ацетохлор, Дікамба, Клопіралід, (S-)Діметенамід, Глюфосинат, Гліфосат, Ізоксафлутол, (S-)Метолахлор, Мезотріон, Нікосульфурон, Примісульфурон, Римсульфурон, Сулькотріон, Форамсульфурон, Топрамезон, Темботріон, Сафлуфенацил, Тієнкарбазон, Флуфеанцет, Піроксасульфон; - Інсектициди для кукурудзи: Карбофуран, Хлорпірифос, Біфентрин, Фіпроніл, Імідаклоприд, Лямбда-Сайгалотрин, Тефлутрин, Тербуфос, Тіаметоксам, Клотіанідин, Спіромезіфен, Флубендіамід, Трифлумурон, Ринаксипір, Дельтаметрин, Тіодікарб, ß-Сайфлутрин, Сайперметрин, Біфентрин, Луфенурон, Тебупірімфос, Етіпрол, Ціазипір, Тіаклоприд, Ацетаміприд, Дінетофуран, Авермектин; - Фунгіциди для кукурудзи: Азоксистробін, Біксафен, Боскалід, Сайпроконазол, Дімоксистробін, Епоксіконазол, Фенітропан, Флуопірам, Флуоксастробін, Флуксапіроксад, Ізопіразам, Метконазол, Пентіопірад, Пікоксистробін, Пропіконазол, Протіоконазол, Піраклостробін, Тебуконазол, Трифлоксистробін; - Гербіциди для рису: Бутахлор, Пропаніл, Азімсульфурон, Бенсульфурон, Сайгалофоп, Даймурон, Фентразамід, Імазосульфурон, Мефенацет, Оксазікломефон, Піразосульфурон, Пирібутікарб, Квінклорак, Тіобенкарб, Інданофан, Флуфенацет, Фентразамід, Галосульфурон, Оксазікломефон, Бензобіциклон, Пирфіталід, Пеноксулам, Біспирібак, Оксадіаргіл, Етоксисульфурон, Претілахлор, Мезотріон, Тефурилтріон, Оксадіазон, Феноксапроп, Пирімісульфан; 14 UA 115961 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 - Інсектициди для рису: Діазинон, Фенобукарб, Бенфуракарб, Бупрофезин, Дінотефуран, Фіпроніл, Імідаклоприд, Ізопрокарб, Тіаклоприд, Хромафенозид, Клотіанідин, Етіпрол, Флубендіамід, Рінаксипір, Дельтаметрин, Ацетаміприд, Тіаметоксам, Ціазипір, Спіносад, Спіноторам, Емамектин-бензоат, Cypermethrin, Хлорпірифос, Етофенпрокс, Карбофуран, Бенфуракарб, Сульфоксафлор; - Фунгіциди для рису: Азоксистробін, Карбендазим, Карпропамід, Діклоцимет, Діфеноконазол, Едіфенфос, Ферімзон, Гентаміцин, Гексаконазол, Гімексазол, Іпробенфос (IBP), Ізопротіолан, Ізотіаніл, Касугаміцин, Манкозеб, Метоміностробін, Орісастробін, Пенсайкурон, Пробеназол, Пропіконазол, Пропінеб, Піроквілон, Тебуконазол, Тіофанат-метил, Тіадиніл, Трициклазол, Трифлоксистробін, Валідаміцин; - Гербіциди для бавовнику: Діурон, Флуометурон, MSMA, Оксифторфен, Прометрин, Трифлуралін, Карфентразон, Клетодим, Флуазифоп-бутил, Гліфосат, Норфлуразон, Пендіметалін, Піритіобак-натрій, Трифлоксисульфурон, Тепралоксидим, Глюфосинат, Флуміоксазин, Тідіазурон; - Інсектициди для бавовнику: Ацефат, Алдікарб, Хлорпиріфос, Сайперметрин, Дельтаметрин, Абамектин, Ацетаміприд, Емамектин бензоат, Імідаклоприд, Індоксакарб, Лямбда-Сайгалотрин, Спіносад, Тіодікарб, Гамма-Сайгалотрин, Спіромезіфен, Пирідаліл, Флонікамід Флубендіамід, Трифлумурон, Ринаксипір, Бета-Сайфлутрин, Спіротетрамат; - Клотіанідин, Тіаметоксам, Тіаклоприд, Дінетофуран, Флубендіамід, Ціазипір, Спіносад, Спіноторам, гамма Сайгалотрин, 4-[[(6-Хлорпіридин-3-іл)метил](2,2-дифторетил)аміно]фуран2(5H)-он, Тіодікарб, Авермектин, Флонікамід, Пирідаліл, Спіромезіфен, Сульфоксафлор; - Фунгіциди для бавовнику: