Високоактивні рекомбінантні віруси грипу для вакцин і генотерапії

1. Композиція, яка містить множину векторів вірусу грипу, що включає: 2 (19) 1 3 92132 4 кодує НА вірусу грипу, вектор для продукування 15. Спосіб за п. 14, який додатково включає видімРНК, який містить промотор, функціонально зв'ялення вірусу. 16. Спосіб за п. 14, який відрізняється тим, що заний із сегментом ДНК, що кодує NA вірусу грипу, вектор клітина являє собою клітину 293Т. для продукування мРНК, який містить промотор, 17. Спосіб одержання носія для доставки гена, функціонально зв'язаний із сегментом ДНК, що який включає введення клітин в контакт із компокодує М1 вірусу грипу, вектор для продукування зицією за будь-яким із пп. 8-11 у кількості, ефектимРНК, який містить промотор, функціонально зв'явній для одержання вірусу грипу, і заний із сегментом ДНК, що кодує М2 вірусу грипу виділення вірусу. або вектор для продукування мРНК, який містить 18. Спосіб одержання вірусу грипу, який включає промотор, функціонально зв'язаний із сегментом введення клітини в контакт з вектором для продуДНК, що кодує NS2 вірусу грипу. кування вРНК, який містить промотор, функціона2. Композиція за п. 1, яка відрізняється тим, що льно зв'язаний з кДНК РА вірусу грипу, зв'язаною з кДНК РВ1, РВ2, РА, NP, М та NS мають амінокистермінатором, вектором для продукування вРНК, лотну послідовність, яка на щонайменше 90 % який містить промотор, функціонально зв'язаний з ідентична одній із Послідовностей № 1-6 або їх кДНК РВ1 вірусу грипу, зв'язаною з термінатором, комплементів. вектором для продукування вРНК, який містить 3. Композиція за п. 1, яка відрізняється тим, що промотор, функціонально зв'язаний з кДНК РВ2 кДНК РВ1, РВ2, РА, NP, М та NS кодують поліпепвірусу грипу, зв'язаною з термінатором, вектором тид з однією або декількома консервативними задля продукування вРНК, який містить промотор, мінами, порівняно з відповідним поліпептидом, що функціонально зв'язаний з кДНК НА вірусу грипу, кодується однією з Послідовностей № 1-6. зв'язаною з термінатором, вектором для продуку4. Композиція за п. 1, яка відрізняється тим, що вання вРНК, який містить промотор, функціональпромотор РНК-полімерази І є промотором людсьно зв'язаний з кДНК NP вірусу грипу, зв'язаною з кої РНК-полімерази І. термінатором, вектором для продукування вРНК, 5. Композиція за п. 1, яка відрізняється тим, що який містить промотор, функціонально зв'язаний з кожен вектор підмножини а) знаходиться на окрекДНК NA вірусу грипу, зв'язаною з термінатором, мій плазміді. вектором для продукування вРНК, який містить 6. Композиція за п. 1, яка відрізняється тим, що промотор, функціонально зв'язаний з кДНК М вірукожен вектор підмножини b) знаходиться на окресу грипу, зв'язаною з термінатором, вектором для мій плазміді. продукування вРНК, який містить промотор, 7. Композиція за п. 1, яка відрізняється тим, що функціонально зв'язаний з кДНК NS вірусу грипу, кожен із векторів підмножини b) додатково містить зв'язаною з термінатором, вектором для продукутермінатор РНК. вання мРНК, який містить промотор, функціональ8. Композиція за п. 1, яка додатково містить векно зв'язаний із сегментом ДНК, що кодує РА вірусу тор, який містить промотор, зв'язаний з 5'грипу, вектором для продукування мРНК, який кінцевими послідовностями вірусу грипу (що вклюмістить промотор, функціонально зв'язаний із сегчають 5'-кінцеві некодувальні послідовності вірусу ментом ДНК, що кодує РВ1 вірусу грипу, вектором грипу), зв'язаними з відповідною кДНК, зв'язаною з для продукування мРНК, який