Стрес-толерантна трансгенна рослина пшениці

1. Стрес-толерантна рослина пшениці, яка відрізняється тим, що дана рослина пшениці була трансформована молекулою нуклеїнової кислоти, що кодує орнітин-аміно-трансферазу (ОАТ). 2. Стрес-толерантна рослина пшениці за п. 1, яка відрізняється тим, що молекулою нуклеїнової кислоти є молекула кДНК, яка має нуклеотидну послідовність, в основному, відповідну до тієї, що показана на фіг. 2 (SEQ ID N0:1), або її біологічно активний фрагмент. 3. Стрес-толерантна рослина пшениці за п. 1, яка відрізняється тим, що, порівняно з нетрансформованими рослинами пшениці, дана рослина має підвищену здатність протистояти стресу, вид якого вибраний з переліку, що включає стрес від засухи, сольовий стрес, стрес, викликаний обезводненням, тепловий стрес, стрес, викликаний дією холоду, стрес від замерзання, стрес, викликаний відстійною водою, стрес від нанесення місцевого пошкодження, стрес від механічної дії, стрес в результаті окислення, озоновий стрес, стрес від дії сильного освітлення, стрес від дії важких металів, стрес, викликаний нестачею живильних речовин, стрес від дії токсичних хімічних речовин. 2 (19) 1 3 90279 4 13. Конструкція нуклеїнової кислоти за п. 11, яка відрізняється тим, що вказаним промотором є убіквітарний промотор. 14. Конструкція нуклеїнової кислоти за п. 11, яка відрізняється тим, що молекулою нуклеїнової кислоти є молекула кДНКА, яка має нуклеотидну послідовність, що, в основному, відповідає послідовності, показаній на фіг. 2 (SEQ ID N0:1), або її біологічно активний фрагмент. 15. Спосіб отримання трансгенної рослини пшениці з індукованою або посиленою толерантністю до солі, при цьому спосіб включає операції, при яких: a) трансформують тканину рослини або клітину рослини пшениці молекулою нуклеїнової кислоти, яка кодує орнітин-аміно-трансферазу (ОАТ); b) регенерують тканину або клітину в цілій рослині і с) забезпечують експресію ОАТ в регенерованій рослині протягом часу і при умовах, достатніх для індукції або посилення толерантності рослини до вмісту солі більш ніж 100 мМ. Дана заявка на видачу патенту на винахід заснована і включає домагання на переваги попередньої заявки на видачу патенту Австраліі №2004904326, поданої 3 серпня 2004 року. Даний винахід відноситься до трансгенних рослин пшениці. Зокрема, даний винахід відноситься до трансгенної рослини пшениці з підвищеною толерантністю до дії навколишнього середовища, наприклад, сольової дії. Сільськогосподарське виробництво в усьому світі стикається із прискореними темпами зростання загрози підвищення осолонення грунту (процентного вмісту солі у грунті). Із збільшенням населення і зменшенням орної землі особливої важливості набуває постановка і вирішення задачі повного використовування досягнень біотехнології рослин для підвищення врожайності сільськогосподарських культур, зокрема зернових. Щоб знизити згубний вплив осолонення грунту на розвиток рослинництва, необхідно вирішити проблему створення різновидів рослин, наприклад, зернових злаків, толерантних до сольової дії. Були зроблені численні спроби селекції рослин з підвищеною толерантністю до сольової дії. Наприклад, традиційна гібридизація диких видів забезпечила отримання нових різновидів пшениці, в деякій мірі толерантних до сольової дії. Проте, традиційна гібридизація є дуже повільним процесом, якщо йдеться про утворення нових різновидів зернових культур, при цьому, обмежені можливості зародкової плазми щодо толерантності до дії навколишнього середовища і гібридна (перехресна) несумісність між видами з віддаленими родинними зв'язками створюють додаткові проблеми для традиційних процесів гібридизації. Крім того, толерантність до сольової дії у рослин, що успішно пройшли стадію гібридизації, все ще залишається відносно низькою, якщо прийняти до уваги, що стійкості комерційних видів сягає не більш ніж до 100мМ солі. Сольовий стрес, викликаний зниженням водного потенціалу в клітинах уражених рослин, а також надмірними іонами натрія, які несприятливо впливають на важливі біохімічні шляхи в клітинах рослин. Не так давно почали проводитися дослідження для розробки способів вирішення на молекулярному рівні проблеми створення видів зернових культур з підвищеною толерантністю до сольової дії. Зібрані результати експериментальних досліджень і теоретичні висновки дають можливість припустити, що механізм, який, ймовірно, зумовлює толерантність рослин до сольової дії, полягає в накопиченні сумісних низькомолекулярних осмолитів, наприклад, поліолів/цукрів, специфічних амінокислот і онієвих сполук. Численні дослідження зв'язують накопичення проліну в рослинах із збільшеною толерантністю до сольової дії, а також із збільшеною толерантністю до обезводнення, дії високих і низьких температур, токсичності важких металів, патогенних інфекцій, анаеробіозу, дефіциту живильних речовин, атмосферних викидів і ультрафіолетового випромінювання (див., наприклад, Stewart & Lee, 1974, Planta, 120: 279-289; Briens & Larher, 1982, Plant, Cell & Environ., 5: 287-292; Barnett & Naylor, 1966, Plant Physiol., 41: 1222-1230; Boggess et al., 1976, Aust. J. Plant Physiol., 3: 513-525; Jones et al., 1980, Aust. J. Plant Physiol., 7: 193-205; Katz & Tal, 1980, Ζ. Pflcmzenphysiol. Bd., 98: 283-288; Treichel, 1986, Plant Physiol., 67: 173-181; Thomas et al., 1992, Plant Physiol. 98: 626-631). Дослідження, проаналізовані в роботах Hare і Cress (1997), показують, що протягом того періоду часу, коли рослина відчуває на собі дію навколишнього середовища, підвищення рівня проліну в рослині асоціюється з усуненням негативної фізіологічної дії. Наприклад, аналіз результатів експериментів, зібраних на багато яких етапах дослідження, дає можливість припустити, що накопичення проліну може сприяти захисту мембран клітин рослин і поліпептидів від згубного впливу неорганічних іонів і екстремальних температур. Концентрація проліну в клітині рослини може бути збільшена шляхом зростання утворення проліну та/або шляхом зменшення деградації проліну. Існують два шляхи утворення проліну в клітині рослини. Це шлях глутамату і шлях орнітіну. Було виказано припущення, що пролін утворюється в молодих рослинах Arabidopsis thaliana з глутамату, або орнітіну в доспілих рослинах, або при звичайному домінуванні шляху глутамату під час стресу (несприятливої дії навколишнього середовища) (див., наприклад, Roosens et al., 1998, Plant Physiol., 117:263-271). 5 Деякі гени, які кодують ферменти, що беруть участь в біосинтезі специфічних осмолитів, наприклад проліну, були введені в дводольні рослини тютюну. Проте, не дивлячись на те, що регенеровані рослини тютюну, дійсно, показали часткову толерантність до сольового стресу, (див., наприклад, Tarczynski et al., 1993, Science, 259: 508-510; Kishor et al., 1995, Plant Physiol., 108:1387-1394; Lilius et al., 1966, Biotech., 14:177-180), ці дослідження не були продовжені. Більш важливо відзначити, що якщо на тютюнові, як дводольній рослині, проводилися хоч якісь дослідження, направлені на його удосконалення, то питання про залучення генів в біосинтез осмолитів, наприклад проліну, у зв'язку з такою рослиною, як пшениця, взагалі не ставилося. Отже, існує насущна потреба в створенні промислових сортів пшениці, які могли б протистояти стресу (шкідливому впливу навколишнього середовища). Винахідники несподівано дійшли висновку, що введення в пшеницю молекули нуклеїнової кислоти, що кодує (визначає генетичний код) орнітінаміно-трансферазу (ОАТ), дає можливість отримати трансгенну пшеницю з індукованою або збільшеною толерантністю до стресу. Отже, якщо сформулювати задачу в найбільш загальному вигляді, даний винахід направлений на створення стрестолерантної рослини пшениці і способу захисту даної рослини. В способі використовується молекула нуклеїнової кислоти, яка кодує орнітін-амінотрансферазу (ОАТ). Першою особливістю даного винаходу є створення стрес-толерантної рослини пшениці, при цьому дана рослина пшениці була трансформована молекулою нуклеїнової кислоти, яка кодує орнітін-аміно-трансферазу (ОАТ). Другою особливістю даного винаходу є створення способу захисту рослини пшениці від стресу, який включає операцію введення молекули нуклеїнової кислоти в рослину пшениці, при цьому дана молекула нуклеїнової кислоти кодує орнітінаміно-трансферазу (ОАТ). В одному з прикладів здійснення даного винаходу тип стресу відбирають з переліку стресів, спричинення яких складається з таких чинників як засуха, сіль, обезводнення, спека, холод, замерзання, застійні води, пошкодження (порізи, насічки), механічна дія, окисненням, озон, світловий ефект, важкі метали, брак живильних речовин і токсичні хімічні речовини. Більш переважним у зв'язку із даним винаходом є перелік стресів, що спричинені сіллю, морозом або засухою. Найбільш переважними чинниками стресів у зв'язку з даним винаходом є: наявність солі в кількості більш ніж 100мМ, або температура нижча за 0°С. Молекулою нуклеїнової кислоти може бути комплементарна дезоксирибонуклеїнова кислота (кДНК) (cDNA), рибонуклеїнова кислота (PHK)(RNA) або їх гібридна молекула. Переважно, молекулою нуклеїнової кислоти є молекула кДНК (cDNA), що кодує орнітін-аміно-трансферазу (ОАТ). Найбільш переважною є умова, при якій молекула кДНК (cDNA) має нуклеотидну послідовність, що, в єстві, відповідає послідовності, показаній на Фіг.2, (SEQ ID NO:1), або її біологічно активному фрагменту. 90279 6 Молекула нуклеїнової кислоти може бути з'єднана з геномом молекули-господаря або існувати у вигляді екстрахромосомного елемента. Молекула нуклеїнової кислоти орнітін-амінотрансферази (ОАТ) може бути виділена з будьякого виду рослин. Переважно, такою рослиною є Arabidopsis thaliana. Рослина пшениці, трансформована молекулою нуклеїнової кислоти орнітін-амінотрансферази (ОАТ), може бути представлена будь-яким різновидом пшениці. Переважно, таку пшеницю відбирають з групи, що складається з Triticum aestivum і Triticum durum. Третьою особливістю даного винаходу є створення трансгенної рослини пшениці, матеріалу рослини, насіння (зерна на посів) або її потомства, що включає молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує орнітін-аміно-трансферазу (ОАТ), при цьому експресія даної молекули нуклеїнової кислоти має своїм результатом трансгенну рослину, матеріал рослини, насіння або потомство, яке здатне виростати за наявності 100мМ солі. Четвертою особливістю даного винаходу є створення генно-інженерної конструкції нуклеїнової кислоти, що включає промотор, виділений з рослини, і ген орнітін-аміно-трансферази (ОАТ) відповідно до даного в цьому документі визначення. Промотор може бути визначальним (складовим), убіквітарним (повсюдним), стресстимулюючим (індуцибельним), тканиноспецифічним і контрольованим в процесі розвитку. Переважним промотром є убіквітарний промотор. В одному з прикладів здійснення винаходу конструкція відповідає зображенню на Фіг.1. Проте, слід взяти до уваги, що модифіковані і варіантні форми конструкцій можуть бути отримані in vitro за допомогою хімічної або ферментної обробки, або in vitro, з використанням методу рекомбінантних ДНК. Такі конструкції можуть відрізнятися від конструкцій, розкритих в даному документі, наприклад, унаслідок однієї або декількох нуклеотидних замін, делецій або інсерцій, але вони повинні зберігати біологічну активність конструкції або молекули нуклеїинової кислоти по даному винаходу. Ще в одному прикладі здійснення трансгенна пшениця додатково містить відрегульовану ендогенну пролін-деградуючу систему. Трансгенна рослина може додатково містити полінуклеотид, кодуючий селектабельний маркер, при цьому він функціонально пов'язаний з нуклеотидом, який кодує ОАТ, сприяючи, таким чином, селекції трансгенної пшениці. Ще в одному прикладі здійснення винаходу розкритий харчовий продукт, приготований з трансгенної пшениці по даному винаходу. Четвертою особливістю даного винаходу є спосіб виробництва трансгенної пшениці з індукованою або підвищеною толерантністю до солі, при цьому даний спосіб включає операції, при яких: a) трансформують тканину рослини або клітину пшениці за допомогою молекули нуклеїнової кислоти, яка кодує орнітін-аміно-трансферазу (ОАТ); 7 b) регенерують тканину або клітину в об'ємі цілої рослини; c) забезпечують експресію ОАТ в регенерованій рослині протягом періоду часу і на режимах, достатніх для індукції і підвищення толерантності рослини до вмісту солі вище за 100мМ. Ще в одному прикладі здійснення винаходу спосіб додатково включає операцію трансформації пшениці за допомогою полінуклеотиду, що кодує селектабельний маркер, який функціонально пов'язаний з молекулою нуклеїнової кислоти, яка кодує орнітін-аміно-трансферазу ОАТ, сприяючи, таким чином, відбору (селекції) трансгенної пшениці. Ще в одному прикладі здійснення спосіб додатково містить операцію регулювання активності ендогенної пролін-деградуючої системи в трансгенній рослині пшениці. Фіг.1 - Показана конструкція нуклеїнової кислоти, що містить убіквіитарний промотор, зв'язаний з ОАТ. Фіг.2 - Показана нуклеотидна послідовність ОАТ. Фіг.3 - Показана амінокислотна послідовність ОАТ. Фіг.4 - Показані високий, середній і низький рівні сольової толерантності для лінії 2490.1. Трансгенна лінія деградує в трьох певних групах. Фіг.5 - Показано вплив на розвиток насінного матеріалу для трансгенних рослин (2490.1 і 2721.1) і їх відповідних контрольних різновидів (Westonia і Carnamah) через 13 днів після одного заморожування. Тлумачення термінів Подальший опис містить цілий ряд термінів, використовуваних в технології отримання рекомбінантної ДНК. Якщо інше не вказане, всі технічні і наукові терміни, використані в даному описі, мають значення, доступні для розуміння кваліфікованим фахівцем в тій області техніки, до якої відноситься даний винахід. Загальні визначення для багато яких термінів, використаних в даному винаході, кваліфікований фахівець може знайти в наступних посиланнях: Singleton, et al., Dictionary Microbiology and Molecular Biology(2nd ed. 1994) (Словник термінів з мікробіології і молекулярної біології); Cambridge Dictionary Science and Technology (Walker ed., 1988) (Кембріджський науково-технологічний словник); Glossary Genetics, 5th Ed., Rieger, R., et al. (eds.), Springer Verlag (1991) (Глосарій з генетики); і Hale & Marham, Harper Collins Dictionary Biology (1991) (Біологічний словник). Проте, для ясності викладу, націленого на повне розуміння опису і формули винаходу, в даний документ включено наступне тлумачення деяких термінів. Термін "клітина" відноситься до будь-якого виду клітин рослин, включаючи, але не обмежуючись таким поняттями, як соматичні клітини, гамети (статеві клітини) і ембріони. "Ембріон" відноситься до спорофітичної рослини до початку проростання. Ембріони можуть бути сформовані фертилізацією (заплідненням) статевих клітин методом статевого схрещування або самозапилення. "Статеве схрещування" - це 90279 8 запилення однієї рослини іншою. "Самозапилення" - це спосіб отримання зерна методом самозапилення, тобто, коли пилок і яйцеклітина - суть похідні однієї і тієї ж рослини. Термін "зворотне схрещування" відноситься до перетину гібридної рослини F1 з одним із її батьків. Звичайно, зворотний перетин використовується для того, щоб перенести гени, що надають просто успадковану, у високому ступені успадковувальну характерну ознаку в природжену лінію. Природжена лінія названа періодичним батьком. Джерелом заданої характерної ознаки є батько-донор. Після статевого схрещування донора і періодичних батьків відбираються гібридні рослини, F, які володіють заданою характерною ознакою батька-донора, і повторно схрещуються (тобто, піддаються зворотному схрещуванню) з періодичним батьком або природженою лінією. Ембріони можуть бути також сформовані методом "ембріонального соматогенезу" і "клонування". Соматичним eмбріогенезом є безпосереднє або опосередковане отримання ембріонів або з клітин, тканин, або з органів рослин. Опосередкований соматичний ембріогенез відрізняється приростом мозолястого наросту і утворенням ембріонів на поверхні даного мозолястого наросту. Безпосередній соматичний ембріогенез - це утворення безстатевого ембріону від однієї клітини або групи клітин на тканині експлантата, минаючи етап утворення мозолястого