Азоксистробін, Біксафен, Боскалід, Карбендазим, Хлороталоніл, Коппер, Сайпроконазол, Діфеноконазол, Дімоксистробін, Епоксіконазол, Фенамідон, Флуазинам, Флуопірам, Флуоксастробін, Флуксапіроксад, Іпродіон, Ізопіразам, Ізотіаніл, Манкозеб, Манеб, Метаміностробін, Пентіопірад, Пікоксистробін, Пропінеб, Протіоконазол, Піраклостробін, Квінтозен, Тебуконазол, Тетраконазол, Тіофанат-метил, Трифлоксистробін; - Гербіциди для соєвих бобів: Алахлор, Бентазон, Трифлуралін, Хлорімурон-етил, Клорансулам-метил, Феноксапроп, Фомесафен, Флуазифоп, Гліфосат, Імазамокс, Імазаквін, Імазетапір, (S-)Метолахлор, Метрібузин, Пендіметалін, Тепралоксидим, Глюфосинат; - Інсектициди для соєвих бобів: Лямбда-сайгалотрин, Метоміл, Імідаклоприд, Клотіанідин, Тіаметоксам, Тіаклоприд, Ацетаміприд, Дінетофуран, Флубендіамід, Рінаксипір, Ціазипір, Спіносад, Спіноторам, Емамектин-бензоат, Фіпроніл, Етіпрол, Дельтаметрин, -Сайфлутрин, гамма і лямбда Сайгалотрин, 4-[[(6-Хлорпіридин-3-іл)метил](2,2-дифторетил)аміно]фуран-2(5H)он, Спіротетрамат, Спінодіклофен, Трифлумурон, Флонікамід, Тіодікарб, бета-Сайфлутрин; - Фунгіциди для соєвих бобів: Азоксистробін, Біксафен, Боскалід, Карбендазим, Хлороталоніл, Коппер, Сайпроконазол, Діфеноконазол, Дімоксистробін, Епоксіконазол, Флуазінам, Флуопірам, Флуоксастробін, Флутріафол, Флуксапіроксад, Ізопіразам, Іпродіон, Ізотіаніл, Манкозеб, Манеб, Метконазол, Метоміностробін, Міклобутаніл, Пентіопірад, Пікоксистробін, Пропіконазол, Пропінеб, Протіоконазол, Піраклостробін, Тебуконазол, Тетраконазол, Тіофанат-метил, Трифлоксистробін; - Гербіциди для цукрового буряка: Хлорідазон, Десмедіфам, Етофумесат, Фенмедіфам, Тріаллат, Клопіралід, Флуазіфоп, Ленацил, Метамітрон, Квінмерак, Циклоксидим, Трифлусульфурон, Тепралоксидим, Квізалофоп; - Інсектициди для цукрового буряка: Імідаклоприд, Клотіанідин, Тіаметоксам, Тіаклоприд, Ацетаміприд, Дінетофуран, Дельтаметрин, -Сайфлутрин, гамма/лямбда Сайгалотрин, 4-[[(6Хлорпіридин-3-іл)метил](2,2-дифторетил) аміно]фуран-2(5H)-он, Тефлутрин, Рінаксипір, Ціаксипір, Фіпроніл, Карбофуран; - Гербіциди для каноли: Клопіралід, Діклофоп, Флуазіфоп, Глюфозинат, Гліфосат, Метазахлор, Трифлуралін Етаметсульфурон, Квінмерак, Квізалофоп, Клетодим, Тепралоксидим; - Фунгіциди для каноли: Азоксистробін, Біусафен, Боскалід, Карбендазим, Сайпроконазол, Діфеноконазол, Дімоксистробін, Епоксіконазол, Флуазінам, Флуопірам, Флуоксастробін, Флузилазол, Флуксапіроксад, Іпродіон, Ізопіразам, Мепікват-хлорид, Метконазол, Метоміностробін, Паклобутразол, Пентіопірад, Пікоксистробін, Прохлораз, Протіоконазол, Піраклостробін, Тебуконазол, Тіофанат-метил, Трифлоксистробін, Вінклозолін; - Інсектициди для каноли: Карбофуран, Тіаклоприд, Дельтаметрин, Імідаклоприд, Клотіанідин, Тіаметоксам, Ацетаміприд, Дінетофуран, -Сайфлутрин, гамма і лямбда Сайгалотрин, тау-Флувалеріат, Етіпрол, Спіносад, Спіноторам, Флубендіамід, Ринаксипір, Ціазипір, 4-[[(6-Хлорпіридин-3-іл)метил](2,2-дифторетил)аміно]фуран-2(5H)-он; 15 UA 115961 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Як він тут використовується, термін "містить" має інтерпретуватись як такий, що вказує на присутність встановлених ознак, цілих чисел, етапів