містить промотор, 3'-кінцевими послідовностями вірусу грипу (що функціонально зв'язаний із сегментом ДНК, що включають 3'-кінцеві некодувальні послідовності кодує РВ2 вірусу грипу і вектором для продукуванвірусу грипу), зв'язаними з термінатором. ня мРНК, який містить промотор, функціонально 9. Композиція за п. 8, яка відрізняється тим, що зв'язаний із сегментом ДНК, що кодує NP вірусу згадана відповідна кДНК має смислову орієнтацію. грипу, з одержанням інфекційного вірусу, причому 10. Композиція за п. 8, яка відрізняється тим, що кДНК РВ1, РВ2, РА, NP, М та NS мають кодувальні згадана відповідна кДНК має антисмислову орієнділянки для поліпептиду, який має амінокислотну тацію. послідовність із щонайменше 90 % ідентичністю 11. Композиція за п. 8, яка відрізняється тим, що до амінокислотної послідовності відповідного полізгадана відповідна кДНК містить відкриту рамку пептиду, який кодується однією з Послідовностей зчитування, що кодує імуногенний поліпептид чи № 1-6, та причому кДНК НА та NA не мають Поспептид патогенного мікроорганізму або терапевтилідовностей № 7 або Послідовності № 8, причомучний поліпептид чи пептид. кДНК НА являє собою кДНК підтипу Н5, та причо12. Композиція за п. 1, яка відрізняється тим, що му згадані вектори для продукування вРНК містять кДНК РВ1, РВ2, РА, NP, М та NS мають кодувальпромотор РНК-полімерази І та термінатор РНКну ділянку для поліпептиду, що кодується однією з полімерази І. 19. Спосіб за п. 18, який відрізняється тим, що Послідовностей № 1-6. 13. Композиція за п. 1, яка відрізняється тим, що клітина являє собою клітину 293Т. 20. Спосіб за п. 18, який відрізняється тим, що кДНК РВ1, РВ2, РА, NP, М та NS кодують поліпептид, який має амінокислотну послідовність із щовключає вектор для продукування мРНК, який міснайменше 99 % ідентичністю до амінокислотної тить промотор, функціонально зв'язаний із сегменпослідовності поліпептиду, який кодується однією том ДНК, що кодує НА вірусу грипу, вектор для з Послідовностей № 1-6. продукування мРНК, який містить промотор, функ14. Спосіб одержання вірусу грипу, який включає ціонально зв'язаний із сегментом ДНК, що кодує введення клітини в контакт з композицією за будьNA вірусу грипу, вектор для продукування мРНК, яким із пп. 1-13 у кількості, ефективній для одерякий містить промотор, функціонально зв'язаний із жання інфекційного вірусу грипу. сегментом ДНК, що кодує М1 вірусу грипу, вектор 5 92132 6 для продукування мРНК, який містить промотор, поліпептид, який має амінокислотну послідовність функціонально зв'язаний із сегментом ДНК, що із щонайменше 99 % ідентичністю до амінокислоткодує М2 вірусу грипу, і вектор для продукування ної послідовності поліпептиду, який кодується одмРНК, який містить промотор, функціонально зв'янією з Послідовностей № 1-6. 26. Спосіб за п. 14, 17 або 18, який відрізняється заний із сегментом ДНК, що кодує NS2 вірусу грипу. тим, що кДНК РВ1, РВ2, РА, NP, М та NS мають 21. Спосіб за п. 14 або п. 20, який додатково вклюкодувальну ділянку для поліпептиду, що кодується чає вектор, який містить промотор, зв'язаний з 5'однією з Послідовностей № 1-6. кінцевими послідовностями вірусу грипу (що вклю27. Спосіб за будь-яким із пп. 14-26, який додаткочають 5'-кінцеві некодувальні послідовності вірусу во включає виділення вірусу. грипу), зв'язаними з відповідною кДНК або її фраг28. Виділений реасортантний вірус грипу, який ментом, зв'язаною з 3'-кінцевими послідовностями містить вірусні геномні РНК, які відповідають таким вірусу грипу (що включають 3'-кінцеві некодувальні самим