наросту. Оскільки аномальні рослини проявляють тенденцію бути похідними від мозолястого наросту, перевага віддається прямому соматичному ембріогенезу. Загальний термін "зерно; насінина" означає наявність ендосперми в яйцеклітинах рослини. Фраза "введення послідовності нуклеїнової кислоти" відноситься до введення послідовностей нуклеїнової кислоти за допомогою рекомбінантних засобів, включаючи, але, не обмежуючись трансформацію через опосередкування Agrobacterium, біолістичні методи, електропорація (електроімпульсне відкриття клітинних пір), in planta - технології і тому подібне. Термін "нуклеїнові кислоти" є синонімом понять ДНК (DNA), РHК (RNA) і полінуклеотиди. Рослина, що містить введену послідовність нуклеїнової кислоти, в цьому документі отримала позначення R, генеруючої рослини. Рослини R1 можуть бути також отримані в результаті клонування, статевого схрещування або самозапилення рослин, в які були введені нуклеїнові кислоти. Назви "молекула нуклеїнової кислоти" або "молекула полінуклеїнової кислоти" в даному описі відносяться до дезоксирибонуклеїнової кислоти і рибонуклеїнової кислоти в усіх їх формах, тобто, до одноланцюгової - і дволанцюгової ДНК (DNA), кДНК (cDNA), мРНК (mRNA) і їм подібним речовинам. Назва "дволанцюгова молекула ДНК (DNA)" відноситься до полімерної форми дезоксирибонуклеотидів (аденіну, гуаніну, тиміну або цитозіну) у вигляді її нормальної дволанцюгової спіралі. Цей термін відноситься тільки до первинної і вторинної структури молекули і не розповсюджується на будь які специфічні третинні форми. Таким чином, даний термін відноситься до поняття дволанцюго 9 вої ДНК (DNA), знайденій, зокрема, в лінійних молекулах ДНК (DNA) (наприклад, фрагменти рестрикції), вірусах, плазмідах і хромосомах. При розгляді структури специфічних дволанцюгових молекул ДНК (DNA) в даному документі послідовності можуть бути описані відповідно до нормативного документу про представлення тільки послідовності у від 5' до 3' напрямі уздовж не транскрибованого ланцюга ДНК (DNA) (тобто, ланцюга, що має послідовність, схожу з мРНК (mRNA)). Послідовність ДНК (DNA) "відповідає" послідовності амінокислоти, якщо трансляція послідовності ДНК (DNA), відповідно до генетичного коду, дає послідовність амінокислоти (тобто, послідовність DNA "кодує" послідовність амінокислоти). Одна послідовність ДНК (DNA) "відповідає" іншій послідовності ДНК (DNA), якщо обидві послідовності кодують одну і ту ж послідовність амінокислоти. Дві послідовності ДНК (DNA) є "реально подібними", якщо як мінімум близько 85%, переважно, як мінімум близько 90%, і найбільш переважно, як мінімум близько 95%, нуклеотидів сумісні на заданій довжині послідовностей ДНК (DNA). "Гетерологічна" область або домен конструкції ДНК (DNA) - це сегмент ДНК (DNA), що ідентифікується в межах більшої молекули ДНК (DNA), яка не знайдена в природі в асоціації з цією більшою молекулою. Отже, коли гетерологічна область кодує ген рослини, даний ген, як правило, оточений ДНК (DNA), яка не примикає до ДНК (DNA) геному рослини в геномі первинного організму. Іншим прикладом гетерологічної області є конструкція, в якій сама кодуюча послідовність не знайдена в природі (наприклад, кДНК (cDNA), в якій, кодуюча послідовність геному містить інтрони або синтетичні послідовності, що мають кодони, відмінні від нативного гена). Як визначено в даному документі, алельні варіації або мутаційні явища, що природно відбуваються, не є джерелом виникнення гетерологичної області ДНК (DNA). "Кодуюча послідовність" - це послідовність кодонів в рамці зчитування, яка відповідає або кодує послідовність протеїну або послідовність пептиду. Дві кодуючі послідовності відповідають одна одній, якщо ці послідовності або їх комплементарні послідовності кодують ті ж самі послідовності амінокислоти. Кодуюча послідовність в асоціації з відповідними регуляторними послідовностями може бути транскрибована і трансльована в поліпептиді in vivo. Сигнал поліаденілування і послідовність закінчення транскрипції звичайно повинні розміщуватися від 3' до кодуючої послідовності. Термін "гомологи" поліпептиду відноситься до ДНК (DNAs) або РНК (RNAs) і їх полімерів в одне або дволанцюговій формі, що містить відомі аналоги природних нуклеотидів, які мають зв'язуючі властивості, подібні відповідній згаданій нуклеїновій кислоті, і метаболізовані по типу природних нуклеотидів. Термін "Трансгенні рослини" означає рослини, в які нуклеїнова кислота була введена по рекомбінантній технології, наприклад, через вектори, що містять нуклеїнові кислоти. "Вектор" - це компози 90279 10 ція нуклеїнової кислоти, яка може перетворювати, трансформувати або інфікувати клітину, створюючи, таким чином, умови, при яких клітина забезпечує експресію вектор-кодованих нуклеїнових кислот і в деяких випадках протеїнів, відмінних від тих, які є нативними відносно клітини, або за способом, який не є нативним відносно клітини. Вектор включає нуклеїнову кислоту (звичайно, РНК (RNA) або ДНК (DNA)), яка є результатом експресії клітини. Вектор факультативно включає матеріали, що сприяють введенню нуклеїнової кислоти в клітину, наприклад, ретровірусну частинку, ліпосому, протеїнове покриття і подібні речовини. Вектори містять послідовності нуклеїнової кислоти, які забезпечують їх розповсюдження і відбір в бактеріях або інших організмах, відмінних від рослин. Для докладного ознайомлення з описом векторів і молекулярних біотехнологій див.: Current Protocols in Molecular Biology (Протоколи з молекулярної біології), Ausubel, et al., (eds.), Current Protocols (Поточні протоколи), joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc. (through and including 1998 Supplement) (Ausubel). "Плазміди" є одним з видів векторів, що включають ДНК "DNA", які здатні до реплікації в межах клітини рослини, або як додаткова (зайва) хромосома, або як частина хромосоми(хромосом) клітини рослини, і позначені нижнім регістром "р", якому передують та/або за яким слідують великі букви та/або числа. Згадані в даному документі початкові плазміди комерційно доступні, можуть бути або придбані і використані без обмежень, або отримані з комерційно доступних плазмід з використанням методик, розкритих в даному документі та/або відповідно до способів з рівня техніки. Після ознайомлення з подальшим описом для кваліфікованого працівника в даному виді діяльності стане очевидною можливість використовування рівноцінних плазмід з рівня техніки замість плазмід, описаних в даному документі. Визначення "полігенний експресуючий кластер" відноситься до послідовності нуклеїнової кислоти в межах вектора, яка повинна бути транскрибована, і контролюючої (контрольної) послідовності для надання напрямку експресії. Термін "контролюючі послідовності" відноситься до послідовностей ДНК "DNA", необхідних для експресії функціонально зв'язаного нуклеотіду, кодуючого послідовність в специфічній клітинігосподарі. Контролюючі послідовності, придатні для забезпечення експресії в прокаріотах, включають, наприклад, оріджини реплікації, промотери, рибосома-зв'язуючі сайти і сайти закінчення транскрипції. Контролюючі послідовності, придатні для забезпечення експресії в зукаріотах, включають, наприклад, оріджини реплікації, промотери, рибосома-зв'язуючі сайти, сигнали поліаденілації і гени-підсилювачі (енхансери). Однією з найважливіших контролюючих послідовностей є промотор. "Промотор" - це ранжируваний ряд контролюючих послідовностей нуклеїнової кислоти, які направляють транскрипцію нуклеїнової кислоти. В контексті даного опису, промотор включає необхідні послідовності нуклеїнових кислот біля сайту 11 транскрипції, як, наприклад, у випадку з промотором типу полімерази II, елемента ТАТА. Як альтернативи, промотор може включати периферичні елементи знхансерів (підсилювачів) і репрессорів (інгібіторів), які можуть бути розміщені в кількості декількох тисяч окремих базових пар на ділянці від початкового сайту транскрипції. Промотор може бути як гомологічним, тобто виникаючим природно, з метою забезпечення направлення експресії заданої нуклеїнової кислоти, або гетерологічним, тобто виникаючим природно, з метою забезпечення направлення експресії нуклеїнової кислоти, похідної від гена іншої, ніж задана нуклеїнова кислота. Синтез-гени (на основі злиття кліток) з послідовностями гетерологічного промотору є переважними, наприклад, для регулювання експресії кодованих протеїнів. "Основний" промотор це промотор, який є активним у відібраному організмі при найбільш критичних умовах навколишнього середовища і біології розвитку організму. "Індуцибельний" промотор - це промотор, який у відібраному організмі регулюється чинниками навколишнього середовища і біології розвитку організму. Наведені нижче джерела інформації включають приклади промоторів з переліку вірусів рослин, наприклад, промотор 35S з мозаїчного вірусу (CaMV) цвітної капусти, як описано в Odell et al., (1985), Nature, 313:810-812, і промотори з генів, наприклад, рисовий актин (McElroy et al., (1990), Plant Cell, 163-171); убіквітин (Christensen et al., (1992), Plant Mol. Biol. 12:619-632; і Christensen, et al., (1992), Plant Mol. Biol 18:675-689); pEMU (Last et al., (1991), Theor. Appl. Genet. 81:581-588); MAS (Velten et al., (1984), EMBO J. 3:2723-2730); і mal.zе(кукурудзяний; маїсовий) гістон Н3 (Lepetit et al., (1992), Mol. Gen. Genet. 231:276-285; і Atanassvoa et al., (1992), Plant Journal 2(3):291300). Перелік додаткових регуляторних елементів, які можуть бути сполучені з ОАТ-полінуклеотідамі для забезпечення експресії в клітинах рослин, включає термінатори, послідовності поліаденілації і послідовності нуклеїнової кислоти, що кодують пептиди сигналів, які забезпечують локалізацію в межах клітини рослини або секрецію протеїну з цієї клітини. Дані регуляторні елементи і способи додавання або заміни таких елементів регуляторними елементами гена реплікази відомі з рівня техніки, і їх перелік включає, але не обмежується 3'-терминацією і/або зонами поліаденілації, наприклад, гена нопалін-синтази (nos) Agrobacterium tumefaciens (Bevan et al., (1983), Nucl. Acids Res. 12:369-385); геном II (PINII) інгібітору картопляної протеїнази (Keil, et al., (1986), Nucl. Acids Res. 14:5641-5650; і An et al., (1989), Plant Cell, 1:115122); і геном CaMV 19S (Mogen et al., (1990), Plant Cell, 2:1261-1272). Сигнал-послідовностями рослини, включаючи, але, не обмежуючись наведеним, є сигнал-пептид, що кодує послідовності ДНК (DNA)/PHK (RNA), які націлюють протеїни на позаклітинну матрицю клітини рослини (Dratewka-Kos et al., (1989), J. Biol. Chem. 264:4896-4900), Nicotiana plumbaginifolia інсерційний ген (DeLoose et al., (1991), Gene, 90279 12 99:95-100), сигнал-пептиди, які націлюють протеїни у вакуолю, подібно гену спораміну солодкої картоплі (Matsuka et al., (1991), PNAS, 88:834) і гену лектину ячменю (Wilkins et al., (1990), Plant Cell, 2:301-313), сигнал-пептиди, які змушують протеїни секретуватися за таким принципом, який характерний для PRIb (Lind et al., (1992), Plant Mol. Biol. 18:47-53), або альфа амулаза ячменю (BAA) (Rahmatullah et al. (1989), Plant Mol. Biol 12:119 і, таким чином, включені в даний документ методом посилання). Для вирішення технічної задачі, що лежить в основі створення даного винаходу, послідовність промотору зв'язана в його 3' кінцевій ділянці початковим (стартовим) кодоном трансляції кодуючої послідовності, і поширюється в 3'-5' напрямі для включення мінімального числа основ (баз) або елементів, необхідних для ініціації транскрипції на рівнях, які можна знайти по генетичному фону (над генетичним фоном). В межах послідовності промотору повинен бути знайдений сайт ініціації транскрипції (умовно визначуваний за допомогою картування нуклеазою S1), а також і протеїн-связуючі домени (послідовності консенсусу (узгодженості)), що відповідають за скріплення РНА (RNA) полімерази. "Екзогенний" елемент - це один з елементів, які, є чужорідними по відношенню до клітинигосподаря, або є гомологічними по відношенню до клітини-господаря, але в такому місцеположенні в межах клітини-господаря, в якому даний елемент, як правило, не виявляється. Термін "біологічна переробка (деградація; ферментація)" ДНК (DNA) відноситься до каталітичного розщеплювання ДНК (DNA) ензимом (ферментом), який діє тільки в певних місцеположеннях в ДНК (DNA). Такі ензими називаються ензимами рестрикції (обмеження) або ендонуклеазами рестрикції, а сайти в межах ДНК (DNA), де такі ензими розщеплюються, називаються сайтами рестрикції. За наявності множинних сайтів рестрикції в межах ДНК (DNA), в процесі біологічної переробки можуть бути отримані два або більш лінеаризованих фрагментів ДНК (DNA) (фрагментів рестрикції). Різні ензими обмеження, використовувані в даному технічному рішенні, комерційно доступні, а режими їх реакцій, кофактори, і інші вимоги, встановлені виробниками ензимів, цілком прийнятні для відтворення. Ензими обмеження, звичайно, позначаються абревіатурами, складеними з великої літери, за якою слідують інші літери, що позначають мікроорганізм, від якого кожний ензим обмеження був спочатку отриманий, а потім число, що позначає специфічний ензим. У принципі, біля 1мкg ДНК (DNA) перетравлюється (ферментується), приблизно, з 1-2 одиницями ензиму, приблизно, в 20мк1 буферного розчину. Відповідні кількості буферів і субстратів для певних ензимів рестрикції конкретизовані виготівником та/або добре відомі з рівня техніки. "Регенерація" або "виділення" даного фрагменту ДНК (DNA) з перевару рестрикції, звичайно, здійснюється за допомогою відділення продуктів біологічної переробки, які називаються "фрагментами рестрикції", на поліакриламіді або агароза 13 гелі шляхом електрофорезу, ідентифікації заданого фрагменту, виходячи з його рухливості щодо рухливості фрагментів маркера ДНК (DNA) відомої молекулярної ваги, вирізування (вилучення) ділянки гелю, яка містить заданий фрагмент, і виділення ДНК (DNA) з гелю, наприклад, методом електроелю(ці)ювання. Термін "лігування (зшивання)" відноситься до процесу формування зв'язків фосфодиефіру між двома фрагментами дволанцюгової ДНК (DNA). Якщо інше не передбачене, лігування здійснюється з використанням відомих буферів і режимів, що передбачають використовування 10 одиниць Т4 ДНК (DNA) лігази на 0,5мкg, приблизно, еквімолярних кількостей фрагментів ДНК (DNA), що підлягають лігуванню (зшиванню). "Олігонуклеотіди" - це одно- або дволанцюгові полідезоксинуклеотіди короткої довжини, які хімічно синтезовані з використанням відомих способів (із залученням, наприклад, хімічних технологій триефіру, фосфорамідиту або фосфонату), як, наприклад, описано у Engels et al., (1989), Agnew. Chem. Int. E . Engl 28:716-734. Після цього їх очищують, наприклад, з використанням поліакриламід-гелевого електрофорезу. В контексті даного винаходу термін "ланцюгова реакція полімерази" або "ЛРП" ("PCR") відноситься до способу ампліфікації заданої нуклеотидної послідовності in vitro, відповідно до опису винаходу за патентом США №4,683,195. У принципі, спосіб PCR залучає до процесу цикли синтезу подовжуючого (поширюючого) сегмента праймера, що повторюються, використовуючи два праймера олігонуклеотидів, здатні забезпечити гібридизацію, переважно, за шаблоном нуклеїнової кислоти. Як правило, праймери, використовувані в способі PCR, повинні служити доповненням до нуклеотидних послідовностей в межах шаблону (форми) на обох кінцях або примикати до нуклеотидної послідовності, яка підлягає ампліфікації, хоча праймери, додаткові до нуклеотидної послідовності, що підлягає ампліфікації, також можуть використовуватися. Wang et al., in PCR Protocols, pp. 70-75 (Academic Press, 1990); Ochman et al., in PCR Protocols, pp. 219-227; Triglia et al., (1988), Nucl. Acids Res. 16:8186. Термін "клонування PCR" відноситься до використовування способу PCR, з метою ампліфікації заданої специфічної нуклеотидної послідовності, яка є серед нуклеїнових кислот, з відповідної клітини або зразка тканини, включаючу повноцінну геномну ДНК (DNA) і кДНК (cDNA), транскрибовану з повноклітинної РНК (RNA). Frohman et al., (1988), Proc. Nat. Acad Set USA, 85:8998-9002; Saiki et al., (1988), Science, 239:487-492; Mullis et al., (1987), Meth. Enzymol. 