або компонентів, про які йдеться, але не виключає присутності або додавання однієї або більше ознак, цілих чисел, етапів або компонентів або їх груп. Отже, наприклад, нуклеїнова кислота або білок, що містять послідовність нуклеотидів або амінокислот, можуть містити більше нуклеотидів або амінокислот, ніж дійсно наведена кількість, тобто можуть бути вставленими у більшу нуклеїнову кислоту або білок. Химерний ген, що містить ділянку ДНК, яка є функціонально або структурно визначеною, може містити додаткові ділянки ДНК і т.д. Як він тут використовується, термін "частина рослини" включає будь-який орган рослини або тканину рослини, включаючи, але не обмежуючись ними, плоди, насіння, ембріони, ділянки меристеми, тканину калюсу, листя, корінці, пагони, квіти, гаметофіти, спорофіти, пилок і мікроспори. Для цілей даного винаходу "ідентичність послідовностей" двох споріднених нуклеотидних або амінокислотних послідовностей, виражена як відсоток, стосується кількості позицій в цих двох оптимально зіставлених послідовностях, які мають ідентичні залишки (х 100), поділеній на кількість порівнюваних позицій. Пропуск, тобто позиція у зіставленні, де залишок є присутнім в одній послідовності, але відсутнім в іншій, розглядається як позиція з неідентичними залишками. Зіставлення двох послідовностей здійснюється за алгоритмом Needleman і Wunsch (Needleman and Wunsch 1970). З допомогою комп'ютеру зіставлення послідовностей можна зручно здійснювати з використанням стандартного програмного забезпечення, такого як GAP, який є частиною пакету Wisconsin Package Version 10.1 (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin, США), застосовуючи матрицю замін за умовчанням зі штрафом за створення пропуску 50 і штрафом за продовження пропуску 3. Має бути очевидним, що завжди, коли нуклеотидні послідовності молекул РНК визначаються через посилання на нуклеотидну послідовність відповідних молекул ДНК, тимін (Т) в такій нуклеотидній послідовності повинен бути заміщеним на урацил (U). Те, або зроблене посилання на молекули РНК або ДНК, буде ясно з контексту даної заявки. Наступні не обмежуючі Приклади описують використання реконструйованої мегануклеази для модифікації рослин у сайті ділянки, кодуючої bar, вже присутньої в геномі рослини. Коли в Прикладах не вказується інше, всі технології рекомбінантних ДНК здійснюються у відповідності до стандартних протоколів, як описано в Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY і в Томах 1 і 2 книги Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, США. Стандартні матеріали і методи для молекулярної роботи з рослинами є описаними в роботі Plant Molecular Biology Labfax (1993) автором R.D.D. Croy, спільно опублікованій BIOS Scientific Publications Ltd (Велика Британія) і Blackwell Scientific Publications, Велика Британія. Інші джерела, які описують стандартні методи молекулярної біології, включають довідник Sambrook і Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, Volumes I and II of Brown (1998) Molecular Biology LabFax, Second Edition, Academic Press (Велика Британія). Стандартні матеріали і методи для