Спосіб введення нуклеїнових кислот у клітини дріжджів

Спосіб введення нуклеїнових кислот у клітини дріжджів, що базується на використанні полімеру, який відрізняється тим, що як полімер використовують олігоелектроліт у кількості від 0,0001 до 5 мкг з розрахунку на 1 мікрограм нуклеїнових кислот при температурі від 0 до 99 °С. (19) (21) u201000286 (22) 14.01.2010 (24) 10.08.2010 (46) 10.08.2010, Бюл.№ 15, 2010 р. (72) ФІЛЯК ЄВГЕН ЗЕНОВІЙОВИЧ, СТОЙКА РОСТИСЛАВ СТЕПАНОВИЧ, ГРИДЖУК ОЛЕСЯ СЕРГІЇВНА, СТРАМИК ІВАН ІВАНОВИЧ, ЗАІЧЕНКО ОЛЕКСАНДР СЕРГІЙОВИЧ, МІТІНА НАТАЛІЯ ЄВГЕНІВНА, ІЗЮМОВА ЛЮДМИЛА АНДРІЇВНА, НАДАШКЕВИЧ ЗОРЯНА ЯКИМІВНА 3 тання наночастинок необхідна наявність дорогого обладнання (генна гармата). Найбільш близьким до запропонованого є "спосіб трансформації дріжджів за допомогою поліетиленгліколю" [Foote S., Denny C. Construction of YAC libraries with large inserts. Curr. Protocols Hum. Genet. 2002; Chapter 5: Unit 5.2; Gietz, R.D. and R.A. Woods. Transformation of yeast by the liac/ss carrier DNA/PEG method. Methods in Enzymology 2002350: 87-96], який базується на використанні полімеру поліетиленгліколю для дегідратації суспензії клітин, часткової контрольованої преципітації ДНК, підвищення адгезивних властивостей мембрани. Недоліки: використання поліетиленгліколю обмежене протопластами / сферопластами, що передбачає значні фінансові та часові затрати на введення нуклеїнової кислоти у клітину. Тому спосіб трансформації поліетиленгліколем використовується не більше, як у 0.01% усіх випадків трансформації дріжджів, за даними PabMed. Корисна модель ставить перед собою завдання удосконалити "спосіб введення нуклеїнових кислот у клітини дріжджів" шляхом використання нових полімерів-олігоелектролітів, що дасть змогу збільшити ефективність доставки нуклеїнових кислот, а саме, збільшити кількість клітин, у які було введено нуклеїнову кислоту, скоротити у часі та значно здешевити введення нуклеїнових кислот у клітини дріжджів. Поставлене завдання вирішується тим, що у "способі введення нуклеїнових кислот у клітини дріжджів", що базується на використанні полімеру, де як полімер використовують олігоелектроліт у кількості від 0,0001 до 5мкг з розрахунку на 1 мікрограм нуклеїнових кислот при температурі від 0 до 99 С. Доставка циклічних чи лінійних молекул нуклеїнових кислот у клітини дріжджів - це широко розповсюджена техніка, що використовується, як у дослідницькій роботі, так і у прикладній біотехнології. Зазвичай, для цього використовують способи, що базуються на використанні хімічних агентівселективних іонів або електропорації. Рідше для доставки нуклеїнових кислот застосовують наночастинки або проводять трансформацію сферопластів за допомогою поліетиленгліколю. При аналізі великої кількості трансформованих клітин, наприклад при скринінгу гомологічних рекомбінантних клітин, використання традиційних способів дає низьку ефективність трансформації, що суттєво знижує швидкість проведення досліджень. Окрім того, деякі види і штами дріжджів, що широко використовуються у дослідженнях та прикладній біотехнології, наприклад Yarrowia lipolitica, Dekkera bruxellensis (Brettanomyces bruxellensis), Phaffia rhodozyma (Xanthophyllomyces dendrorhous), Hansenula polymorpha, Candida lipolitica тощо, демонструють дуже низьку ефективність трансформації при використанні будь-якого із описаних способів, окрім дорогого та незручного способу введення за допомогою наночастинок та генної гармати. Таким чином, генетичні маніпуляції із цими видами дріжджів дуже складні і потребують багато часу та фінансових затрат. 