155:335-350. Фраза "функціонально кодує" відноситься до утворення функціонального зв'язку між промотором і вторинною (повторною) послідовністю нуклеїнової кислоти, в якій послідовність промотору ініціює транскрипцію РНК (RNA), відповідну вторинній послідовності. Термін "потомство" відноситься до нащадків специфічної рослини (самоперетин; самосхрещування) або пари рослин (схильних до схрещування 90279 14 або зворотного схрещування). Нащадками можуть бути Fl, Fez або будь-які представники подальшої генерації. Звичайно, батьками є донор пилку і донор яйцеклітини, які схрещуються для отримання рослини-нащадка по даному винаходу. Термін "батьки" також відноситься до F1 батьків гібридної рослини по даному винаходу (рослини F2). Крім того, термін "батьки" відноситься до періодичного батька, який піддається зворотному схрещуванню з гібридними рослинами по даному винаходу, щоб отримати ще одну, іншу гібридну рослину по даному винаходу. Фраза, "створення трансгенної рослини" відноситься до отримання рослини відповідно до даного винаходу. Рослина генерується з використанням рекомбінантних технологій, тобто, клонування, соматичного ембріогенезу або будь-якої іншої технології, використовуваної кваліфікованими фахівцями для вирощування рослин. "Інтеграція" ДНК (DNA) може здійснюватися з використанням негомологічної рекомбінації, що слідує за мас-переносом ДНК (DNA) в клітини за допомогою мікроін'єкцій, біолістики, електропорації або ліпофекції. Також застосовуються альтернативні методи, наприклад гомологічна рекомбінація, і або ензим-рестрикції - опосередкована інтеграція (REMI), або з використанням транспозон, які можуть бути названі поліпшеними способами інтеграції. "Клонування" - це популяція клітин, отриманих від єдиної клітини або загального предка шляхом митозу (непрямого розподілу клітини). Термін "гомологи послідовності нуклеїнової кислоти" відноситься до дезоксирибонуклеотидам або рибонуклеотидам і їх полімерам в одно або дволанцюговій формі, що містять відомі аналоги природних нуклеотидів, які мають зв'язуючі властивості, подібні нуклеїновій кислоті, і є до деякої міри метаболізованими подібно природним нуклеотидам. Якщо інше не передбачене, специфічна послідовність нуклеїнової кислоти також побічно розповсюджується на традиційно змінені варіанти цього (наприклад, дегенеративні заміщення кодону) і додаткові послідовності, а також послідовність, вказану імпліцитно (побічно). Зокрема, дегенеративні заміщення кодону можуть бути досягнуті за допомогою генерації послідовностей, в яких третє місцеположення одного або декількох відібраних (або всіх) кодонів, заміняється залишками основного змішаного типу та/або залишком дезоксиінозину. (Ваtzеr et al., (1991), Nucleic Acid Res. 19: 5081; Ohtsuka et al., (1985), J. Biol. Chem. 260: 2605-2608; і Rossolini et al., (1994), Mol. Cell. Probes 8: 91-98). Термін "нуклеїнова кислота" використовується при дотриманні принципу його взаємозамінності з такими визначеннями, як ген, кДНК (cDNA) і мРНК (mRNA) кодована геном. Термін "гомолог амінокислотної послідовності" відноситься до протеїну з такою ж амінокислотною послідовністю. Кваліфікований фахівець може усвідомити, що критична амінокислотна послідовність знаходиться в межах функціонального доме 15 на протеїну. Таким чином, для гомологічного протеїну існує можливість володіння менш ніж 40% гомологією на довжині амінокислотної послідовності, але не більше ніж 90% гомологією в одному функціональному домені. На додаток до природних амінокислот гомологи також включають протеїни, де один або декілька залишків амінокислоти представляють собою штучний хімічний аналог відповідної природної амінокислоти, а також природних протеїнів. В даному документі амінокислоти можуть бути позначені або їх загальновідомими символами з трьох літер, або символом створеним однією літерою, рекомендованим офіційним органом - Комісією із питань біохімічної номенклатури (IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission). Нуклеотіди також можуть бути позначені їх загальновизнаними кодами з однієї букви. Термін "традиційно модифіковані варіанти" застосовується відносно до послідовностей нуклеїнової кислоти і амінокислоти. Відносно специфічних послідовностей нуклеїнової кислоти термін "традиційно модифіковані варіанти" застосовується до таких нуклеїнових кислот, які кодують ідентичні або в значній мірі ідентичні амінокислотні послідовності, або, якщо нуклеїнова кислота не кодує амінокислотну послідовність, вказаний вище термін відноситься до послідовностей, в значній мірі, ідентичних вказаним. Через дегенеративність генетичного коду(схильність до звироднілості), велика кількість функціонально ідентичних нуклеїнових кислот кодують будь-який заданий протеїн. Наприклад, кодони GCA, GCC, GCG і GCU всі кодують амінокислотний аланін. Тому в будь-якому місцеположенні (в будь-якій позиції), де аланін позначено кодоном, вказаний кодон може бути замінений будь-яким з відповідних кодонів, описаних без зміни кодованого поліпептиду. Такі варіації нуклеїнової кислоти отримали назву "варіації за умовчанням" і характеризуються однією з традиційно модифікованими варіаціями видоспецифічністю. Кожна показана в даному документі послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид, описує також і будь-яку можливу варіацію нуклеїнової кислоти за умовчанням. Кваліфікований в даній області фахівець розуміє, що специфічні нуклеїнові кислоти в кодоні (окрім AUG, який, як правило, є єдиним кодоном метионіну) можуть бути модифіковані для отримання функціонально ідентичної молекули. Відповідно, кожна варіація нуклеїнової кислоти за умовчанням, яка кодує поліпептид, є безумовною ознакою для кожної описаної послідовності. Що стосується послідовностей амінокислоти, то фахівець, кваліфікований в даній області знань, розуміє, що індивідуальні заміщення, делеції або доповнення до послідовності нуклеїнової кислоти, пептиду, поліпептиду або послідовності протеїну, яка змінює, додає або видаляє єдину амінокислоту або малий відсоток амінокислоти в кодованій послідовності, є "традиційно модифікованою варіацією", де зміна приводить до заміни амінокислоти хімічно подібною амінокислотою. Таблиці традиційної заміни, що надають функціонально подібні 90279 16 амінокислоти, добре відомі з сучасного рівня техніки. Кожна з наведених нижче шести груп містить амінокислоти, які є традиційними замінами одна одної: 1) Аланін (А), Серін (S), Треонін (Т); 2) Аспарагінова кислота (D), Глутамінова кислота (Е); 3) Аспарагін (N), Глутамін (Q); 4) Аргінін (R), Лізин (K); 5) Ізолейцин (І), Лейцин (L), Метіонін (М), Валін (V); 6) Фенілаланін (F), Тірозін (Y), Тріптофан (W). (Див., наприклад, Creighton, PROTEINS (1984)). В контексті даного винаходу терміни "трансформація" і "трансфекция" відносяться до процесу введення заданої нуклеїнової кислоти, наприклад, плазміди або вектора експресії, в клітини рослини, або в культуру, або до органів рослини за допомогою різноманітних технологій і технічних засобів, використовуваних фахівцями, працюючими в області молекулярної біології. Отже, клітина "трансформується" екзогенною ДНК, коли дана екзогенна ДНК вводиться всередину стінки клітини. Екзогенна ДНК може бути, а може і не бути інтегрована (ковалентно зв'язана) з хромосомною ДНК, формуючи геном даної клітини. Наприклад, в прокаріотах і дріжджах екзогенна ДНК може утримуватися на зпісомальному елементі, наприклад, на плазміді. Що стосується зукаріотичних клітин, стабільно трансформована клітина - це одна з клітин, в якій екзогенна ДНК успадковується дочірніми клітинами за допомогою реплікації хромосоми. Така стабільність демонструється здатністю зукаріотичної клітини формувати клітинні лінії або клони, що складаються з популяції дочірніх клітин, що містять екзогенну ДНК. Відомі численні способи введення чужих генів в рослини, які можуть бути використані для инсерції модифікованої нуклеїнової кислоти в клітинугосподаря, включаючи протоколи (схеми) біологічної і фізичної трансформації рослин. Див., наприклад, Miki et al., (1993), "Procedure for Introducing Foreign DNA into Plants" (Методи введення чужорідної ДНК в рослину), In: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology (В розділі: Способи молекулярної біології і мікробіології рослин), Glick і Thompson, eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pages 67-88. Вибір способу залежить від рослинигосподаря. Перелік способів включає способи хімічної трансфекції, наприклад, кальцийфосфат, мікроорганізмом-опосредковане перенесення гена, такого як Agrobacterium (Horsch et al., (1985), Science, 227:1229-31), шляхом електропорації, мікроін'єкції і біолістичного опромінювання. Відомі і застосовуються полігенні зкспресуючі кластери і вектори, а також методи культивування in vitro клітини рослини або трансформації тканини і регенерації рослин. Див., наприклад, Gruber et al., (1993), "Vectors for Plant Transformation (Вектори трансформації рослини)" In: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology (в розділі: Методи молекулярної біології і біотехнології), Glide і 17 Thompson, eds. CRC Press, Inc., Boca Raton, pages 89-119. Найбільш широко використовуваний спосіб введення вектора експресії в рослину базується на природній системі трансформації Agrobacterium. A tumefaciens і. A rhizogenes являються патогенними ґрунтовими бактеріями, які трансформують клітини рослин на генному рівні (генетично). Ті- і Ri-плазміди A tumefaciens і A. rhizogenes, відповідно, переносять гени, відповідальні за генетичну трансформацію рослин. Див., наприклад, Kado (1991), Crit. Rev. Plant Sci. 10: 1. Описи векторних систем Agrobacterium і способів Agrobaterium-опосередкованого перенесення гена дані в Gruber et al., supra; Miki et al., supra, і Moloney et al., (1989), Plant Cell Reports, 8:238. Так само ген може бути вставлений в область Т-ДНК (T-DNA) Ті- або Ri-плазміди, яка є похідною від A. tumefaciens або A. rhizogenes, відповідно. Таким чином, полігенні зкепресуючі кластери можуть бути сконструйовані по вказаному вище типу, використовуючи плазміди. Відомий цілий ряд контролюючих (контрольних) послідовностей, які, будучи зв'язаними з гетерологічною кодуючою послідовністю і трансформованими в організми господаря, проявляють відповідність в експресії гена по відношенню до специфічності тканини/органу оригінальної (початкової) кодуючої послідовності. Див., наприклад, Benfey and Chua (1989), Science, 244: 174-181. Добре підходять для використовування у вказаних вище плазмідах такі контролюючі (контрольні) послідовності, як промотори, що визначають листок-специфічну експресію гена в різних рослинах-мішенях. Інша доцільна для використовування контролююча послідовність включає промотор і термінатор гена нопалінсинтази (NOS). Промотор і термінатор NOS знаходяться в плазміді pARC2, що підтверджується американською колекцією видів культур (American Type Culture Collection), в якій вона присутня з позначенням АТСС 67238. Якщо така система використовується, вірулентний (вир) ген або з Ті- або з Ri-плазмідьі повинен бути також присутнім або разом з частиною Т-ДНК (T-DNA), або через бінарну систему, де вірулентний ген присутній на окремому векторі. Такі системи, вектори для їх використовування і способи трансформації клітин рослин описані в патенті США №4,658,082; патентній заявці США, рег. №913,914, поданій 1 жовтня 1986, відповідно до посилання в патенті США №5,262,306, виданому 16 листопада 1993 на ім'я Robeson et al.; і Simpson et al. (1986), Plant Mol. Biol. 6: 403-415 (на яку також є посилання в патенті '306); вся згадана інформація включена в даний документ в повному об'ємі методом посилання. Після того, як плазміди сконструйовані, вони можуть бути поміщені в А. rhizogenes або A. tumefaciem і дані вектори - використані для трансформації клітин видів рослин, звичайно, чутливих до осолонення грунту. Деякі інші трансгенні рослини також підпадають під даний винахід, включаючи, але, не обмежуючись наступними рослинами: соя, зерно злаків, сорго, люцерна, рис, конюшина, капуста, банани, кава, селера, тютюн, вигна китайська (коров'ячий горох), бавовна, диня і перець. 90279 18 Вибір або A. Tumefaciens, або A. rhizogenes залежить від того, яка рослина буде ними трансформована. В основному, А. tumefaciens є переважним організмом для трансформації. Більшість дводольних рослин, деякі голонасінні рослини і декілька односім'ядольних рослин (наприклад, певні представники Liliales і Arales) чутливі до інфікуючої дії А. tumefaciens. A. rhizogenes також має широкий діапазон господарів (носіїв), включаючи більшість дводольних рослин і декілька голонасінних рослин, які включають представників Leguminosae, Compositae і Chenopodiaceae. Альтернативними технологіями, які визнані ефективними в здійсненні генетичної трансформації рослин, є: опромінювання частинками і електропорация. Див., наприклад, Rhodes et al., (1988), Science, 240: 204-207; Shigekawa i Dower, (1988), Bio/Techniques, 6: 742751; Sanford et al., (1987), Paniculate Science & Technology, 5:27-37; і McCabe, (1988), Bio/Technology, 6:923-926. Після трансформації дані клітини можуть бути використані для регенерації трансгенних рослин, здатних протистояти несприятливій дії (стресу) навколишнього середовища. Наприклад, всі рослини можуть бути інфіковані вказаними векторами шляхом нанесення пошкоджень даній рослині з подальшим введенням вектора в пошкоджене місце. Може бути пошкоджена будь-яка частина рослини: листя, стебла і коріння. Як альтернатива, тканина рослини у формі експлантата, наприклад, тканина сім'ядолі або листові диски, може бути щеплена цими векторами і культивована на режимах, які інтенсифікують регенерацію рослини. Коріння або паростки, трансформовані щепленням (інокуляцією) тканини рослини за допомогою A. rhizogenes або А. tumefaciens, що містять ген, який кодує заданий ген, можуть бути використані як джерела регенерації трансгенних рослин, або через соматичний ембріогенез, або через органогенез Приклади таких способів регенерації тканин рослини розкриті в Shahin, (1985), Theor. Appl. Genet. 69:235-240; патент США №4,658,082; Simpson et al., (1986), Plant Mol. Biol., 6: 403-415; і патентні заявки США, peг. №913,913 і 913,914, обидві подані 1 жовтня 1986, як вказано в патенті США №6,262,306, виданому 16 листопада 1993 на ім'я Robeson, et al.; вся згадана інформація включена в даний документ в повному об'ємі методом посилання. Не дивлячись на те, що діапазон господарів Agrobacterium-опосередкованої трансформації досить широкий, склалася думка, що деякі основні види зернових і голонасінні рослини, в основному, важко піддаються даному методу перенесення генів, навіть не дивлячись на те, що останнім часом були відзначені деякі досягнення, які відносяться до вирощування рису (Hiei et al., (1994), Plant Journal, 6:271-282). Були розроблені деякі способи трансформації рослин, що складають альтернативу способу Agrobacteriumопосередкованої трансформації, при цьому вони всі відносяться до технологій перенесення генів і включені в даний документ методом посилання. Широко вживаним способом трансформації рослин є спосіб трансформації за допомогою мік 19 роуприскування (microprojectiles), при якому ДНК наноситься на поверхні частинок розміром від 1 до 4мкм, використовуваних для мікроуприскування. Вектор експресії вводиться в тканину рослини за допомогою біолістичного механізму, який прискорює мікрочастинки, використовувані при мікроуприскуванні, надаючи їм швидкості від 300 до 600м/с, якої достатню для проникнення через стінки і мембрани клітин рослини. (Sanford et al., (1987), Part. Sci. Technol. 5:27; Sanford, 1988, Trends Biotech, 6:299; Sanford, (1990), Physiol. Plant 79:206; Klein et al., (1992), Biotechnology 10:268). Іншим способом фізичного введення ДНК в рослину є обробка клітин-мішеней ультразвуком по методу, описаному в роботі Zang et al., (1991), Bio/Technology, 9:996. Крім того, для введення векторів експресії в рослини були використані ліпосоми або злиття сферопластів. Див., наприклад, Deshayes et al., (1985), EMBO J. 4:2731; і Christou et al., (1987), PNAS USA, 84:3962. Опублікована інформація про безпосереднє поглинання ДНК протопластами при використовуванні осаджень СаСl2, полівінілового спирту або полі-L-орнітіну. Див., наприклад, Hain et al., (1985), Mol. Gen. Genet. 