нуклеотидним послідовностям, що й Посліпослідовності вірусу грипу), зв'язаними з термінадовності № 1-6, та відповідають кодувальним постором. лідовностям для поліпептидів, що кодуються Пос22. Спосіб за п. 21, який відрізняється тим, що лідовностями № 1-6, та вірусні геномні РНК НА та згадана відповідна кДНК містить відкриту рамку NA, які не мають послідовностей, що відповідають зчитування, що кодує імуногенний поліпептид чи Послідовностям № 7 або Послідовності № 8, припептид патогенного мікроорганізму або терапевтичому вірусна геномна РНК НА являє собою РНК чний поліпептид чи пептид. підтипу Н5, та причому даний реасортантний вірус 23. Спосіб за п. 21, який відрізняється тим, що виростає на яйцях до одержання титру щонаймезгадана відповідна кДНК має смислову орієнтацію. нше 1010 EID/мл. 24. Спосіб за п. 21, який відрізняється тим, що 29. Реасортантний вірус за п. 28, який відрізняється тим, що НА підтипу Н5 являє собою мутантзгадана відповідна кДНК має антисмислову орієнтацію. ний Н5. 25. Спосіб за п. 14, 17 або 18, який відрізняється тим, що кДНК РВ1, РВ2, РА, NP, М та NS кодують Ця заявка, відповідно до §119(е) розділу 35 Кодексу законів США, претендує на пріоритет за заявкою США № 60/473,798, поданої 28 травня 2003 року, розкриття якої включено до цього опису шляхом посилання. Цей винахід було здійснено на грант уряду Сполучених Штатів Америки (грант АІ-47446 від Національного інституту алергії і інфекційних захворювань Федерального відомства охорони здоров'я США). Уряд може мати певні права на цей винахід. Віруси з негативним геномом розподіляються на сім сімейств (Rhabdoviridae, Paramyxoviridae, Filoviridae, Bornaviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae і Arenaviridae), які включають поширені людські патогенні мікроорганізми, наприклад, респіраторний синцитіальний вірус, вірус грипу, вірус кору, вірус Ебола, а також віруси тварин, що спричинюють значні економічні втрати у галузях птахівництва і тваринництва (наприклад, вірус ньюкаслської хвороби і вірус чуми великої рогатої худоби). Чотири перші сімейства характеризуються несегментованими геномами, у той час як геноми трьох останніх складаються з шести-восьми, трьох або двох сегментів "мінус-ниткової" PHK, відповідно. Загальною характерною рисою вірусів із негативним геномом є зворотна орієнтація геному PHK; тобто вірусна PHK (вPHK) є комплементарною до мPHK і, унаслідок цього, не може сама по собі викликати інфекційного процесу. Для ініціювання транскрипції і реплікації вірусу, вPHK повинна транскрибуватись на "плюс-ланцюгову" мPHK або кPHK, відповідно, за допомогою комплексу вірусних полімераз і нуклеопротеїну; у разі вірусу грипу А, комплекс вірусних полімераз включає три полімеразні білки РВ2, РВ1 і РА. Під час реплікації вірусу кPHK відіграє роль матриці для синтезу нових молекул вPHK. Для усіх "мінусниткових" вірусів, некодувальні ділянки на 5'- і 3'кінцях вPHK і кPHK є критичними для транскрипції і реплікації вірусного геному. На відміну від клітинних або вірусних транскриптів мPHK, як кPHK, так і вPHK не є кепованими на 5'-кінці, і не є поліаденілованими на тому самому 3'-кінці. Основні функції багатьох вірусних білків були встановлені біохімічним шляхом і/або у контексті вірусної інфекції. Однак системи зворотної генетики суттєво збільшили обсяг наших знань відносно реплікації і патогенності "мінус-ниткових" вірусів із сегментованою і несегментованою PHK, а також щодо розробки живих атенуйованих вірус-вакцин. Зворотна генетика, відповідно до значення, у якому цей термін застосовується у молекулярній вірусолога, визначається як одержання вірусу, геном якого складається з клонованих кДHK (дивись оглядову статтю Ньюманн (Neumann) та інших, 2002). Для ініціювання реплікації вірусів із негативним геномом, вPHK або кPHK повинні коекспресуватись із полімеразним комплексом і нуклеопротеїном. Вірус сказу був першим вірусом із несегментованою "мінус-нитковою" PHK, який повністю одержали з клонованої кДHK; Шнелл (Schnell) та інші (1994) одержали рекомбінантний вірус сказу шляхом котрансфекції генноінженерної конструкції на основі кДHK, що кодувала непроцесовану кPHK, і генно-інженерних конструкцій для експресії білків L, Ρ і N під контролем промотора PHK-полімерази Т7. Наслідком інфекції рекомбінантним вірусом коров'ячої віспи, що забезпечував PHK-полімеразу Т7, було одержання інфекційного вірусу сказу. У цій Т7 полімеразній 7 92132 8 системі, наслідком первинної транскрипції непрокислоти. За одним із варіантів здійснення цього цесованої кPHK під контролем PHK-полімерази Т7 винаходу, виділена та/або очищена молекула нукбуло одержання некепованого транскрипту кPHK. леїнової кислоти кодує НА, ΝΑ, ΡΒ1, РВ2, ΡΑ, ΝΡ, Однак, три нуклеотиди гуанідину, які являють соΜ або NS чи їх частину, що має по суті таку саму бою оптимальну стартову послідовність для PHKактивність, що і відповідний поліпептид, який кодуполімeрази Т7, були приєднані до 5'-кінця. Для ється однією з Послідовностей № 1-8. Словоспоодержання автентичного 3'-кінця транскрипту лучення "що має по суті таку саму активність", яке кPHK, який є незамінним для продуктивного інфезастосовують у цьому описі, означає активність, ктивного циклу, для точного автокаталітичного що дорівнює приблизно 0,1%, 1%, 10%, 30%, 50%, розщеплення на 3'-кінці транскрипту кPHK була 90%, наприклад, до 100% або більше, або рівень застосована послідовність дельта-рибозиму вірусу білка, що піддається визначенню, що дорівнює гепатиту (HDVRz). приблизно 80%, 90% або більше, активності або З моменту появи першого повідомлення рівня білка, відповідно, відповідного непроцесоваШнель (Schnell) та інших (1994), системи зворотної ного поліпептида. За одним із варіантів здійснення генетики (із застосуванням подібних методик) зацього винаходу, виділена та/або очищена молекубезпечили можливість одержання багатьох "мінусла нуклеїнової кислоти кодує поліпептид, що є по ниткових" вірусів із несегментованою PHK (Концесуті таким самим, наприклад, має щонайменше льманн (Conzelmann), 1996; Концельманн 80%, наприклад, 90%, 92%, 95%, 97% або 99% (Conzelmann), 1998; Концельманн (Conzelmann) та ідентичність послідовностей суміжних амінокислот, інші, 1996; Марріотт (Marriott) та інші, 1999; Маноз що і поліпептид, який кодується однією з Послідо(Munoz) та інші, 2000; Нагаі (Nagai), 1999; Ньювностей № 1-8. За одним із варіантів здійснення манн (Neumann) та інші, 2002; Роберте (Roberts) цього винаходу, виділена та/або очищена молекута інші, 1998; Роуз (Rose), 1996). Удосконалення ла нуклеїнової кислоти включає нуклеотидну посвихідної методики збереження включали експрелідовність, що є по суті такою самою, наприклад, сію PHK-полімерази Т7 зі стабільно трансфіковамає щонайменше 50%, наприклад, 60%, 70%, 80% них клітинних ліній (Радек (Radecke) та інші, 1996) або 90% чи більшу ідентичність послідовностей або з плазмід для експресії білка (Лоусон суміжних амінокислот, що і одна з Послідовностей (Lawson), 1995), або методики теплового шоку для№ 1-8 або її комплемент, та, за одним із варіантів підвищення ефективності збереження (Парке здійснення, також