полімеразних ланцюгових реакцій можна знайти в довіднику Dieffenbach і Dveksler (1995) PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, а також в публікації McPherson at al. (2000) PCR-Basics: From Background to Bench, First Edition, Springer Verlag, Німеччина. Всі патенти, заявки на патенти і публікації, згадані тут, є тим самим включеними за посиланням у всій їх повноті, для всіх цілей. Протягом всього опису і Прикладів посилання робляться на наступні послідовності: SEQ ID №: 1: нуклеотидна послідовність сайту розпізнавання реконструйованих мегануклеаз BAY 39/BAY40; SEQ ID №: 2: нуклеотидна послідовність комплементу сайту розпізнавання реконструйованих мегануклеаз BAY 39/BAY40; SEQ ID №: 3: нуклеотидна послідовність кодуючої ділянки гену bar; SEQ ID №: 4: нуклеотидна послідовність вектору pCV177, що експресує пару гетеродимерних мегануклеаз BAY 39 і BAY40; SEQ ID №: 5: амінокислотна послідовність мономерної одиниці 2 ("40") мегануклеази BAY39/40; SEQ ID №: 6: амінокислотна послідовність мономерної одиниці 1 ("39") мегануклеази BAY39/40; SEQ ID №: 7: нуклеотидна послідовність амплікону ПЛР ділянки, кодуючої ген bar, біля сайту розпізнавання BAY39/40 (контроль); 16 UA 115961 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 SEQ ID №: 8: нуклеотидна послідовність амплікону ПЛР ділянки, кодуючої ген bar, біля сайту розпізнавання BAY39/40 (стійка до РРТ лінія) (РРТ=фосфінотрицин); SEQ ID №: 9: нуклеотидна послідовність амплікону ПЛР ділянки, кодуючої ген bar, біля сайту розпізнавання BAY39/40 (чутлива до РРТ лінія 1); SEQ ID №: 10: нуклеотидна послідовність амплікону ПЛР ділянки, кодуючої ген bar, біля сайту розпізнавання BAY39/40 (чутлива до РРТ лінія 2); SEQ ID №: 11: нуклеотидна послідовність амплікону ПЛР ділянки, кодуючої ген bar, біля сайту розпізнавання BAY39/40 (чутлива до РРТ лінія 3); SEQ ID №: 12: нуклеотидна послідовність амплікону ПЛР ділянки, кодуючої ген bar, біля сайту розпізнавання BAY39/40 (чутлива до РРТ лінія 4); SEQ ID №: 13: нуклеотидна послідовність амплікону ПЛР ділянки, кодуючої ген bar, біля сайту розпізнавання BAY39/40 (чутлива до РРТ лінія 5); SEQ ID №: 14: нуклеотидна послідовність амплікону ПЛР ділянки, кодуючої ген bar, біля сайту розпізнавання BAY39/40 (чутлива до РРТ лінія 6); SEQ ID №: 15: нуклеотидна послідовність амплікону ПЛР ділянки, кодуючої ген bar, біля сайту розпізнавання BAY39/40 (чутлива до РРТ лінія 7); SEQ ID №: 16: амінокислотна послідовність природного варіанту I-CreI (мономер); SEQ ID №: 17: нуклеотидна послідовність вектору pCV170, що експресує однонитчасту мегануклеазу BAY39/BAY40; SEQ ID №: 18: амінокислотна послідовність однонитчастої мегануклеази BAY39/BAY40. ПРИКЛАДИ Всі реконструйовані мегануклеази, описані тут, були створені Precision BioSciences Inc., 104 T.W. Alexander Drive, Research Triangle Park, NC27713. Приклад 1: Опис векторів Т-ДНК, кодуючих реконструйовані мегануклеази за цим винаходом Використовуючи звичайні методи рекомбінантної ДНК, було створено химерний ген, кодуючий пару мономерів реконструйованої мегануклеази, який як гетеродимер розпізнає нуклеотидну послідовність SEQ ID №: 1 або 2 (hd BAY39/40), що містить наступні, функціонально зв'язані фрагменти ДНК: - ділянку ДНК, кодуючу промотор CaMV35S (SEQ ID №: 6 від нуклеотидної позиції 1516 до нуклеотидної позиції 1933, таку як SEQ ID №: 4 від нуклеотидної позиції 1516 до нуклеотидної позиції 1997); - ділянку ДНК, що містить мономерну одиницю 2 BAY 39/40, кодуючу ділянку, функціонально зв'язану з SV40 NLS на N-кінці (SEQ ID №: 4 від нуклеотидної позиції 2004 до нуклеотидної позиції 2525, включаючи стоп-кодон, або до нуклеотидної позиції 2522, виключаючи стоп-кодон); - ділянку ДНК, задіяну в термінації транскрипції і поліаденілюванні на 3' кінці від гену нопалін синтази (SEQ ID №: 4 від нуклеотидної позиції 2530 до нуклеотидної позиції 2783); - ділянку ДНК, кодуючу промотор CaMV35S (SEQ ID №: 4 від нуклеотидної позиції 4397 до нуклеотидної позиції 4814, таку як SEQ ID №: 4 від нуклеотидної позиції 4397 до нуклеотидної позиції 4878); - ділянку ДНК, що містить мономерну одиницю 1 BAY 39/40, кодуючу ділянку, функціонально зв'язану з SV40 NLS на N-кінці (SEQ ID №: 4 від нуклеотидної позиції 4885 до нуклеотидної позиції 5405, включаючи стоп-кодон, або до нуклеотидної позиції 5403, виключаючи стоп-кодон); - ділянку ДНК, задіяну в термінації транскрипції і поліаденілюванні на 3' кінці від гену нопалін синтази (SEQ ID №: 4 від нуклеотидної позиції 5411 до нуклеотидної позиції 5664). Нуклеотидна послідовність результуючої плазміди представлена послідовністю SEQ ID №: 6. Використовуючи звичайні методи рекомбінантної ДНК, було створено химерний ген, кодуючий однонитчасту реконструйовану мегануклеазу, яка розпізнає нуклеотидну послідовність SEQ ID №: 1 або 2 (sc BAY39/40), що містить наступні, функціонально зв'язані фрагменти ДНК: - ділянку ДНК, кодуючу промотор CaMV35S (SEQ ID №: 17 від нуклеотидної позиції 691 до нуклеотидної позиції 1223); - лідерну послідовність гену rbcS ATS1A Arabidopsis thaliana gene; SEQ ID №: 17 від нуклеотидної позиції 1224 до нуклеотидної позиції 1266; Krebbers et al. 1988 Plant Molecular Biology 11:745-759); - ділянку ДНК, кодуючу N-термінальну ділянку однонитчастої мегануклеази BAY 39/40, функціонально зв'язану з SV40 NLS на N-кінці, оптимізовану для експресії в тютюні (SEQ ID №: 17 від нуклеотидної позиції 1267 до нуклеотидної позиції 1605); 17 UA 115961 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 - ділянку ДНК, кодуючу другий інтрон специфічного до тканини гену ST-LS1 картоплі, що індукується світлом (SEQ ID №: 17 від нуклеотидної позиції 1606 до нуклеотидної позиції 1794; X04753; Eckes et al. 1986 Mol. Gen. Genet. 205, 14-22); - ділянку ДНК, кодуючу С-термінальну ділянку однонитчастої мегануклеази BAY 39/40 (SEQ ID №: 17 від нуклеотидної позиції 1795 до нуклеотидної позиції 1798, включаючи стоп-кодон, або до нуклеотидної позиції 2541, виключаючи стоп-кодон), включаючи ділянку ДНК, кодуючу лідерну послідовність (SEQ ID №: 17 від нуклеотидної позиції 1757 до нуклеотидної позиції 2070), оптимізовану для експресії в тютюні; - ділянку ДНК, задіяну в термінації транскрипції і поліаденілюванні на 3' кінці від гену 35S (SEQ ID №: 17 від нуклеотидної