199:161; і Draper et al., (1982), Plant Cell Physiol. 23:451. Описано також метод електропорації протопластів, а також клітин і тканин в цілому. Див., наприклад, Donn et al., (1990), в рефератах 7-го міжнародного конгресу з дослідження клітини рослин и тканинної культури (Vllth Int'l. Congress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC), A2-38, page 53; D'Halluin et al., (1992), Plant Cell 4:1495-1505; і Spencer et al., (1994), Plant Mol. Biol. 24:51-61. Крім того, конструкції ДНК об'єднуються з відповідними боковими областями Т-ДНК (T-DNA) і вводяться в звичайний вектор господаря Agrobacterium tumefaciens. Вірулентна функція господаря Agrobacterium tumefaciens направляє інсерцію конструкції і примикаючий маркер в клітину ДНК рослини, коли бактерія інфікує клітину. Технологія мікроін'єкцій відома з рівня техніки і описана в науковій і патентній літературі. Введення конструкцій ДНК з використанням осаджень поліетиленгліколя описано в Paszkowski et al., 1984, EMBO J. 3: 2717. Технологія електропорації описана в Fromm et al., 1985, Proc. Nat'l. Acad. Set USA, 82: 5824. Технологія балістичної трансформації описана в Klein et al., 1987, Nature 327: 70-73. Технологія Agrobacterium tumefaciensопосерецковжої трансформації, що включає вилучення плеча вектора і використовування бінарних векторів, також достатньо широко описана в науковій літературі. Див., наприклад, Horsch et al., 1984, Science, 233: 496-498, і Fraley et al., 1983, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 80: 4803. Одним з переважних способів трансформації рослин по даному винаходу є спосіб опромінювання мікрочастинками. В даному способі тканинимішені осмозуються (піддаються обробці осмосом). Потім модифікований ОАТ ген ДНК осаджується і наноситься на вольфрамові або золоті мікрочастинки. Після цього мікрочастинки завантажуються в мікровипромінювальний або біолістичний пристрій, і оброблені клітини підда 90279 20 ються бомбардуванню мікрочастинками (Bower et al., 1996). Всі публікації, наведені у даному документі, мають своєю метою розкриття протоколів і реагентів, вказаних у перерахованих публікаціях, які можуть бути використані у зв'язку із даним винаходом. Завдяки попередньому винаходу, ніщо із згаданої інформації не може стати причиною для сумніву в праві на таке розкриття. Якщо інше не обумовлене, даний винахід оперує інформацією з рівня техніки, що відноситься до традиційної молекулярної біології, біології рослин і технологій рекомбінантних ДНК. Такі технології добре відомі кваліфікованим працівникам в даній області знань і знайшли повне пояснення в літературі. Див., наприклад, Maniatis, Fritsch & Sambrook, "Molecular Cloning: Laboratory Маnuаl" (Молекулярне клонування. Лабораторний довідник) (1982); "DNA Cloning: Practical Approach," Volumes I and II (Клонування ДНК. Практичні досягнення. Том 1, 2) (D.N. Glover, Ed., 1985); "Oligonucleotide Synthesis" (Синтез олігонуклеотидів) (M.J. Gait, Ed., 1984); "Nucleic Acid Hybridization" (Гібридизація нуклеїнової кислоти) (B.D. Hames & SJ. Higgins, eds., 1985); "Transcription and Translation" (Транскрипція і трансляція) (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds., 1984); B. Perbal, Practical Guide to Molecular Cloning" (Практичне керівництво по молекулярному клонуванню) (1984), і Sambrook, et al., "Molecular Cloning: Laboratory Manual" 12th edition (Лабораторне клонування: Лабораторний довідник. 12-е видання) (1989). Зрозуміло, що об'єм захисту даного винаходу не обмежується тільки описаними в даному документі матеріалами і методами, оскільки вони можуть зазнавати зміни. Слід також прийняти до уваги, що термінологія, застосована в даному документі, використовується тільки для опису конкретних прикладів здійснення винаходу і не ставить за свою мету обмеження об'єму захисту винаходу, який може бути обмежений тільки прикладеними пунктами формули винаходу. Слід зазначити, що використовувані в даному документі граматичні форми однини "a", "an", повинні припускати множину, якщо з контексту чітко не слідує інше. Наприклад, назва "полінуклеотид", яка використана з невизначеним артиклем "а", відноситься до множини таких полінуклеотидів, а назва "підсилюючий елемент", яка використана з невизначеним артиклем "an", відноситься до одного або декількох підсилюючих елементів. Не дивлячись на те, що будь-які матеріали або методи, подібні або еквівалентні матеріалам або методам, описаним в даному документі, можуть бути використані для здійснення або перевірки даного винаходу, проте, матеріали і методи, описані в даному документі, є переважними. Одним з найпошириніших аспектів даного винаходу є використовування трансгена, створеного методом генної інженерії, з метою отримання трансгенної пшениці, яка забезпечує експресію гена орнітін аміно трансферази (ОАТ). Орнітін аміно трансфераза (ОАТ) є ензимом шляху орнітіну, 21 який формує пролін в клітині рослини. ОАТ каталізує перенесення аміногрупи від орнітіну до альфакетоглутарату, утворюючи глутамік-5-семі-альдегід і глутамінову кислоту. Отже, в контексті даного винаходу термін "трансгенна рослина" відноситься до рослини, яка має у своєму складі послідовність ОАТ-нуклеотиду, включаючи, але, не обмежуючись нуклеотидами, які, можливо, присутні в ненормальному стані, ДНК-послідовностями, які ненормально транскрибовані в РНК або трансльовані в протеїні. Термін "рослина пшениці" в контексті даного винаходу включає, наприклад, будь-яку рослину, знайдену в сімействі пшениці, вибрану з групи, що складається з: Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum aestivum var. westonia, Triticum monococcum, Triticum aegilopoides, Triticum turgidum, Triticum polonicum, Triticum carthlicum, Triticum dicoccum, Triticum paleocolchicum, Triticum aestivum var. carnamah і Triticum turanicum. Термін "трансген" в контексті даного винаходу відноситься до будь-якої полінуклеотидної послідовності, що кодує ОАТ поліпептид, який вводиться в геном клітини рослини пшениці за допомогою експериментальних маніпуляцій. Трансген може бути представлений "ендогенною послідовністю ДНК" або "гетерологічною послідовністю ДНК" (тобто "чужорідною ДНК"). Термін "ендогенна послідовність ДНК" відноситься до нуклеотидної послідовності, яка природно виявляється в клітині, в яку вона вводиться, до тих пір, поки вона не зазнає будь-якої модифікації (наприклад, точкової мутації, наявності селектабельного гена-маркера і т.п.) щодо послідовності, яка виникла природно. Термін "гетерологічна послідовність ДНК" відноситься до нуклеотидної послідовності, яка лігувана, або маніпульована так, щоб стати лігуваною (пришитою) до послідовності нуклеїнової кислоти, до якої вона не лігувана в природі, або до якої вона лігувана в природі, але у відмінному від заданого місцеположенні. Гетерологічна ДНК не є ендогенною по відношенню до тої клітини, в яку вона вводиться, але при цьому була отримана з іншої клітини. Гетерологічна ДНК також включає ендогенну послідовність ДНК, яка зазнала деякої модифікації. В основному, хоча це і не є обов'язковим, гетерологічна ДНК кодує РНК і протеїни, які нормально не формуються клітиною, в якій забезпечується вказана експресія. Приклади гетерологічної ДНК включають мутовані гени дикого типу, (тобто гени дикого типу, які були модифіковані таким чином, що вони перестали бути генами дикого типу), гени-репортери, транскрипційні і регуляторні послідовності трансляцій, селектабельні маркерні протеїни (наприклад, протеїни, які забезпечують лікарську стійкість). Таким чином, як тільки відповідний господар рослина пшениці ідентифікується у відповідності до умов, описаних вище, створюється конструкція трансгена, яка включає один або декілька ОАТполінуклеотидів або їх функціонально активних фрагментів. Термін "функціонально активний", якщо він використовується у зв'язку з ОАТ полінуклеотидами по даному винаходу, відноситься до зразка (типу), в якому зміна в нуклеотидній послі 90279 22 довності не обов'язково несприятливо впливає на здатність послідовностей до кодування поліпептиду, здатного до виконання, фактично, тієї ж функції, що і незмінений поліпептид - "батько". Наприклад, нуклеотидна послідовність може бути урізаною, розтягнутою, або видозміненою таким чином, що поліпептид, кодований нуклеотидною послідовністю, відрізняється від послідовності "батька", але все ще продовжує кодувати поліпептид, який здатний функціонувати, по суті, таким же чином, що і молекула - "батько". Отже, функціонально активне похідне, аналог, гомолог або варіант ОАТ полінуклеотиду по даному винаходу буде мати нуклеотидну послідовність, яка відрізняється від нуклеотидної послідовності, показаної на Фіг.2 (SEQ ID, НЕМАЄ:1), але поліпептид, кодований функціонально активним похідним, аналогом, гомологом або варіантом, є здатним до вияву одного або більш видів відомої функціональної активності, асоційованої з ОАТ поліпептидами. Такі модифікації можуть бути навмисними, наприклад, в результаті сайт-спрямованого мутагенезу, або спонтанними. Перелік синонімів OAT (ЕС-номер 2.6.1.13) включає L-орнітін: 2-оксо-кислотну амінотрансферазу, орнітін-амінотрансферазу, орнітін-оксокислотну трансаміназу, амінотрасфераза-орнітінкето-кислоту, L-орнітін 5-амінотрансферазу, Lорнітін-амінотрансферазу, L-орнітін: альфакетоглутарат-дельта-амінотрансферазу, орнітін-5аміно-трансферазу, орнітін-дельта-трансаміназу, орнітін-трансаміназу, орнітін-2-оксокислотну амінотрансферазу, орнітін-альфа-кетоглутаратамінотрансферазу, орнітін-кетокислотну амінотрансферазу, орнітін-кетокислотну трансаміназу, орнітін-кетоглутарат амінотрансферазу, орнітіноксокислотну амінотрансферазу і орнітін: альфаокси-глутарат-трансаміназу. Кваліфікований в даній області техніки фахівець розуміє, що функціонально активне похідне, аналог, гомолог або варіант ОАТ полінуклеотиду по даному винаходу може реально варіювати за межами областей значущої важливості, наприклад, сайтів скріплення рецептора; проте, області високої консервативності послідовності між ОАТ полінуклеотидами, відокремленими від різних різновидів вірусу, ймовірно, кодують області значущої важливості, наприклад, сайти скріплення рецептора і інші їм подібні сайти. Отже, існує вірогідність, що мутації в цих у високому ступені консервативних (захищених) областях не будуть генерувати функціонально активні похідні, аналоги, гомологи або варіанти. Наприклад, консервативні нуклеотидні послідовності, показані в Таблиці, схильні залишатися незміненим, якщо тільки зміни не є надзвичайно консервативними. Послідовності, які є реально подібними, можуть бути ідентифіковані при проведенні так званого Південного експерименту гібридизації в умовах високої, середньої і зниженої суворості, встановлених для заданої специфічної системи. Методики визначення відповідних умов гібридизації відомі з рівня техніки. Див., наприклад, Sambrook et al., DNA Cloning, vols. I, II і III. Nucleic Acid Hybridization. (Клонування ДНК, тт. I, II і III. 23 Гібридизація нуклеїнової кислоти). Проте, звичайно, "строгі умови" гібридизації або ренатурації молекул нуклеїнових кислот передбачають наступне: (1) застосування низької іонної сили і високої температури для промивки, наприклад, 0,015М NaCl/0,0015M натрій-цитрату/0,1% натрійдодецил-сульфату (SDS) при 50°3, or (2) застосування в процесі гібридизації денатуруючого агента, такого, як формамід, наприклад, 50% (об'єм/об'єм) формаміду з 0,1% бичачим сироватковим альбуміном/0,1% Ficoll/0,1% полівінілпірролідон/50mМ натрій-фосфатного буферного розчину при показнику рН 6,5 з 750мМ NaCl, 75мМ натрій-цитрату при 42°З. Прикладом умов гібридизації середньої суворості є використовування 50% формаміду, 5X SSC (0,75M NaCl, 0,075М натрій-цитрату), 50мМ натрійфосфату (рН 6,8), 0,1% натрій-пірофосфату, 5X розчину Denhardt (Денхардта), обробленої ультразвуком ДНК сперми лосося, (50мкг/мл), 0,1% SDS, і 10% декстран-сульфату при 42°С, з промивками при 42°С в 0,2X SSC і 0,1% SDS. Відповідно до подальшого прикладу здійснення винаходу, який не є обмежуючим, умови зниженої суворості характеризуються показниками, описаними Shilo і Weinberg в 1981 {Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:6789-6792). Фільтри, що містять ДНК і призначені для обробки відповідно до вказаних умов, звичайно, піддаються попередній обробці протягом 6 годин при температурі 40°С в розчині, що містить 35% формаміду, 5X SSC, 50мМ TrisНСl (рН 7,5), 5мМ EDTA (етилендиамінтетраоцтова кислота), 0,1% PVP (полівінілпірролідону), 0,1% Ficoll, 1% ВSА (бичачого сироваткового альбуміну), і 500мкг/мл денатурованої ДНК сперми лосося. Процеси гібридизації проводяться в тому ж розчині з урахуванням наступних модифікацій: 0,02% PVP, 0,02% Ficoll, 0,2% BSA, 100мкг/мл ДНК сперма лосося, 10% (вага/об'єм) декстрансульфату і при цьому використовують 32Р6 маркірований зонд з 5-20X10 срm (числом імпульсів в хвилину). Фільтри інкубуються в гібридизаційній суміші на 18-20 годин при 40°С, а потім промиваються протягом 1, 5 години при 55°С в розчині, що містить 2X SSC, 25мМ Tris-HCl (pH 7,4), 5мМ EDTA, і 0,1% SDS. Промивальний розчин замінюють свіжим розчином і інкубацію продовжують ще 1,5 години при 60°С. Фільтри піддають блотінгу до сухого стану і радіографії. Якщо необхідно, фільтри промиваються утретє при 65-68°С і повторно покривають плівкою. Можуть бути також використані інші умови зниженої суворості, характерні для даного виду обробки, які добре відомі з рівня техніки (наприклад, умови проведення гібридизації схрещених видів). ОАТ Полінуклеотіди, функціонально активні похідні, аналоги або варіанти по даному винаходу можуть бути отримані різними способами, відомими з рівня техніки. Наприклад, клоновані ОАТ полінуклеотиди можуть бути модифіковані будь-яким з численних концептуально значущих способів, відомих з рівня техніки (Див., наприклад, Maniatis, Т., 1990, Molecular Cloning, Laboratory Manual, 2nd ed.