51916 4 Автори вперше запропонували використати сконструйовані та отримані ними лінійні та розгалужені олігоелектроліти для введення у клітини дріжджів дволанцюгових та одноланцюгових, лінійних та кільцевих нуклеїнових кислот різної довжини: від 2нуклеотидів/пар нуклеотидів до 5*107нуклеотидів/пар нуклеотидів. При доставцівведенні нуклеїнових кислот, використовують олігоелектроліти, що містять різні хімічні групи для проникнення через плазматичну мембрану та/або для зв'язування нуклеїнових кислот. У запропонованому способі відсутні недоліки, описані для традиційних способів трансформації, таких як електропорація та хімічна трансформація. Водночас, цей спосіб доставки володіє унікальними перевагами, підтвердженими експериментально та описаними нижче. Фіг.1 Структура функціонального олігоелектроліту розгалуженої структури, де ОМС (ОМК) - олігопероксидний металокомплекс Сu2+ ДМАЕМ – диметиламіноетилметакрилат ВЕП - 5-(трет-бутилперокси)-5-метил-1-гексен3-ін а - вміст ланок ДМАЕМ в прищепленому ланцюзі кополімеру - 66,0-92,5% b - вміст м ланок ВЕП в прищепленому ланцюзі кополімеру - 7,5-34,0% k - вміст ланок вінілацетату в основному ланцюзі кополімеру – 22% l - вміст ланок VEP в основному ланцюзі кополімеру – 34% m - вміст ланок малеїнового ангідриду в основному ланцюзі кополімеру – 42% х - вміст ланок малеїнового ангідриду в основному ланцюзі кополімеру з координаційно зв'язаними Сu2+ – 2% Фіг.2 Структура олігопероксидного комплексу металу, де k - вміст ланок вінілацетату в кополімері – 22% l - вміст ланок ВЕП в кополімері – 34% m - вміст ланок малеїнового ангідриду в кополімері – 42% х - вміст ланок малеїнового ангідриду в кополімері з координаційно зв'язаними Сu2+ - 2% Одержані результати можна простежити за наступним прикладом. Синтез розгалуженого олігоелетроліту здійснювали згідно із розробленою авторами технологією: Суміш мономерів диметиламіноетилметакрилату (DMAEMA), від 17.13 до 28.18г, оптимально 28.18г, і 5-(третбутилперокси)-5-метил-1-гексен-3іну (VEP), від 3.19 до 17.13г, оптимально 3.19г, поміщають у круглодонний скляний реактор, обладнаний лопатевим змішувачем та конденсором зворотнього току. Після цього при помішуванні додають розчин координаційного комплексу Сu2+, де лігандом є кополімер вініл ацетату, 5третбутилперокси-5-метил-1-гексен-3-єн та малеїнового ангідриду (ОМС) 1,66г у спирті або диметилформаміді 67г. Температуру піднімають до 333К і реактор термостатують при цій температурі впродовж 8год. під потоком аргону. Конверсію мономе 5 51916 рів контролюють за допомогою гравіметричної технології до досягнення 60%. Після досягнення бажаної конверсії полімеризації розчинник усувають шляхом вакуумної дистиляції. Кінцевий продукт розчиняють в ацетоні, ретельно очищують багатостадійним осадженням у гексані та осушують до стабільної маси у вакуумі. Мономери: 1) 5-(третбутилперокси)-5-метил-1гексен-3-ін (VEP) синтезують згідно із технологією [Synthesis of dimethylvinylethynilmethyltertbutylperoxide / M.R. Vilenskaya, D.S. Karamov, E.I. Sorokin, V.A. Puchin, G.A. Petrovskaya // Khimicheskaya Promishlennost' - 1979. - № 7. - P. 15-16], після синтезу очищують шляхом вакуумної дистиляції до набуття наступних характеристик: d420=0.867 (ref. 0.8670); dd2014480 (ref. 1.4482), 2) диметиламіноетилметакрилат фірми Aldrich використовують без попередньої очистки. 6 Функціональний олігоелектроліт, що дає найвищу ефективність трансформації, це кополімер розгалуженої структури. Він складається із олігоелектролітів аніонної природи у якості каркасу та від одного до трьох бокових ланцюгів катіонної природи. Комбінація цих ланцюгів у структурі молекули забезпечує контрольовану розчинність у широкому діапазоні значень рН, велику поверхневу активність та здатність формувати стабільні інтерполіелектролітні комплекси у водних розчинах. Загальна структура функціонального олігоелектроліти розгалуженої структури, що показує найвищу ефективність трансформації і використовується для приготування поліплексів зображена на Фіг.1. Це кополімер розгалуженої