позиції 2545 до нуклеотидної позиції 2678). Нуклеотидна послідовність результуючої плазміди представлена послідовністю SEQ ID №: 17. Приклад 2: Опис цільової лінії тютюну і методика аналізу Для того, щоб розробити методику аналізу на індукцію двонитчастого розриву ДНК, було виведено стійку до фосфінтрицину (РРТ) лінію трансгенних рослин тютюну, які містили ділянку, кодуючу ген bar, під контролем експресованого рослиною промотору. Цю трансгенну лінію було використано в якості вихідного матеріалу для трансформації, в ході якої химерні гени, кодуючі мегануклеази hd BAY39/40, вводились стабільно або тимчасово, разом з експресованим рослиною химерним геном, що містить гідроміцинфосфотрансферазу, яка надає стійкості до гідроміцину. Після індукції двонитчастого розриву ДНК в сайті розпізнавання на ділянці, кодуючій ген bar, через експресію експресованих рослиною химерних генів, кодуючих гетеродимер BAY39/40, цей розрив може бути підданий репарації шляхом не гомологічного кінцевого приєднання за відсутності репаративної ДНК, що має своїм результатом делецію або вставку однієї або більше пар основ, внаслідок чого ділянка, кодуюча ген bar, розривається, призводячи до чутливості до фосфінтрицину. Було відібрано кілька ліній рослин, що демонструють чутливість до фосфінтрицину і стійкість до гідроміцину. З цих ліній рослин за допомогою ПЛР було ампліфіковано фрагмент ДНК з використанням праймерів, розміщених по обидва боки від сайту розпізнавання (SEQ ID №: 1 або 2) на ділянці, кодуючій bar, і встановлено нуклеотидну послідовність ампліконів. Зіставлення різних нуклеотидних послідовностей є представленим на Фіг. 5. Має бути очевидним, що в лініях рослин, чутливих до РРТ (від 3 до 9), сайт розпізнавання для BAY39/40 було змінено делецією (від 3 до 8) або вставкою (9), тоді як в лініях рослин, стійких до РРТ (2), жодних змін виявлено не було. Отже, з цих експериментів можна зробити висновок, що hd BAY39/40 демонструє активність розщеплення в попередньо вибраному сайті. Приклад 3: Цільова вставка шляхом не гомологічного кінцевого приєднання Одночасне перенесення pCV177, що містить химерні гени, кодуючі мегануклеази hd BAY39/40, або pCV170, що містить химерний ген, кодуючий sc BAY39/40, з репаративною ДНК, яка містить селектований маркер, такий як експресований рослиною химерний ген, що містить кодуючу ділянку 2mepsp (без додаткової гомології з цільовою ділянкою), в рослинні клітини, що містять експресований рослиною химерний ген bar, інтегрований в їх геном, і відбір чутливих до фосфінтрицину рослин, стійких до сполуки, на основі якої ведеться відбір, такої як гліфосат, забезпечує ідентифікацію рослинних клітин, в яких послідовності репаративної ДНК є інтегрованими в ділянку, що кодує ген bar. Приклад 4: Цільова вставка шляхом гомологічного кінцевого приєднання Одночасне перенесення pCV177, що містить химерні гени, кодуючі мегануклеази hd BAY39/40, або pCV170, що містить химерний ген, кодуючий sc BAY39/40, з репаративною ДНК, яка містить селектований маркер, такий як експресований рослиною химерний ген, що містить кодуючу ділянку 2mepsp, фланковану вище