(Молекулярне клонування. Лабораторний довідник, 2-е видання), Cold Spring Harbor Laboratory, 90279 24 Cold Spring Harbor, N.Y.). Послідовності можуть бути розщеплені на відповідних сайтах за допомогою ендонуклеаз(и) рестрикції з подальшою, якщо необхідно, додатковою ензиматичною модифікацією, виділені і лігувані in vitro. Крім того, ОАТ - кодуючі полінуклеотидні послідовності можуть бути мутовані in vitro або in vivo, з метою створення або руйнування функціональних областей або створення варіацій у функціональних областях і/або формування нових сайтів ендонуклеази рестрикції, або руйнування раніше існуючих, з метою забезпечення спрощення подальшої модифікації in vitro. Може бути використана будь-яка технологія з рівня техніки, що забезпечує мутагенез, включаючи, але не обмежуючись, хімічним мутагенезом, in vitro сайт-спрямованим мутагенезом (Hutchinson et al., 1978, J. Biol. Chem 253:6551). Крім того, полінуклеотидні варіанти ОАТ полінуклеотидів можуть бути отримані шляхом дегенерації кодонових замін або додаткових послідовностей. Зокрема, дегенерація кодонових замін може бути досягнута шляхом генерації послідовностей, в яких третя позиція (місцерозташування) одного або декількох відібраних (або всіх) кодонів замінена залишками змішаної основи і/або залишками дезоксиінозину (Batzer et al., 1991, Nucleic Acid Res. 19: 5081; Ohtsuka et al., 1985, J. Biol. Chem. 260: 2605-2608; і Rossolini et al., 1994, Mol. Cell. Probes, 8: 91-98). Як альтернатива, варіантом може виявитися полінуклеотид, який, фактично, ідентичний SEQ ID NO:1 (Фіг.2), або в якому один або декілька нуклеотидів були додані, видалені або замінені в положенні 3' та/або 5' кінця (кінців) полінуклеотиду або в межах полінуклеотиду. В одному з прикладів здійснення винаходу ОАТ полінуклеотидами являються дволанцюгові молекули ДНК, що мають, принаймні, 85% ідентичність нуклеотидної послідовності з SEQ ID, №1. Як тільки відповідний трансген ідентифікується і або ізолюється (виділяється) або конструюється, він інкорпорується (вводиться) у вектор експресії за допомогою стандартних технологій. Відповідно, даний винахід також відноситься до вектора експресії, що включає трансген по даному винаходу. Тому, в одному з прикладів здійснення конструюється вектор експресії, що містить ізольовану і очищену молекулу ДНК, яка включає промотор, функціонально зв'язаний з кодуючою областю для ОАТ, причому дана кодуюча область функціонально зв'язана з областю закінчення транскрипції, завдяки чому промотор переміщує транскрипцію кодуючої області (зони). Кодуюча область може включати сегмент або послідовність, що кодує ОАТ ген. Молекула ДНК, що містить вектор експресії, може також включати інтрон рослини, крім того, вона може також містити інші елементи рослини, наприклад послідовності, що кодують нетрансльовані послідовності (UTL's) і послідовності, які діють як підсилювачі транскрипції або трансляції. Не обмежуючи об'єму захисту, переважними векторами трансформації рослини є вектори, похідні від Ті-плазмідьі Agrobacterium tumefaciens, а також, вектори, які були розкриті, наприклад, в Herrera-Estrella (1983), Bevan (1983), Klee (1985) і 25 європейській патентній заявці №ЕР 0120516 (кожна публікація введена в цей документ методом посилання). Оскільки вектори експресії за даним винаходом використовуються, переважно, для трансформації рослини пшениці, відбирається такій промотор, який здатний ввігнати експресію в заданий специфічний вид рослини. Промотори, які функціонують в різних видах рослин, добре відомі з рівня техніки. Промоторами, які доцільно використовувати для надання експресії поліпептиду в рослинах, є промотери, що характеризуються індуцибельністю; вони є вірусними, синтетичними або сконструйованими, як описано в роботі (Odell et al., 1985 supra), та/або регульованими у часі, регульованими у просторі і регульованими у просторі і у часі. Перевага віддається підсиленим промоторам CaMV35S і промотору FMV35S. Експресія гена, який існує в дволанцюговій формі ДНК, локалізованій в ядерному геномі рослини, залучає транскрипцію месенджера РНК (мРНК) з кодуючого ланцюжка ДНК за допомогою ензиму полімерази РНК, і подальшої обробки первинного транскрипту мРНК усередині нуклеази. Область ДНК, що отримала назву "промотор", регулює транскрипцію ДНК в мРНК. ДНК, що включає промотор, представлена послідовністю основ, яка направляє сигнали полімеразі РНК, примушуючи її зв'язуватися з ДНК і ініціювати транскрипцію мРНК, використовуючи один з ланцюжків ДНК як матрицю (темплат) для конструювання відповідного ланцюжка РНК. Відібраний специфічний промотор повинен бути здатний забезпечити достатню транскрипцію ОАТ кодуючої послідовності для створення захисту від стресу (несприятливого впливу навколишнього середовища) в отриманій рослині. ОАТ полінуклеотиди за даним винаходом можуть приводитися в рух різними промоторами в тканині рослин. Промотори можуть бути близькими до всеосяжних (тобто, вони вганяють транскрипцію трансгена по всій тканині); прикладом такого промотора може служити такий промотор, як CaMV35S, промотор 1'- або 2', похідний від Т-ДНК Agrobacterium tumefaciens; промотори можуть бути також тканиноспецифічними, або мати специфічну конструкцію. Підсилені або здвоєні варіанти промоторів CaMV35S і FMV35S особливо доцільні до використовування для здійснення даного винаходу. (Kay et al., 1987; Rogers, U.S. Pat. No. 5,378,619). Слід зазначити додатково, що промотор може бути чутливим до контролюючої дії навколишнього середовища. Такі промотори отримали назву "індуцибельних" (стимульованих). Прикладами умов навколишнього середовища, які можуть впливати на транскрипцію за допомогою индуцибельних промоторов, є патогенна атака, анаеробні умови (інфекції) або присутність світла. Переважно, використовують промотори, які здатні направляти сильну експресію. Перелік таких промоторів включає, наприклад, промотор маїсу (маїсовий убіквітарний промотор), що повсюдно зустрічається, описаний Christensen і Quail (1996), рисовий актиновий промотор, описаний McElroy D, 90279 26 Blowers AD Jenes В і Wu R (1990), commelina промотор мозаїчного вірусу, описаний Medberry SL, Lockhart BEL і Olszewskine (1992). Кваліфіковані і добре інформовані фахівці в даній області знань можуть підтвердити існування великого числа описаних в літературі промоторів, які проявляють активність в клітках рослин. Такі промотори можуть бути отримані з рослин або з вірусів рослин, а їх перелік включає, наприклад, такі промотори, як нопалін-синтаза (NOS) і окторин-синтаза (які переносяться на пухлинаиндукуючих плазмідах. tumefaciens), промотори мозаїчного вірусу цвітної капусти (CaMV) 19S і 35S, світло-индуцибельній промотор з малої субодиниці рибулоза 1,5-бісфосфат карбоксилази (ssRUBISCO, поліпептид дуже урожайної рослини), рисовий промотор Act1 і промотор 35S мозаїчного вірусу Figwort (FMV). Всі ці промотори були використані для утворення різних типів конструкцій ДНК, експресія яких була забезпечена в рослинах (див., наприклад, McElroy et al., 1990, патент США №5,463,175). Крім того, перевага може бути віддана забезпеченню експресії ОАТ полінуклеотиду за допомогою використовування рослина-інтегруючих векторів, що містять тканиноспецифічний промотор. Перелік специфічних тканин-мішеней може включати такі об'єкти, як лист, стовбур, корінь, бульбу, зерно, плід і т.п., при цьому вибраний промотор повинен володіти заданою специфікою тканини і специфічністю розвитку. Таким чином, функція промотору повинна бути оптимізована шляхом відбору промотору із заданими здібностями щодо експресії тканини і приблизно точною промоторною ефективністю, а також шляхом вибору трансформанта, який створює заданий рівень опору стресу (несприятливій дії) в тканині-мішені. Такий підхід до відбору із пулу трансформантів, звичайно, використовується в експресії гетерологічних структурних генів в рослинах, оскільки є варіація між трансформантами, що містять один і той же гетерологічний ген, яка виникає через сайт (місцерозташування) інсерції гена в межах геному рослини (як правило, таке явище зустрічається під назвою "ефект положення"). Окрім промоторів, відомих своєю здатністю викликати транскрипцію ДНК (конструктивну або тканиноспецифічну) в клітинах рослини, інші промотори можуть бути ідентифіковані для використовування в даному винаході шляхом скринінгу бібліотеки кДНК рослин для генів, експресія яких селективно або переважно забезпечується в тканинах-мішенях, з подальшим визначенням області промоторов. Ще одними прикладами тканиноспецифічних промоторів є: зернова сахароза-синтетаза 1 (Yang et al., 1990), зернова спиртова дегідрогеназа 1 (Vogel et al., 1989), зерновий light harvesting комплекс (Simpson, 1986), протеїн зерна, що піддавалося високотемпературній (шоковій) тепловій обробці (Odell et al., 1985 supra), RuBP карбоксилази малої субодиниці гороху (Poulsen et al., 1986; Cushmore et al., 1983), Ті-плазміда-маннопінсинтаза (McBride and Summerfelt, 1989), Тіплазміда-нопалін-синтаза (Langridge et al., 1989), петунія-калкон-ізомерази (Van Tunen et al., 1988), 27 протеїн боба 1, з великим вмістом гліцину (Keller et al., 1989), CaMV 35s транскрипт (Odell et al., 1985 supra) і картопляний пататін (patatin) (Wenzler et al., 1989). Переважними промоторами є промотор мозаїчного вірусу цвітної капусти (CaMV 35S) і промотор карбоксилази RuBP малої субодиниці SE9. Промотори, використані в конструкціях ДНК за даним винаходом, якщо потрібно, можуть бути модифіковані, з метою впливу на їх контрольні характеристики. Наприклад, промотор CaMV35S може бути лігуваний (зшитий) з частиною гена ssRUBISCO, яка пригнічує експресію ssRUBISCO за відсутності світла, з метою створення промотора, який проявляє активність в листі, але не в корінні. В контексті даного опису позначення промотор "CaMV35S" включає варіації промотора CaMV35S, наприклад, промотори, отримані шляхом лігування з областями гена-оператора, безконтрольно або шляхом керованого мутагенезу і т.п. Крім того, промотори можуть бути переконструйовані, з метою забезпечення множинних "підсилюючих послідовностей", що сприяє інтенсифікації експресії генів. В роботі Kay et al. (1987) наведені приклади таких підсилюючих послідовностей. Трансгенна рослина за даним винаходом, отримана від клітини рослини, трансформованої тканиноспецифічним промотором, може бути схрещена з іншою трансгенною рослиною, похідною від клітини рослини, трансформованої відмінним від першого тканиноспецифічним промотором, з метою отримання гібридної трансгенної рослини, яка проявляє ознаки трансформації більш ніж в одному прикладі специфічних тканин. РНК, отримана за допомогою конструкції ДНК за даним винаходом, може також містити 5'кінцеву не трансльовану лідерну послідовність (5'UTL). Ця послідовність може бути отримана від промотору, вибраного для забезпечення експресії гена, при цьому вона може бути специфічно модифікована, наприклад, для того, щоб збільшити трансляцію мРНК. 5'-кінцеві не трансльовані області можуть бути також отримані з вірусної РНК, з відповідних еукариотичних генів або з синтетичної генної послідовності. Об'єм захисту даного винаходу не обмежений конструкціями, в яких не трансльована область є похідною від 5' не трансльованої послідовності, що завершує послідовність промотору. Однією з лідерних послідовностей гена рослини, використовуваній в даному винаході, є лідерний протеїн 70 (hsp70) петунії після високотемпературної обробки. (Winter et al, 1988). 5' UTL здатні регулювати експресію гена, будучи локалізованими в послідовності ДНК між сайтом ініціації транскрипції і початком кодування послідовності. Компіляція лідерної послідовності була виконана для прогнозування оптимальних або суб-оптимальних послідовностей і генерації "консенсусу" і переважних лідерних послідовностей (Joshi, 1987). Переважні лідерні послідовності припускають включення таких послідовностей, які призначені для направлення оптимальної експресії приєднаних структурних генів, тобто включають переважну лідерну послідовність консенсусу, яка може підсилити або підтримати стабільність мРНК 90279 28 і запобігти небажаній ініціації трансляції. Принцип відбору таких послідовностей описаний в даному винаході. Послідовності, які створені генами, відмінними високою експресивністю в рослинах, в маїсі зокрема, є найбільш переважними. Одним з надзвичайно корисних лідерів може служити лідер, відомий під назвою петунія HSP70. З метою оптимізації експресії, в генноінженерну конструкцію експресії ДНК може бути включено інтрон. Звичайно, такий інтрон поміщається близько 5' закінчення мРНК в не трансльованій послідовності. Вказаний інтрон може бути отриманий і не тільки з серії інтронів, що складається з інтрону (HSP) 70 маїсового протеїну, підданого високотемпературній (тепловий шоковій) обробці, (пат США №5,424,412; 1995), рисового Act1 інтрону (McElroy et al., 1990), Adh інтрону 1 (Callis et al., 1987), або інтрону сахарози синтази (Vasil et al., 1989). 3' не трансльована область генів по даному винаходу, які локалізовані в зоні, що примикає до ядерного геному рослини, містить також сигнал поліаденілації, який функціонує в рослинах, з метою забезпечення додавання аденилатнуклеотидів до 3'-кінця мРНК. РНК - полімераза транскрибує ядерний геном, що кодує послідовність ДНК через сайт, де виникає поліаденілація. Як правило, послідовності ДНК, що вміщають декілька тисяч основних пар в прямому напрямку прочитування генетичного коду сайту поліаденілації, служать для завершення транскрипції. В контексті даного опису такі послідовності ДНК слід розглядати як області транскрипції-термінації. Такі області потрібні для ефективної поліаденілації транскрибованого месенджера РНК (мРНК). Прикладами переважних 3'-областей є (1) 3'-транскрибовані не трансльовані області, що містять сигнал поліаденілації Agrobacterium пухлина-индукуючих (Ті) генів плазміди, наприклад, гена наполін-синтази (NOS) і (2) 3' закінчень генів рослин, наприклад, горохового гена малої субодиниці рибулоза-1,5-бісфосфат карбоксилази, позначеного в даному документі як Е9 (Fischhoff et al., 1987). Такі конструкції також повинні включати ОАТ - полінуклеотиди разом з 3'закінченням послідовності ДНК, що функціонує як сигнал для термінації транскрипції, а в конструкціях, призначених для експресії ядерного генома, забезпечувати поліаденілацію результуючої мРНК. Найбільш переважними 3'-елементами є елементи з наполін-синтаза-гена A. tumefaciens (nos 3'end) (Bevan et al., 1983), терминатора для Т7транскрипту з октопін-синтаза-гена А. tumefaciens, і 3'-закінчення інгібітору протеази -І або II генів з картоплі або томатів. Якщо необхідно, можуть бути додатково включені регуляторні елементи, наприклад, елемент TMV OMEGA (Gallie et al., 1989). Підсилювачі транскрипції або дуплікації підсилювачів можуть бути використані для посилення експресії. Такі підсилювачі часто можуть бути знайдені у напрямі 5' до початку транскрипції в промоторі, функціонуючому в зукаріотичних клітинах. Проте, окрім цього, вони також часто можуть бути вставлені в області прямої (передньої) або зворотної (задньої) орієнтації 5' або 3' до кодуючої послідовності. Прикладами підсилювачів є елеме 29 нти з промотору CaMV 35S, генів октопін-синтази (Ellis et al., 1987), рисового актинового гена, і промотору з зукаріотів нерослинного походження (наприклад, з дріжджів; Ma et al., 1988). В певних прикладах здійснення винаходу наявність елементів внутрішніх сайтів скріплення рибосоми (IRES) використовується для утворення мультигенних або поліцистронних одиниць генетичного коду (месиджей). IRES-елементи здатні обійти рибосома-скануючу модель 5' метилованої Кeп-залежної трансляції и почати трансляцію на внутрішніх сайтах. (Pelletier and Sonenberg, 1985). IRES -елементи з двох членів пікорна-вірусного сімейства (поліо і знцефаломіокардити) були описані в роботі (Pelletier and Sonenberg, 1988), як і IRES-елемент з одиниць генетичного коду (месиджів), що відносяться до ссавців (Macejak and Sarnow, 1991). IRES -елементи можуть бути зв'язані з гетерологічними відкритими рамками зчитування. Множинні відкриті рамки зчитування можуть бути транскрибовані разом; кожна відокремлена елементом IRES, що формує поліцистронні месиджі (одиниці генетичного коду). Через IRESелемент кожна відкрита рамка зчитування є доступною для рибосоми для ефективної трансляції. Множинні гени можуть бути ефективно зкспресовані, використовуючи один промотор/підсилювач для транскрибування одного месиджа. Будь-яка відкрита гетерологічна рамка зчитування може бути приєднана до IRES - елементів. Вона включає гени секретованих протеїнів, протеїнів безлічі субодиниць, кодованих незалежними генами, внутріклітинні або зв'язані через мембрану протеїни і селектабельні маркери. Таким чином, експресія декількох протеїнів може бути одночасно сконструйована методом генної інженерії в клітині однією конструкцією і одним селектабельним маркером. Вибір експресії вектора, з яким ОАТ - полінуклеотид промотора повинен бути обов'язково функціонально зв'язаний, безпосередньо, залежить від клітини-господаря, яка повинна бути трансформована. Це добре всім відомі обмеження з існуючого рівня техніки, властиві технологіям конструювання молекул рекомбінантних ДНК. Проте, вектор, використовуваний при здійсненні даного винаходу, здатний направляти експресію ОАТ кодуючої області, з якою він функціонально зв'язаний. Вектор, що містить ОАТ-послідовність, як правило, буде вмішувати і маркерний ген, який надає клітині рослини селектабельного фенотипу (мітить клітку). Наприклад, маркер може кодувати біоцидну стійкість, зокрема, стійкість до антибіотиків, наприклад, стійкість до канаміцину, G418, блеоміцину, гігроміцину, або стійкість до гербіцидів, наприклад, стійкість до фосфинотрицину (активному інгредієнту біалафоса і Баста (Basta). Типові вектори, що використовуються для експресії генів у вищих рослинах, добре відомі з рівня техніки і включають вектори, що є похідними від пухлина-индукуючої (Ті) плазміди A. tumefaciens, описаної в роботі (Rogers et al., 1987). Проте, відомі деякі інші рослина-інтегруючі векторні системи, які функціонують в рослинах, включаючи век 90279 30 тор, контролюючий перенесення pCaMVCN, описаний в роботі (Fromm et al., 1985). pCaMVCN (є в Pharmacia, Piscataway, NJ.) включає промотор CaMV35S. В одному з прикладів здійснення винаходу вектор, використаний для забезпечення експресії ОАТ - полінуклеотиду, включає селективний маркер, який ефективний в клітині рослини. В іншому прикладі здійснення винаходу гени, що кодують ОАТ-полінуклеотіди та/або селективні маркери, знаходяться на двох або