структури, деякі характеристики якого представлені у Табл. 1: Таблиця 1 Характеристики олігоелектролітів розгалуженої структури, що показують найвищу ефективність доставки нуклеїнових кислот в клітини дріжджів Характеристики каркасу Вміст мономерних ланок в олігоелектроліті, %. VA VEP МА 22,0 34,0 44,0 22,0 34,0 44,0 22,0 34,0 44,0 Вміст мономерних ланок в олігоелектроліті, %. VEP DMAEMA 7,5 92,5 15,6 84,4 34,0 66,0 R [Сu2+], % на основний ланцюг 99,5 99,5 99,5 1,1 1,1 1,1 Характеристики мікроструктури lVA lVEP LMA 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Характеристики бічних ланцюгів Характеристики мікроструктури lVEP 1,02 1,07 1,22 lDMAEMA 14,8 4,94 2,30 R 7,5 14,6 27,8 , mN/m 31,5 32,8 35,5 l - середня довжина блоків відповідної мономерної ланки, R – кількість блоків однакових мономерних ланок на 100 ланок у кополімері. DMAEMA - диметиламіноетилметакрилат ВЕП - 5-(третбутилперокси)-5-метил-1-гексен-3-ін VA - вінілацетат МА- малеїновий ангідрид Олігоелектроліт такої структури синтезують шляхом контрольованої радикальної полімеризації, ініційованої олігопероксидним комплексом металу, структура якого зображена на Фіг.2, у середовищі полярного органічного розчинника. Такі макроініціатори радикальних реакцій діють за низьких температур та забезпечують прищеплення полімерних ланцюгів відповідної довжини, реакційної здатності та із наявністю специфічних функціональних груп. ОМС (ОМК) - олігопероксидний металокомплекс -це координаційний комплекс Cu2+ та олігопероксиду кополімеру вінілацетату, 5третбутилперокси-5-метил-1-гексен-3-ен та малеїнового ангідриду. Початковий олігопероксид та ОМС синтезують, як описано [Kinetic Features And Molecular Weight Characteristics Of Terpolymerization Products Of The Systems Based On Vinyl Acetate And 5-Tert-Butyl-Peroxy-5-Methyl-1Hexene-3-Yne / Zaichenko A.S., Voronov S.A., Shevchuk O.M., Vasilyev V.P., Kuzayev A.I. // Journal Of Applied Polymer Science. - 1997. - Vol. 67. - P. 1061-1066; Surface- Active Metal-Coordinated Oligoperoxidic Radical Initiators 1. Interrelation Between Microstructure Of Ditertiary Oligoperoxides And Their Ability ToForm Stable Metal Complexes/ Zaichenko, N. Mitina, M. Kovbuz, I. Artym, S. Voronov..// Journal of Polymer Science. Part A. 2000 - Vol. 38. - p. 516-527] Найкращі результати по доставці нуклеїнових кислот у клітини дріжджів показують розгалужені олігоелектроліти, описані вище, і введені за наступною схемою: 7 51916 суміш олігоелектроліту із нуклеїновою кислотою, що мала би проникнути у клітини, додають до неохолодженого або охолодженого до температури від -20 + 20 С ( 5 С) осаду клітин дріжджів на експоненційній стадії росту, зібраних при оптичній густині культури 0,005 до 0,9 при довжині хвилі 580-620нм, із подальшим тепловим шоком при температурі від 25 до 55 С протягом від 0,001сек до 30хв., та холодовим шоком від -20 до +30 С протягом від 0,001сек до 36год. Для термостійких дріжджів температура теплового шоку може визначатися в залежності від оптимальної температури росту дріжджів. Через період часу від 0,001сек до 36год. до клітин додають культуральне середовище і дріжджі ростуть впродовж від 0,001сек до 42год без селективного маркера за оптимальних умов культивації, або умов близьких до оптимальних, або при зниженій або підвищеній температурі. Для дріжджів Hansernda polymorpha оптимальними умовами культивації є 37 С при перемішуванні з швидкістю 200об/хв. Після цього клітини висівають на селективне середовище, якщо проводять трансформацію, або неселективне середовище, якщо введена нуклеїнова кислота не містить селективного маркера. Запропонований спосіб введення нуклеїнових кислот не потребує спеціального обладнання, попередньої обробки клітин, приготування компетентних клітин. Ефективність доставки нуклеїнових кислот у