фланкуючими послідовностями, що містять нуклеотидну послідовність з подібністю послідовностей до ділянки, кодуючої ген bar SEQ ID №: 3 від нуклеотиду 1 до нуклеотиду 132, і фланковану нижче фланкуючими послідовностями, що містять нуклеотидну послідовність з подібністю послідовностей до ділянки, кодуючої ген bar SEQ ID №: 3 від нуклеотиду 154 до нуклеотиду 552, в рослинні клітини, що містять експресований рослиною химерний ген bar, інтегрований в їх геном, і відбір чутливих до фосфінтрицину рослин, стійких до сполуки, на основі якої ведеться відбір, такої як гліфосат, забезпечує ідентифікацію рослинних клітин, в яких послідовності репаративної ДНК є інтегрованими в ділянку, що кодує ген bar. Приклад 5: Індукція цільового двонитчастого розриву ДНК з використанням однонитчастої і гетеродимерної мегануклеази BAY39/40 в бавовнику 18 UA 115961 C2 5 10 15 Ембріогенні калюси від стійких до фосфінтрицину (РРТ) рослин бавовнику, що містять химерний ген, який містить ген bar під контролем промотору CSVMV, були вирощені на субстраті М100 (солі MS, вітаміни B5, MES 0,5 г/л, MgCl 26H2O 0,94 г/л, гелрит 2 г/л, глюкоза 30 г/л, pH 5,8) з 2 г/л активного вуглецю. Ці калюси були піддані бомбардуванню мікрочастками з використанням системи доставки BioRAD PPS_1000/He Biolistic Particle, суттєво такої, як описано Sanford et al., 1992. При цьому мікрочастки покривались вектором pCV177, кодуючим гетеродимерну мегануклеазу BAY39/40, або вектором pCV170, кодуючим однонитчасту мегануклеазу BAY39/40. Перенесення вектору мегануклеази здійснювалось одночасно з вектором, що містить ген 2mEPSPS під контролем експресованого рослиною промотору, який надає стійкості до гліфосату як селектований маркерний ген. Після бомбардування калюси були перенесені в середовище, що містить 1 мМ гліфосату, в результаті чого було отримано біля 3000 стійких до гліфосату ембріогенних калюсів. З них 85 об'єктів виявились чутливими до РРТ, а з цієї кількості 79 об'єктів були піддані подальшому молекулярному аналізу. Ці 79 об'єктів були охарактеризовані у відношенні генотипу за допомогою ПЛР з використанням праймерів, фланкуючих цільовий сайт, і наступного секвенування продукту ПЛР. Відсутність продукту ПЛР засвідчує велику делецію біля цільового сайту (Таблиця 1). Таблиця 1 Характеристика чутливих до РРТ, стійких до гліфосату об'єктів трансформації pCV170 (sc) Отриманий продукт ПЛР ні так Кількість об'єктів 11 8 Зміна в цільовому сайті Велика делеція Жодної мутації Заміщення/вставка Делеція Кількість об'єктів 11 6 1 1 Зміна в цільовому сайті Велика делеція Жодної мутації Вставка Делеція Кількість об'єктів 33 19 4 4 pCV177 (hd) Отриманий продукт ПЛР ні так 20 Кількість об'єктів 33 27 Отже, ці результати демонструють, що як однонитчаста, так і гетеродимерна мегануклеаза BAY39/40 є здатними індукувати цільовий двонитчастий розрив ДНК в бажаній позиції і що цільові об'єкти делеції, заміщення і вставки можуть отримуватись з використанням таких мегануклеаз у бавовнику. 19 UA 115961 C2 20 UA 115961 C2 21 UA 115961 C2 22 UA 115961 C2 23 UA 115961 C2 24 UA 115961 C2 25 UA 115961 C2 26 UA 115961 C2 27 UA 115961 C2 28