більш векторах. Селективні маркери повинні бути стійкі до дії лікарських речовин або це повинні бути метаболічні селективні маркери. Одним з переважних маркерів, стійких до дії лікарських речовин, є ген, експресія якого забезпечує стійкість до канаміцину; тобто химерний ген, що містить промотор нопалінсинтазу, Тn5 неоміцин-фосфотрансферазу II (nptll) і 3' не трансльовану область нопалін-синтазьі (Rogers et al., 1988). Засоби для приготування векторів експресії добре відомі з рівня техніки. Вектори експресії (трансформації), що використані для трансформації рослин, і способи приготування таких векторів описані в патентах США №№ 4,971,908, 4,940,835, 4,769,061 і 4,757,011 (кожний з яких специфічно інкорпорований в даний документ методом посилання). Вказані вектори можуть бути модифіковані, щоб включити кодуючу послідовності відповідно до даного винаходу. Був розроблений цілий ряд способів забезпечення функціонального зв'язку ДНК з векторами за допомогою додаткових кінцевих зчеплень або дефосфольованих ("затуплених") кінців. Наприклад, додаткові гомополімерні тракти можуть бути додані до сегментів ДНК, призначених для інсерції, і до вектора ДНК. Після цього вектор і сегмент ДНК з'єднуються водневим зв'язком між додатковими гомополімерними хвостами, формуючи молекули рекомбінантних ДНК. В одному з прикладів здійснення даного винаходу дволанцюгова ДНК, кодуюча ОАТ, що показана на Фіг.2 (SEQ ID No. 1), лігувана до убіквіторного промотору і зеин-терминатору для формування вектора експресії "pGBA2", який показаний на Фіг.1. Предметом винаходу є також рослина пшениці, трансформована (перетворена) вектором експресії за даним винаходом. Трансгенна рослина, отримана від такої трансформованої або трансгенної клітини, також входить в об'єм захисту даного винаходу. Кваліфікований в даній області знань фахівець розуміє, що химерний ген рослини, який містить структурну кодуючу послідовність по даному винаходу, може бути вставлений в геном рослини методами, добре відомими з рівня техніки. Такі методи трансформації клітин ДНК включають Agrobacterium-опосередковану трансформацію рослини, використовування ліпосом, трансформацію шляхом використовування вірусів або пилку рослин, злектропорацію, трансформацію протопласту, перенесення гена в пилок, ін'єкцію до репродуктивних органів, ін'єкцію в незрілі ембріони і бомбардування частинками (опромінювання потоком частинок). Кожний з цих методів 31 має певні переваги і недоліки. Тому один окремий спосіб введення генів в окремий штам рослини не обов'язково може виявитися найефективнішим для іншого штаму рослини, причому, інформація про те які способи доцільно використовувати для яких штамів рослин, добре відома з рівня техніки. Існує багато способів введення трансформуючих сегментів ДНК в клітини, проте, не всіх їх доцільно використовувати для перенесення ДНК в клітини рослин. Перелік відповідних для цієї мети способів включає, фактично, будь-які способи, за допомогою яких ДНК може бути введена в клітину, наприклад, інфікування з використанням A. tumefaciens і відповідних штамів Agrobacterium, безпосереднє введення ДНК, наприклад, за допомогою PEG-опосередкованої трансформації протопластів (Omirulleh et al., 1993), шляхом поглинання ДНК за допомогою вьісушування/ингібування, шляхом злектропораціх, при перемішуванні з використанням силіконкарбідних волокон, шляхом прискорення руху ДНКпокритих частинок і т.п. В деяких прикладах здійснення методи прискорення знаходять перевагу і включають, наприклад, операції опромінювання (бомбардування) мікрочастинками і інші подібні операції. Технологія введення ДНК в клітину добре відома з рівня техніки фахівцям, кваліфікованим в даній області знань. Описано чотири основні способи доставки гена в клітини: (1) хімічні способи (Graham і van der Eb, 1973); (2) фізичні способи, наприклад опромінювання мікрочастинками (Capecchi, 1980), електропорація (Wong і Neumann, 1982; Fromm et al., 1985) і генна пушка (розпилювач генів) (Johnston and Tang, 1994; Fynan et al., 1993); (3) вірусні вектори (Clapp, 1993; Lu et al., 1993; Eglitis і Anderson, 1988a; 1988b); і (4) рецептор-опосередковані механізми (Curiel et al., 1991; 1992; Wagner et al., 1992). Дія короткими електроімпульсами високої напруги на цілий ряд клітин тварин і рослин приводить до формування в плазмовій мембрані пір, розміри яких вимірюються наноодиницями. ДНК вводиться безпосередньо в цитоплазму клітини або через ці пори, або через послідовний перерозподіл компонентів мембран, що супроводиться закриттям пір. Електропорація може стати надзвичайно ефективною і може бути використана як для перехідної експресії клонованого гена, так і для формування клітинних ліній, які несуть інтегровані копії заданого гена. Електропорація, на відміну від кальцій-фосфат - опосередкованої трансфекції і злиття протопластів, часто приводить до інтенсивного утворення клітинних ліній, які несуть одну або, максимум, декілька інтегрованих копій чужорідних ДНК. Введення ДНК за допомогою електропорації добре відоме фахівцям в цій області. Для виконання трансформації методом електропорації можна використовувати або рихлі тканини, наприклад, клітини суспендованих культур, або ембріогенну омозолілість, або, що не є обов'язковим, існує можливість безпосередньої трансформації незрілих ембріонів або тканин інших організмів. Існує можливість часткового руйнування 90279 32 клітинних стінок вибраної клітини шляхом дії на них пектин-руйнівними ензимами (пектоліазами) або методом контрольованого механічного пошкодження, що робить клітини більш сприйнятливими до трансформації. Такі клітини стають потім реципієнтами відносно перенесення ДНК методом електропорації, при цьому вони можуть бути виведені на даному етапі, а трансформовані клітини після цього можуть бути ідентифіковані шляхом відповідних технологій відбору або скринінгу, залежно від природи нової інкорпорованої ДНК. Іншим ефективним способом доставки трансформуючих сегментів ДНК в клітини рослини є опромінювання мікрочастинками (бомбардування мікрочастинками). Відповідно до даного способу частинки можуть бути покриті нуклеїновими кислотами і направлені в клітини рушійною силою. Такими частинками можуть бути частинки з вольфраму, золота, платини і інших подібних металів чи сплавів або інших речовин. При використовуванні таких частинок ДНК переноситься на поверхні малих металевих частинок крізь стінку клітини і далі в цитоплазму, як описано в роботі (Klein et al., 1987; Klein et al., 1988; Kawata et al., 1988). Металеві частинки проникають через декілька шарів клітин, забезпечуючи таким чином трансформацію клітин у межах тканинних експлантатів. Перевага способу бомбардування (опромінювання) мікрочастинками, крім того, що він є ефективним засобом репродуктивно стабільної трансформації клітин, полягає в тому, що при такому способі не вимагається ні відділення протопластів (Cristou et al., 1988), ні забезпечення сприйнятливості до інфекції Agrobacterium. Прикладом здійснення винаходу, що ілюструє спосіб доставки ДНК в клітини рослини шляхом надання їм прискорення, є біолістична система доставки частинок (Biolistics Particle Delivery System), яка може бути використана для надання руху частинкам, покритим ДНК або клітинам через екран (сито), наприклад сито з неіржавіючої сталі або сито Nytex, на поверхню фільтра, покриту суспендованою клітинною культурою рослини. Сито (екран) диспергує частинки таким чином, що вони не доставляються в клітини реципієнта у вигляді великих скупчень. Ясно, що сито (екран), встановлене між пристроєм, що направляє потік частинок, і опромінюваними клітинами, зменшує розмір скупчень частинок, що направляються, і може забезпечити більш високу швидкість (частоту) трансформації шляхом зменшення пошкоджень, що виникають на клітинах реципієнта через потік дуже великих скупчень частинок, що направляються. Для здійснення даного способу суспендовані клітини, переважно, концентруються на фільтрах або твердому культурному середовищі. Крім того, незрілі ембріони або інші клітини-мішені можуть бути розташовані на твердому культурному середовищі. Клітини, що опромінюються, розміщуються на відповідній відстані нижче стопорної пластини для мікрочастинок. При необхідності, одне або декілька сит (екранів) розміщуються між пристроєм-прискорювачем і опромінюваними клітками. Завдяки використаній технології, можна отримати до 1000 фокусів клітин, що забезпечують швидко 33 плинну експресію маркерного гена. Число клітин у фокусі, які забезпечують експресію екзогенного генного продукту через 48 годин після опромінювання, часто складає від 1 до 10 при середній величині від 1 до 3. При трансформації методом опромінювання мікрочастинками слід оптимізувати умови підготовки культури до опромінювання і параметрів процесу опромінювання для отримання максимальної кількості стабільних трансформантів. В даній технології важливе дотримання як фізичних, так і біологічних параметрів. Фізичними чинниками є чинники, які характеризують взаємовідношення "маніпулювання ДНК/преципітат мікрочастинок", або такі, які впливають на політ і швидкість макроабо мікрочастинок. Біологічні чинники включають всі операції, залучені в маніпуляційний процес з клітинами до і відразу ж після опромінювання мікрочастинками, осмотичне коректування клітинмішеней для пом'якшення травмування у зв'язку з бомбардуванням об'єкту мікрочастинками, а також природу трансформуючої ДНК або початкових надспіральних плазмід. Слід мати на увазі, що попередні до опромінювання маніпуляції надзвичайно важливі для успішної трансформації незрілих ембріонів рослин. Відповідно до сказаного вище, існує необхідність в досвідченій настройці деяких параметрів процесу бомдардування (опромінювання) для повної оптимізації технологічних режимів. Перш за все, може виникнути необхідність в оптимізації таких фізичних параметрів як, наприклад, відстань дволанцюгового розриву в ДНК ("проломи"), дистанція польоту, дистанція тканини і тиск гелію. Існує також можливість в зведенні до мінімуму чинників травмування (TRFs) шляхом удосконалення режимів, які впливають на фізіологічний стан клітин реципієнта і які тому можуть вплинути на ефективність трансформації і інтеграції. Наприклад, стан осмосу, зволоженість тканини і стадія субкультури або клітинний цикл клітин реципієнтів можуть бути відкориговані так, щоб забезпечити оптимальну трансформацію. Виконання решти традиційних настройок добре відоме з рівня техніки в контексті даного опису. Способи частина-опосередкованої трансформації відомі інформованим фахівцям з рівня техніки. Патент США №5,015,580 (спеціально включений в даний опис методом посилання) розкриває трансформацію соєвих бобів з використанням вказаної технології. Agrobacterium-onocepдковане перенесення являє собою добре відому і поширену систему введення генів в клітини рослин, при якій ДНК може бути введена в тканини всієї рослини, уникаючи при цьому необхідності в регенерації повноцінної рослини з протопласту. Використовування Agrobacterium-опосередкованих рослинних інтегруючих векторів для введення ДНК в клітини рослини добре відоме з рівня техніки. Див., наприклад, способи, описані в роботі (Fraley et al., 1985; Rogers et aL, 1987). Способи генної інженерії рослин бавовни, в яких використовується Agrobacterium-опосередковане перенесення, описані в патенті США №5,004,863 (спеціально вклю 90279 34 ченому в даний опис методом посилання); рівно як і спосіб трансформації рослин салату латуку, описаний в патенті США №5,349,124 (спеціально включеному в даний опис методом посилання); крім того, Agrobacterium-опосередковане перенесення соєвого боба описане в патенті США №5,416,011 (спеціально включеному в даний опис методом посилання). Крім того, інтеграція Ті-ДНК є відносно точним способом, результатом використовування якого є отримання декількох нових реаранжировок. Область ДНК, що підлягає перенесенню, визначається граничними послідовностями, а несуча ДНК (ДНК-інтервент), звичайно, вставляється в геном рослини відповідно до опису, викладеного в роботі (Spielmann et al., 1988; Jorgensen et al., 1987). Сучасні вектори трансформації Agrobacterium здатні до вияву реплікації в Е. coli, при цьому при використанні Agrobacterium передбачають традиційні маніпуляції, як описано в роботі (Klee et al., 1985). Крім того, недавні технологічні досягнення в області використовування векторів для Agrobacterium-опосередкованого перенесення гена поліпшили стан ранжирування генів і сайтів рестрикції у векторах для удосконалення (спрощення) конструкції векторів, здатних до забезпечення експресії різних поліпептид-кодуючих генів. Вектори, описані в роботі (Rogers et al., 1987), мають традиційні багатолінкерні області (з безліччю лінкерів-зв'язуючих ланок), що граничать з промотором і сайтом поліаденілації для безпосереднього забезпечення експресії вставлених поліпептидкодуючих генів, і придатні для вирішення задач, поставлених в даному винаході. Крім того, може бути використаний Agrobacterium, що містить Тігени як з плечима ("ніжками"), так і без них. В тій різноманітності рослин, де Agrobacteriumопосередкована трансформація ефективна, вона є способом, на якому зупинився вибір, завдяки простоті і ясності процесу перенесення гена. Agrobacterium-опосередкована трансформація листових дисків і Інших тканин, наприклад, сім'ядолі і підсім'ядольних колін, обмежена рослинами, які Agrobacterium інфікує природним шляхом Agrobacterium-опосередкована трансформація найбільш ефективна для двосім'ядольних рослин. Деякі односім'ядольні рослини виявляються природними господарями для Agrobacterium, хоча, використовуючи вектори Agrobacterium, трансгенні рослини були отримані і серед спаржевих, як описано в (Bytebier et al., 1987). За останній час за допомогою Agrobacterium були трансформовані і інші односім'ядольні рослини. До них відноситься група зернових рослин (Ishida et al. 1996) і рис (Cheng et al. 1998). Трансгенна рослина, сформована за допомогою способів Agrobacterium-трансформації, звичайно, містять одиночний ген на одній хромосомі. Такі трансгенні рослини можна віднести до гетерозиготних для додаткового гена. Проте, оскільки термін "гетерозигота", звичайно, припускає присутність додаткового гена в одному і тому ж локусі другої хромосоми в одній парі хромосом, а даний ген відсутній в рослині, що містить один додатковий ген, як в описуваному випадку, то, очевидно, 35 більш точною назвою для такої рослини є термін "незалежний сегрегат", оскільки даний додатковий екзогенний ген незалежно сегрегує (розщеплює) об'єкт протягом митозу (непрямого розподілу клітини) і мейозу (редукційного розподілу). Незалежний сегрегат є переважним, якщо рослина комерціалізується як гібрид, наприклад, як зернова рослина. В цьому випадку незалежний сегрегат, що містить ген, схрещується з іншою рослиною, з метою утворення гібридної рослини, яка є гетерозиготною по відношенню до гена, про який йдеться (заданого гена). В деяких випадках перевага віддається трансгенній рослині, яка є гомозиготною по відношенню до додаткового ОАТ полінуклеотиду; тобто, трансгенна рослина, яка містить два додаткових гени, причому один ген знаходиться в одному і тому ж локусі на кожній хромосомі хромосомної пари. Гомозиготна трансгенна рослина може бути отримана статевим схрещуванням (самозапиленням) незалежної-сегрегатної трансгенної рослини, яка містить один додатковий ген, що визначає деякі види посівного матеріалу (зернових) і аналізує отримані рослини для характеристики функціональної активності заданого гена, і спадковість Mendelian, що вказує на гомозиготність щодо контрольної (природної, не трансгенної) або незлежної сегрегатної трансгенної рослини. Дві різні трансгенні рослини можуть бути схрещені для отримання потомства, яке містить два незалежно сегрегуючих додаткових екзогенних гена. Самозапилення відповідних нащадків може забезпечити виробництво рослин, які є гомозиготними по відношенню до обох додаткових екзогенних генів, що кодують заданий поліпептид. Зворотне схрещування з батьківськими рослинами і ауткросроссинг (схрещування осіб різних ліній) з не трансгенним також входять в об'єм захисту даного винаходу. Трансформація протопластів може бути здійснена за способами, заснованими на осадженні