клітини дріжджів Hamenula polymorpha (штам NCYC 495) із застосуванням запропонова 8 ного способу є у 2 рази вищою за ефективність електропорації, у 15 разів вищою за традиційну Li/ацетатну доставку та 79 разів вищою за доставку за допомогою поліетиленгліколю. Доставка нуклеїнових кислот із використанням розгалуженого поліетиленіміну від компанії Sigma-Aldrich, що є найближчим молекулярним аналогом запропонованого способу, але для доставки нуклеїнових кислот у клітини ссавців і не використовується для клітин дріжджів, є 28 раз менш ефективною за доставку із використанням запропонованого способу. Для підтвердження статистичної достовірності у різниці ефективності трансформації із застосуванням різним способів обчислюють коефіцієнт Ст'юдента. Ефективність доставки нуклеїнових кислот у клітини дріжджів випробовувалася в залежності від тривалості кожної стадії, від 1сек. до 72 годин, концентрації досліджуваних олігоелектролітів, від 0,0001 до 100 мікрограм електроліту на 1 мікрограм нуклеїнових кислот, та температури від –20 С до 99/100 С, див. таблицю 2. Окрім того, випробовували вплив ультразвукових коливань різної частоти - від 14кГц до 165кГц, різної просторової спрямованості та в різних середовищах: повітря, вода, водні розчини, розчини органічних сполук, на доставку нуклеїнових кислот у клітини дріжджів. Більшість з випробуваних варіантів наведено у таблиці 2. Таблиця 2 Характеристика різних схем введення лінійних та розгалужених олігоелектролітів до клітин дріжджів (на прикладі дріжджів Hamenula polymorpha) Спосіб введення Електропорація Хімічне Полістилснгліколь Поліетиленімін Лінійні олігоелектроліти Лінійні олігоелектроліти Лінійні олігоелектроліти Розгалужені олігоелектроліти Розгалужені олігоелектроліти Розгалужені олігоелектроліти Опис При 1.5-2,1kV/см. 128Ом, 50 F введення за допомогою іонів Li та ацетату, за класичною процедурою Введення за допомогою полі етиленгліколю в сферопласти дріжджів Введення за способом, що використовується для доставки в клітини ссавців. Нуклеїнова кислота додавалась у олігослектроліту до введення цієї суміші до клітин дріжджів Нуклеїнова кислота додавалась до клітин дріжджів майже одночасно з олігоелектролітом (різниця в часі до 1хв.) Олігоелектроліт вводився до сумішінуклеїнової кислоти та клітин дріжджів Нуклеїнова кислота додавалась до олігоелектроліту до введення цієї суміші до клітин дріжджів Нуклеїнова кислота додавалась до клітин дріжджів майже одночасно з олігоелектролітом (різниця в часі до 1хв.) Олігоелектроліт вводився до суміші нуклеїнової кислоти та клітин дріжджів Параметри отриманого результату, кількість клітин дріжджів з введеною нуклеїновою кислотою, у.о. 1 0,133 0,0126 0,071 0,9 0,91 0,7 2,1 2 1,8 9 51916 Запропонований спосіб доставки володіє унікальними перевагами, такими як швидкість - уся процедура триває всього 30хв., зручність - немає потреби у приготуванні спеціально оброблених компетентних клітин, процедура доставки нуклеїнових кислот передбачає лише додавання олігоелектролітів до осаду клітин із подальшим тепловим/холодовим шоком, або й без нього. При цьому, нуклеїнова кислота може додаватися до олігоелектроліту, як перед додаванням його до дріжджових клітин, так додаватися до клітин під Комп’ютерна верстка А. Крижанівський 10 час, або навіть після додавання олігоелектроліту до клітин дріжджів.. Запропонований спосіб доставки є у 5-60 разів ефективніший, ніж хімічна трансформація та у 2-6 разів ефективніший, ніж електропорація. Він не потребує використання дорогого обладнання та реактивів. Окрім того, запропонована корисна модель є ефективною і у випадках, коли використовують види дріжджів, несприйнятливі до трансформації. Представлені результати підтверджують передбачуваний технічний результат. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601