кальцій-фосфату, обробці поліетилен-гліколем, електропорації і комбінації даних видів обробки (див., наприклад, Potrykus et al., 1985; Lorz et al., 1985; Fromm et al., 1985; Uchimiya et al., 1986; Callis et al., 1987; Marcotte et al., 1988). Застосування даних систем до плазми зародка різних рослин залежить від здатності регенерувати вказану специфічну різноманітність рослин з протопластів. Приклади способів регенерації хлібних злаків з протопластів описані в наступних роботах (див., наприклад., Fujimura et al., 1985; Toriyama et al., 1987; Yamada et al., 1986; Abdullah et al., 1986). Для того щоб трансформувати плазму зародка рослини, яка не може бути успішно регенерована з протопластів, можуть бути використані інші шляхи введення ДНК в непошкоджені клітини або тканини. Наприклад, при необхідності, може бути виконана регенерація зернових злаків з незрілих ембріонів або експлантатів, як описано в роботі (Vasil, 1988). ДНК може бути також введена в рослину безпосереднім перенесенням ДНК в пилок, відповідно до опису (Zhou et al., 1983; Hess, 1987). Експресія поліпептиду, що кодує гени, може бути отримана 90279 36 шляхом ін'єкції ДНК до репродуктивних органів рослини, як описано в роботі (De La Репа et al., 1987). ДНК може бути також методом ін'єкції безпосередньо введена в клітини незрілих ембріонів і поміщена в клітини шляхом повторного гідратування висушених ембріонів, як описано в роботі (Neuhaus et ai, 1987; Benbrook et al., 1986). Після здійснення доставки екзогенних ОАТ полінуклеотидів в клітини пшениці реципієнта наступна операція отримання трансгенних рослин пшениці по даному винаходу, в основному, торкається ідентифікації трансформованих клітин для подальшого культивування і регенерації рослини. Як вже було згадано в даному документі, для поліпшення здатності ідентифікації трансформантів існує можливість застосування селектабельного гена-маркера або гена-маркера здатного забезпечити скринінг або подібно, або додатково до ОАТ поліпептиду. В цьому випадку слід в цілому оцінити популяцію потенційно трансформованої клітини шляхом забезпечення дії на цю клітину селективним агентом або агентами, або здійснити скринінг кліток на задану характеристику гена-маркера. Ще однією особливістю даного винаходу є те, що комбінації селектабельних маркерів, рівно як і маркерів, які можуть піддаватися скринінгу, доцільно використовувати для ідентифікації трансформованих клітин. В деяких типах клітин і тканин селективний агент, наприклад, гліфосат або канаміцин можуть або не проявляти достатньої кілінгової активності, щоб точно розпізнати трансформовані клітини, або можуть викликати значне неселективне ингібування як трансформантів, так і не трансформантів, створюючи, таким чином, передумови для того, що винести рішення про неефективність вибраної технології відбору. Запропоновано, щоб за відбором за допомогою з'єднання, переважного зростання, наприклад, гліфосата, при концентраціях нижче тих, які спричиняють 100% ингібування, слідував скринінг тканини, що росте, для експресії гена-маркера, що піддається скринінгу, наприклад гена, який кодує стійкість до канаміцину, що дозволить регенерувати трансформантів з таких типів клітин або тканин, які не піддаються відбору самі по собі. Передбачається, що комбінації відбору і скринінгу дають можливість фахівцям ідентифікувати трансформації в більш широкому діапазоні різновидів типів клітин і тканин. Вирощування або регенерація рослин з одиночних протопластів рослин або з різних експлантатів добре відоме з рівня техніки (Weissbach і Weissbach, 1988). Дана регенерація і процес зростання включають етапи селекції трансформованих клітин, культивування таких відібраних клітин, починаючи від різних відомих стадій розвитку ембріона до стадії паростків з кореневою системою. Трансгенні ембріони і насіння також здатні до регенерації. Отримані трансгенні паростки (пагони) з кореневою системою потім висаджуються у відповідне середовище для зростання, наприклад, в грунт. Розвиток і регенерація рослин, що містять чужорідний екзогенний ген, який кодує заданий поліпептид, введений за допомогою Agrobacterium з експлантатів листя, можуть здійснюватися з вико 37 ристанням способів, добре відомих з рівня техніки, наприклад таких, які описані в роботі (Horsch et al., 1985). Відповідно до такої методики трансформанти культивуються у присутності селективного гена і в середовищі, що індукує регенерацію паростків (пагонів) в штамі рослини, який піддається трансформації, як описано в роботі (Fraley et al., 1983). Зокрема, в патенті США №5,349,124 (опис якого включений в даний документ методом посилання) детально описано отримання генетично трансформованих клітин латуку і вирощених з них рослин, які забезпечують експресію гібридних кристалічних протеїнів, що проявляють інсектицидну активність проти личинок Lepidopteran (лускокрилих) відносно таких рослин. За допомогою даної методики, звичайно, одержують паростки (пагони) протягом періоду від двох до чотирьох місяців, після чого дані паростки (пагони) переносяться у відповідне корінь - індукуюче середовище, що містить селективний агент і антибіотик, використовуваний для запобігання зростання мікробів. Паростки (пагони), в яких розвивається коренева система у присутності селективного гена для формування сходів (розсади), потім пересаджуються в грунт або інше середовище, що забезпечує зростання кореневої системи. Такі методики міняються залежно від вживаного штаму рослини, причому, ці варіації добре відомі з рівня техніки. Переважно, регенеровані рослини самозапилюються для отримання гомозиготних трансгенних рослин, або пилок від регенерованих рослин схрещується з виростаючими з насіння рослинами важливих агрономічних ліній. Лінії можуть бути або природженими (інбредними), або створеними штучно (аутбредними). При цьому, пилок рослин, які належать до таких важливих ліній, використовується для запилення регенерованих рослин. Трансгенна рослина по даному винаходу, що містить необхідний поліпептид, культивується з використанням способів, добре відомих з рівня техніки кваліфікованому в даній області фахівцю. В одному з прикладів здійснення винаходу трансгенна рослина по даному винаходу має збільшене число генів для ОАТ мРНК. Переважною трансгенною рослиною є незалежний сегрегат, при цьому він може передавати вказані гени і їх функції своєму потомству. Більш переважною трансгенною рослиною є гомозигота для ОАТ полінуклеотиду, яка переноситьїх всьому своєму потомству при схрещуванні. Насінина трансгенної рослини може бути вирощена на відкритому грунті або в теплиці. Отримані зрілі трансгенні рослини є самообпилювальними, з метою створення дійсно гібридних рослин. Потомство цих рослин утворює справжні гібридні лінії, які проходять експертизу на експресію ОАТ трансгенна. Було відзначено, що в деяких прикладах геном трансгенної рослини повинен стимулюватися в зростанні за допомогою постійного введення одного чи декількох ОАТ трансгенів, або природних, синтетично модифікованих, або мутованих. В деяких прикладах більш ніж один трансген повинен бути інкорпорований в геном трансформованої 90279 38 клітини-господаря. Це відбувається, коли більш одного ОАТ-кодуючих сегментів ДНК введено в геном такої рослини. В певних ситуаціях виникає необхідність в одному, двох, трьох, чотирьох і навіть більш ОАТ генах (або природних, або отриманих з використанням способів генної інженерії), які вводяться і постійно піддаються зкспресії в трансформованій трансгенній рослині. В одному з прикладів здійснення винаходу трансгенні рослини пшениці, що мають підвищений вміст ОАТ поліпептиду, набувають стимульованої (індукованої) або збільшеної толерантності до стресу (несприятливої дії навколишнього середовища). Термін "толерантність" розповсюджується на цілий ряд форм захисту від затримок в процесі завершення пригнічення альтерації в клітинному метаболізмі, зниження темпу зростання клітин та/або загибелі клітин, викликаної стресовою ситуацією. Переважно, трансгенні рослини пшениці по даному винаходу є толерантними до стресових умов в тому сенсі, що дані рослини пшениці, в основному, здатні нормально зростати в таких умови, коли дикоростуча рослина пшениці проявляє зниження темпів зростання, пригнічений метаболізм, знижену життєздатність і продуктивність та/або чоловічу або жіночу стерильність. В контексті даного винаходу термін "толерантність до стресу" відноситься до поняття здатності зростати і відтворювати біомасу під час стресу (несприятливої дії навколишнього середовища), до здатності відновлювати зростання і відтворення біомаси після стресу, а також до здатності переживати (долати) стрес. Термін "толерантність до стресу" також відноситься до здатності рослини сприймати і слідувати програмам розвитку під час стресу рівно таким же чином, неначебто це відбувається не в стресових умовах, наприклад, до здатності рослини переключатися від стану спокою до стану проростання і до переходу з вегетативної фази в репродуктивну в стресових умовах за програмою, характерною для рослини, що не знаходиться в стресовій ситуації. Методологічні прийоми визначення інтенсивності зростання рослин або її реакції на стрес включають, але не обмежуються такими діями, як вимірювання ваги, площі листа, водного балансу рослини, визначення здібності до цвітіння, а також до здатності генерації потомства і забезпечення врожайності і цілого ряду інших методик, відомих кваліфікованому фахівцю з рівня техніки. Термін "стрес" включає поняття біотичного стресу, тобто стресу, викликаного патогеном, включаючи віруси, бактерії, грибкові інфекції, комах, паразитів, а також їх комбінації, рівно як і поняття стресу, створеного дією умов навколишнього середовища, зокрема, коли згубний вплив навколишнього середовища дає можливість патогену подолати природну толерантність рослини до стресу. Термін "патоген" означає такі організми, які надають негативної дії фізіологічному стану рослини. Перелік патогенов включає, не обмежуючись перерахованим, наступне: віруси, бактерії, грибки, паразити і сільськогосподарські шкідники, напри 39 клад, комахи і хвороботворні бактерії, які здатні погіршувати фізіологічний стан рослини. Термін "стрес від дії навколишнього середовища" визначає поняття, яке в існуючому рівні техніки зустрічається під різними назвами і у великій мірі перекликається з поняттям, визначуваним терміном "осмотичний стрес (шок)". Робота Holmberg & Bulow, 1998, (Trends Plant Sci. 3,61-66), наприклад, дає визначення чинникам, що викликають абіотичний стрес під впливом навколишнього середовища. Осолонення, засуха, спека, холод і мороз, - всі ці явища є прикладами умов, які викликають стрес Термін "осмотичний стрес від дії навколишнього середовища" в контексті даного винаходу відноситься до будь-якого несприятливого впливу на метаболізм, зростання або життєздатність клітини, тканини, насіння, органу або всієї рослини, який спричиняється неживими або небіологічними чинниками несприятливого навколишнього середовища. Більш конкретно, дане поняття включає такі чинники навколишнього середовища, як сольова дія, несприятлива дія, пов'язана з водним балансом (затоплення, стоячі води, засуха, обезводнення), анаеробний (низький зміст кисню, СО2), стрес, аеробний стрес, осмотичний стрес, температурний стрес (жара/нагрівання, холод, заморожування, мороз) або нестача живильних речовин, згубна дія шкідливих викидів в атмосферу (важкі метали, токсичні хімічні речовини), озону, інтенсивного освітлення або поєднання вказаних чинників. В одному з переважних прикладів здійснення даного винаходу трансгенні рослини пшениці, відповідні до винаходу, підвищили здатність протистояти сольовому стресу. Терміни "сольовий стрес", "стрес, викликаний осолоненням" або подібні ним терміни відносяться до поняття будь-якого стресу, асоційованого з або викликаного підвищеними концентраціями солі, які приводять до пертурбації в потенціалу внутріклітинного осмосу або навколоклітинного оточення клітини. Зокрема, відповідні до даного винаходу рослини пшениці з сольовою толерантністю здатні проявити, щонайменше, 350% збільшення врожайності зерна порівняно з нетрансформованими рослинами дикоростучої пшениці в присутності, принаймні, 150мМ NaCl. Використовуючи, наприклад, операцію, застосовану при описі прикладу 6 здійснення даного винаходу, infra трансгенні рослини можуть бути випробувані в гідропонній системі при 150мМ солі порівняно з таким культурним комерційним сортом, як Westonia. Наприклад, 10 трансгенних рослин із сіль-толерантної лінії 2490.1 були сегреговані (підрозділені) на три рівні сольової толерантності (див. Фіг.4). Щонайвища група з 2490.1 мала в 3,5 разу більший показник по кількості зерна, вазі зерна, кількості пагонів і кількості головок (колосків) на одну рослину, ніж Westonia і трансгенна група з низькою сольовою толерантністю. В одному з прикладів здійснення винахід розкриває харчовий продукт, виготовлений з рослини, відповідної до даного винаходу. В контексті даного винаходу термін "харчовий продукт" означає по 90279 40 няття речовини, яка може бути метаболізованою організмом для надання йому енергії і можливості будівництва тканин і яка може бути представлена у вигляді рідкого або твердого харчового продукту. В описі даного винаходу слово "містять" і його похідні, наприклад, "що містить" або "містить" означає "включають до свого складу, але не обмежуються названим" і не виключає наявності інших добавок, компонентів, деяких цілі матеріальних об'єктів або дій. Далі даний винахід описується з використанням посилань тільки на наступні приклади здійснення, що не обмежують об'єму захисту даного винаходу. Проте, слід мати на увазі, що дані приклади наведені тільки з метою ілюстрації і не можуть розглядатися як чинники, що обмежують повний об'єм захисту винаходу, описаного вище. Зокрема, якщо винахід описується в деталях щодо використовування специфічного ОАТ гена в двох різновидах пшениці, це не означає, що знайдені технічні рішення обмежуються тільки вказаним джерелом ОАТ генів і лише цими різновидами пшениці. Приклад 1 Ген орнітин-амінотрансферази (ОАТ) Ген ОАТ був виділений з Arabidopsis thaliana в бінарний вектор. Для трансформації в пшениці ген був посилений ампліфікацією PCR (полимерноланцюговою реакцією) і перенесений у вектор pGBA2, використовуючи сайти рестрикції BamHl і Kрn1. Праймерами для ампліфікації гена ОАТ сайтами рестрикції BamHl (5' кінець) і Kpn1 (3' кінець) стали: Передній праймер 5' GCATGGATCCGCTTCACAATGGCAGCAGC CACCACG Сайт BamHl підкреслений, а стартовий (початковий) кодон - виділений. Задній (реверсивний) праймер 5' GCATGGTACCGAAAGCTGGGTTCAAGCATA GAGG Сайт Kpn1 підкреслений, а заключний кодон виділений. Праймерами, використаними для ідентифікації гена Arabidopsis OAT в трансформованій пшениці, є: Передній праймер 5' GAGTTGTGACAATGATGCTACTCGTGG Задній праймер 5' CGAGTACATCGTGAAGAGCCTCAGATCC Довжиною прогнозованого продукту PCR став фрагмент 770bр. Ампліфікація гена ОАТ з сайтами рестрикції BamHl і Kpn1 була виконана Рfu ДНК-полімеразою (Promega). Реактиви і технологічний процес описані в інструкції, супроводжуючій поставку Рfu. Продукт PCR виробляли на 1% агароза-гелі і порівнювали з 1кб плюс ДНК молекулярним ледером. Продукт, отриманий в результаті ампліфікації, був очищений від агарозИ-геля за допомогою комплекту для очищення ДНК Ultraclean (Geneworks) у відповідності до інструкцій виготівника. Задану зону вирізали з геля, додавали 3 гелевих об'єми Ultra-salt (ультрасолі) і суміш інкубува 41 ли при 65°С протягом 5 хвилин для розчинення агарози. Додавали 5-7мкл кремнієвого матриксу ультразв'язування (Ultra-Bind silica matrix), розчин ретельно перемішували і пробірку інкубували при кімнатній температурі протягом 5 хвилин для зв'язування ДНК. Матрикс Bresa-зв'язування/ДНК (Bresa-Bind/DNA matrix) таблетували (гранулювали) методом центрифугування при (20,800g) протягом 5 секунд, зливали надосадову рідину і осад повторно суспендували в 1мл ультрапромивального розчину (Ultra-Wash) при інтенсивному перемішуванні протягом 10 секунд. Після цього пробірку центрифугували протягом 5 секунд і всі сліди надосадової рідини видаляли шляхом підсосу. Елюціювали ДНК з ультразв'язування (Ultra-Bind) шляхом повторного суспендування гранульованого осаду, отриманого в результаті центрифугування, в двох об'ємах дистильованої води, інкубували при кімнатній температурі протягом 5 хвилин, центрифугували протягом 1 хвилини при (20,800g) і видаляли надосадну рідину, що містить ДНК, в нову пробірку. Ампліфікація фрагменту гена ОАТ для скринінгу рослин пшениці, що містять ген, була здійснена таким чином: Інгредієнтами PCR були: 4мМ MgCl2, 10мМ Tris-HCL, 50мМ KСl, 0,75мМ dNTP і 0,2пмол кожного праймера. Режими реакції: при 94оС протягом 3хв., потім 35 циклів при 94оС протягом 30сек, при 60оС протягом 30сек. і при 72оС протягом 2хв. Реакція відбувалася при 72оС протягом 7хв. до того, як встановлювалася температура 15оС. Потім здійснювали реакцію PCR на 1% агароза-гелі і порівнювали з 1кб плюс ДНК молекулярним лед єром. Приклад 2 клонування гена ОАТ у векторі PGBA2 Продукт гена ОАТ з сайтами рестрикції BamHl і Kpn1 з Прикладу 1 був вирізаний ензимами рестрикції BamHl і Kpn1 і лігуваний у вектор pGBA2, також вирізаний BamHl і Kpn1 між убіквітарним промотором (Ubiquitin promoter) і зейнтермінатором. Убіквітарний промотор, ген ОАТ і зейн-термінатор утворюють конструкцію ОАТ (Фіг.1). Е. coli штам DH10b - компетентні клітини були трансформовані сумішшю лігування і поміщені на LB агар, вміщаючий ампіцилін для відбору Е. coli клітин, трансформованих за допомогою pGBA2. Трансформовані Е. coli колонії були потім тестовані на наявність гена ОАТ в pGBA2 плазміді шляхом PCR-ампліфікації фрагменту 770bр гена ОАТ. Присутність гена ОАТ була підтверджена гідролізатом рестрикції і відповідністю відібраного зразка наперед підготовленому зразку з розмірами фрагменту. Приклад 3 Секвенування гена ОАТ Секвенування проводилося на одному з клонів, ідентифікованому в Прикладі 2, використовуючи автоматичний секвенатор АВІ377 (використовуваний в промислових біосистемах) відповідно до інструкцій виготівника. Секвенування здійснювали з використанням передніх і задніх праймерів, узятих з Прикладу 1, які генерують фрагмент 770bр плюс ще один внутрішній праймер (5' ACAATTGCTAATGTACGTCC). Програмне забез 90279 42 печення версії 1.0.3 SeqEd (використовуване в промислових біосистемах) було застосовано для аналізу необроблених даних, і MultAlin (Corpet, 1988) веб-базована програма була застосована для вирівнювання (корекції) послідовності відповідно до передбачуваної Arabidopsis OAT -генної послідовності з банку генів (Genbank) (NM 123987). На Фіг.2 показана отримана нуклеотидна послідовність, а на Фіг.3 показана амінокислотна послідовність ОАТ. Приклад 4 Виробництво трансгенних рослин пшениці з ОАТ-конструкцією Популяція рослин трансгенної пшениці, що містить конструкцію ОАТ, відповідно до Прикладу 2, генерувалася, використовуючи наступні операції: Приготування конструкції ОАТ Компонент pGBA2, що містить конструкцію ОАТ, обробляли НаеІІ для отримання фрагменту, що включає конструкцію ОАТ і 177bp pGBA2 у позиції 5' закінчення конструкції і 283bp pGBA2 в положенні 3' закінчення конструкції (Фіг.1). Конструкція ОАТ оброблялася на 1% агароза-гелі, і ДНК екстрагувалася з геля відповідно до Прикладу 1. ДНК була повторно суспендована у воді до концентрації 500нг/мкл. Тканина-мішень Рослини пшениці (культивовані сорти: Westonia і Carnamah) вирощували при температурі 22-24°С в теплиці. Насіння, що містило незрілі ембріони, було зібране на 11-15 день після цвітіння (post-anthesis) і поверхня стерилізована. Незрілі ембріони були вирізані і поміщені на середовище MS (Murashige and Skoog, 1962), що містить 2,5мг/л 2,4 дихлорофеноксиоцтової кислоти (2,4D) перед бомбардуванням (опромінюванням мікрочастинками). Бомбардування (опромінювання) мікрочастинками Обробка осмосу тканин-мішеней, осадження ДНК і бомбардування (опромінювання) мікрочастинками були здійснені відповідно до технології, описаної відносно цукрового очерету (Bower et al., 1996), відмінної використовуванням вольфрамових частинок. Тканини пшениці опромінювалися при використовуванні 50мкг золотих частинок на один сеанс опромінювання. Лінійними фрагментами, використаними для опромінювання, були конструкції САН (Weeks et al., 2000), які кодували ген цианамід-гідратази, з метою розщеплення цианаміду, при рівних молекулярних концентраціях з лінійною конструкцією ОАТ. Селекція Після опромінювання ембріони поміщали на два тижні на MS - середовище, що містить 2,5мг/л 2,4-D, при температурі 24°С і відсутності освітленості, переносили в таке ж середовище плюс 40мг/л цианаміду (Sigma) на подальші шість тижнів при ідентичних умовах вмісту культури з оновленням (використовуванням свіжого середовища) кожні два тижні. Потім тканину переносили на MS середовище, що містить 0,1мг/л 2,4-D і 40мг/л цианаміду, і виносили на світло для регенерації. За два тижні тканину переносили на MS середовище мінус аспарагін і глютамін і з 0,1мг/л 2,4-D і 55мг/л цианаміду (С2 середовище). Через два тижні тка 43 нину переносили в С2 середовище без 2,4-D і з 65мг/л цианаміду (С3 середовище). З тканин розвивалося здорове потомство, яке потім переносилося в 1/2 MS середовище плюс 65мг/л цианаміду. Як тільки вони починали розвивати кореневу систему, їх переносили в теплицю в суміш горщика. Приклад 5 Трансгенні дослідження на основі PCR (полімерно-ланцюгової реакції) Щоб довести, чи дійсно рослини, вирощені відповідно до Прикладу 4, містять трансген гена Arabidopsis OAT, фрагмент гена був ампліфікований (посилений; розширений) шляхом PCR (полимерно-ланцюгової реакції). Спосіб екстракції ДНК з листа рослини пшениці був детально описаний в інструкціях для Nucleon PhytoPure (Amersham Biosciences) no екстрагуванню ДНК з рослин. Праймери PCR і режими ампліфікації фрагменту 770bр описані в Прикладах 1 і 2. Приблизно, 50% трансгеників, отриманих з системи селекції, містили ген ОАТ. Приклад 6 Скринінг сольової толерантності шляхом використовування соляної гидропонової системи Після ідентифікації рослин пшениці з геном ОАТ трансгенним ТО-рослинам надали можливості дати насіння, яке потім було зібране для проведення скринінгу з використанням соляної гідропонової системи. З попередніх експериментів було стало ясно, що наявність 150мМ солі значно уповільнює зростання рослини і викликає раннє дозрівання насіння. Насіння було посіяне в азбестові кубики (одна насінина на кубик). Йому була надана можливість зійти і виростати у воді до того часу, доки вони не досягнуть висоти 10см. Після цього рослини були перенесені в 41 перфорований горщик з базальтовим скельним грунтом (мідним штейном, 2см). Горщики розташували в гідропоновій системі з безперервним потоком 1/2 розчину Hoaglands, наповненого до висоти на 2см нижче за верхній рівень базальтового скельного грунту. Було виса 90279 44 джено по 5 рослин на горщик і по два горщики на трансгенну лінію. Протягом трьох діб рослинам надавали можливості пристосовуватися до гідропонної системи, перш ніж розчин був підготовлений до досягнення сольового значення 50мМ, використовуючи NaCl:CaCl2 при співвідношенні 9:1, відповідно. Розчин перевірявся і коригувався з використанням сольового значення 50мМ кожні три дні до тих пір, доки не була досягнута величина 150мМ. Після цього вміст солі в розчині підтримувався на рівні 150мМ. Наповненість резервуару даної системи постійно контролювалася і коригувалася з використовуванням 1/2 розчину Hoaglands, виходячи з показників, що змінювалися з урахуванням випаровування і відбору живильних речовин рослинами. Як тільки рослини завершували свій життєвий цикл, був зібраний урожай для проведення фенотипових вимірювань. Такі вимірювання включали визначення кількості пагонів на рослину, кількість колосків на рослину, вагу насіння на рослину і число насінин на рослину. Трансгенна лінія 2490.1 в гідропонній системі продемонструвала сольову толерантність при 150мМ солі. Рослини 10 2490.1, що тестувалися, показали сегрегацію до сольової толерантності, підрозділившись на три значно відмінні одна від одної групи (Фіг.4). Група з високою сольовою толерантністю, група з середньою сольовою толерантністю і не толерантна відносно сольової дії група співвідносилися як 1:2.5:1.5, відповідно. Трансгенні рослини 2490.1 в таблиці представляють групу з високою сольовою толерантністю, тоді як нульові сегрегатИ представляють рослини з нетолерантної групи. Таблиця демонструє більш ніж в 3,5 разів збільшення числа пагонів, числа колосків і ваги насіння високосольових сегрегатів 2490.1 порівняно з Westonia і низько сольовими (не толерантними) сегрегатами 2490.1. Що стосується кількості насінин, високосольові сегрегати продемонстрували показник в 4 рази більший, ніж два інших типи. Таблиця Число пагонів, число колосків, число насінин і вага насіння трансгенних рослин, що показали позитивні результати щодо сольової толерантності, комерційного виду (Westonia) і нульових сегрегатів. S.D. - це стандартне відхилення від середнього показника. Westonia - тіньовий фенотип трансгенної рослини 2490.1 Зразок Число пагонів Число колосків Число насінин Вага насіння Трансгенна рослина 2490.1 Westonia Середнє знаСереднє знаS.D. чення чення 13,5 3,5 2,8 11 1,4 2,6 218 57,3 49,9 7,65 0,58 1,54 Приклад 7 Оцінка толерантності до морозу Насіння з Т2 генерації рослин, що містить ОАТ трансген (лінії 2490.1 і 2721.1), було висаджене по 4 насінини у 4л горщик (містить знезаражену горщикову суміш фертилізер) і вирощене в приміщенні з контрольованим середовищем. Режими усередині приміщення були наступними: 20°С в S.D. 1,32 1,17 24,2 0,95 Нульовий сегрегат Середнє знаS.D. чення 3,7 1,15 3 0 52,7 13,5 2,09 0,82 денний час (12 годин, починаючи з 3:00 дня) і 14°С у нічний час (12 годин). Приблизно, за 20 діб до цвітіння температура була знижена в денний час на 2°С кожний другий день і нічна температура на 2°С кожну третю ніч з досягненням остаточної температури в денний час 8°С і 4°С в нічний час. 45 Як тільки починалося цвітіння, рослини переносилися в підморожуючу камеру (з пологими полицями, обладнаними охолоджуючими пристроями і настилом з контрольованою температурою для кореневої системи), де температуру знижували від 4°С до -4°С і де температура зберігалася протягом трьох годин, перш ніж знову повернутися до 4°З. Цей процес протікав протягом 12 годин і після його закінчення рослини повертали в приміщення з контрольованим середовищем. Температуру в приміщенні з контрольованим середовищем підвищували таким чином, що в денний час вона зростала на 2°С кожний другий день, а в нічний час вона зростала на 4°С кожну третю добу, починаючи з сьомого дня після приморожування, до досягнення остаточної температури 24°С в денний час і 18°С ніччю. Через тринадцять днів після приморожування рівень розвитку насінин трансгенних рослин і відповідних контрольних екземплярів оцінювався відносно стадії розвитку колосу пшениці. В способі підрахунку нетрансгенні рослини Westonia, які не підморожували, використовували як базової лінії (0-значення) для підморожених рослин Westonia, а не підморожені рослини трансгенної лінії 2490.1 і Carnamah використовували як базової лінії для тих Carnamah і 2721.1, що підморожували. Шкала вимірювань складала від 0 до 5, причому, порівняно з базовою лінією, при значенні 5 або не спостерігалося ніякого розвитку насінин, або інтенсивність їх розвитку була незначною. Обидві підморожувані трансгенні лінії продемонстрували значне зниження в рівні інтенсивності впливу на розвиток насіннин (Фіг.5) відносно підморожуваних контрольних варіантів (Westonia і Carnamah різновиди пшениці). В середньому, інтенсивність такого впливу виявилася в три рази нижче. Тому приведені початкові результати дають підставу припустити, що трансгенні рослини є також толерантними до підморожування (морозостійкими). Посилання 1. Abdullah et al., 1986, Bio/Technology, 4: 10871090. 2. Benbrook et al., 1986, In: Proceedings Bio Expo 1986, Butterworth, Stoneham, Mass., pp. 27-54. 3. Bevan et al., 1983, Nucleic Acids Res. 11:369385. 4. Bower et al., 1996, Molecular Breeding, 2, 239249. 5. Bytebier et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84:5345-5349. 6. Callis et al., 1987, Genes and Development, 1:1183. 7. Capecchi, 1980, Cell, 22(2 Pt2):479-88. 8. Cheng et al., 1998, Applied Biological Sciences, Vol. 95, Issue 6, 2767-2772. 9. Christensen & Quail, 1996, Transgenic Res., 5, 213-218. 10. Clapp, 1993, Clin. Perinatol. 20(l):155-168. 11. Corpet, 1988, Nucl. Acids Res., 16(22), 10881-10890. 12. Cristou et al., 1988, Plant Physiol., 87:671674. 90279 46 13. Curiel et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88(19):8850-8854. 14. Curiel et al., 1992, Hum. Gen. Ther. 3(2):147154. 15. Cushmore et al., 1983, Gen. Eng. of Plants, Plenum Press, New York, 29-38. 16. De la Pena et al., 1987, Nature, 235:274-276. 17. Eglitis & Anderson, 1988(a), Biotechniques, 6(7):608-614. 18. Eglitis et al., 1988(b), Adv. Exp. Med. Biol. 241:19-27. 19. Ellis et al. 1987, EMBO J. 6:11-16. 20. Fischhoff et al., 1987, Bio/Technology, 5:807813. 21. Fraley et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 80:4803-4807. 22. Fraley et al., 1985, Biotechnology, 3:629. 23. Fromm et al., 1985, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 82:5824. 24. Fujimura et al., 1985, Plant Tissue Culture Letters, 2:74. 25. Fynan et at., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90(24): 11478-11482. 26. Gallie et al., 1989, Plant Cell, 1:301-311. 27. Graham & van der Eb, 1973, Virology, 54(2):536-539. 28. Herrera-Estrella et al., 1983, Nature, 303:209. 29. Hess, 1987, Intern Rev. Cytol., 107:367. 30. Horsch et al., 1985, Science, 227:1229-1231. 31. Ishida et al., 1996, Nature Biotechnology, 14 (6):745-50. 32. Johnston & Tang, 1994, Methods Cell. Biol 43(A):353-365. 33. Jorgensen et al., 1987, Mol. Gen. Genet., 207:471-477. 34. Joshi, 1987, Nucl. Acids Res., 15:6643-6653. 35. Kawatae et al., 1988. 36. Kay et al., 1987, Science, 236:1299-1302. 37. Keller et al., 1989, The EMBO Journal, 8:1309-1314. 38. Klee et al., 1985, In: Plant DNA Infectious Agents, Hohn & Schell, eds., Springer-Verlag, New York pp. 179-203. 39. Klein et al., 1987, Nature, 327:70. 40. Klein et al., 1988, Proc. Natl Acad. Set, USA, 85:8502-8505. 41. Langridge et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86:3219-3223. 42. Lorz et al., 1985, Mol. Gen. Genet., 199:178. 43. Lu et al., 1993, J. Exp. Med. 178(6):20892096. 44. Ma et al., 1988, Nature, 334:631-633. 45. Macejak & Sarnow, 1991, Nature, 353:90-94. 46. Marcotte et al., 1988, Nature, 335:454. 47. McBride and Summerfelt, 1989. 48. McElroy et al., 1990, Plant Cell 2: 163171. 49. Medberry et al., 1992, The Plant Cell, 4: 185192. 50. Murashige & Skoog, 1962, Physiol. Plant. 15:473-497. 51. Neuhaus et al., 1987, Theor. Appl. Genet., 75:30. 52. Omirulleh et al., 1993, Plant Molecular Biology, 21:415-428. 47 53. Pelletier & Sonenberg, 1985, Mol. Cell. Biol. 5:3222-3230. 54. Pelletier & Sonenberg, 1988, Nature, 334: 320-325. 55. Potrykus et al., 1985, Plant Molecular Biology Reporter, 3:117-128. 56. Poulsen et al., 1986, Mol. Gen. Genet., 205:193-200. 57. Rogers & Bendich, 1988, Plant Mol. Biol. A6: 1-10. 58. Simpson et al., 1986, Science, 233:34-38. 59. Spielmann et al., 1988, Nucleic Acids Res., 16:1199. 60. Toriyama et al., 1987, Plant Sci., 48: 123-128. 61. Uchimiya et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 204: 204-207. 62. Van Tunen et al., 1988, EMBO J., 7:1257. 63. Vasil et al., 1989, Plant Physiol. 91: 15751579. 90279 48 64. Vogel et al., 1989, J. Cell Biochem., (supplement 13D, 312). 65. Wagner et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89(13):6099-6103. 66. Weeks et al., 2000, Crop Science, 40: 17491754. 67. Weissbach & Weissbach, 1988, In: Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, Inc., San Diego, Calif. 68. Wenzler et al., 1989, Plant Mol. Biol, 12:4150. 69. Winters al., 1988, Mol. Gen. Genet., 221(2):315-319. 70. Wong & Neumann, 1982, Biochim. Biophys. Res. Commun. 107(2):584-587. 71. Yamada et al., 1986, Plant Cell Rep., 4:85. 72. Yang et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87:4144-4148. 73. Zhou et al., 1983, Methods in Enzymology, 101:433. 49 90279 50 51 90279 52 53 90279 54 55 Комп’ютерна верстка О. Гапоненко 90279 Підписне 56 Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601