кодує поліпептид, що має що(Parks) та інші, 1999). На основі Т7 полімеразної найменше 80%, наприклад, 90%, 92%, 95%, 97% системи, Бріджен (Bridgen) та Елліотт (Elliott) або 99% ідентичність послідовності суміжних амі(1996) створили вірус Буньямвера (сімейство нокислот із поліпептидом, що кодується однією з Bunyaviridae) з клонованих кДHK і продемонструПослідовностей № 1-8. За одним із варіантів здійвали можливість штучного одержання "мінусснення цього винаходу, виділена та/або очищена ниткового" вірусу із сегментованою PHK за допомолекула нуклеїнової кислоти кодує поліпептид з могою Т7 полімеразної системи. однією або декількома, наприклад, 2, 5, 10, 15, 20 У 1999 році на основі клітинної PHKабо більше, консервативними амінокислотними полімерази І була розроблена плазмідна зворотзамшами, наприклад, консервативними замінами ногенетична методика для одержання сегментодо 10% або 20% залишків, порівняно з поліпептиваного вірусу грипу А повністю з клонованих кДHK дом, що кодується однією з Послідовностей № 1-8. (Фодор (Fodor) та інші, 1999; Ньюманн (Neumann), Словосполучення "консервативні амінокислотні Каваока (Kawaoka), 1999). Ядерцевий фермент заміни" означає взаємозамінність залишків, що PHK-полімераза І синтезує рибосомну PHK, яка, мають однакові бічні ланцюги. Наприклад, групою подібно PHK вірусу грипу, не має кеп-структури на амінокислот, що мають аліфатичні бічні ланцюги, є 5'-кінді і полі(А) структури на 3'-кінці. PHKгліцин, аланін, валін, лейцин і ізолейцин; групою полімераза І забезпечує транскрипцію генноамінокислот, що мають аліфатично-гідроксильні інженерної конструкції, що містить кДHK вірусу бічні ланцюги, є серин і треонін; групою амінокисгрипу, фланковану послідовностями промотору лот, що мають амідовмісні бічні ланцюги, є аспаPHK-полімерази І і термінатору, наслідком чого є рагін і глутамін; групою амінокислот, що мають синтез вPHK вірусу грипу (Фодор (Fodor) та інші, ароматичні бічні ланцюги, є фенілаланін, тирозин і 1999; Ньюманн (Neumann), Каваока (Kawaoka), триптофан; групою амінокислот, що мають основні 1999; Ньюманн (Neumann), Каваока (Kawaoka), бічні ланцюги, є лізин, аргінін і гістидин; і групою 2001; Пекош (Pekosz) та інші, 1999). Система мала амінокислот, що мають сірковмісний бічний ланвисоку ефективність і продукувала більше за 108 цюг, є цистеїн і метіонін. Консервативними аміноінфекційних вірусних частинок на мл супернатанта кислотними замінними групами, яким віддають клітин, трансфікованих плазмідами, через 48 год перевагу, є валін-лейцин-ізолейцин; фенілаланінпісля трансфекції. тирозин; лізин-аргінін; аланін-валін; глутамінова Необхідним є спосіб одержання високоактивкислота-аспарагінова кислота і аспарагін-глутамін. них ортоміксовірусів, наприклад, вірусу грипу А, За іншим варіантом здійснення, виділена цілком із клонованих кДHK. та/або очищена молекула нуклеїнової кислоти за Цей винахід пропонує виділену та/або очищецим винаходом або її комплемент гібридизується з ну молекулу нуклеїнової кислоти (полінуклеотид), однією з Послідовностей № 1-8 або її комплеменщо кодує щонайменше один із білків високоактивтом за умов зниженої або помірної жорсткості чи ного (наприклад, із титрами, більшими за 109/мл, за суворих умов. Застосовуватися можуть, напринаприклад, більшими за 1010/мл) вірусу грипу або клад, такі умови: 7% додецилсульфату натрію його частину чи комплемент молекули нуклеїнової (SDS), 0,5 Μ NaΡΟ4, 1 мМ EDTA (етилендіамінтет 9 92132 10 раоцтова кислота) при температурі 50°С із промиідентичністю амінокислот із поліпептидом, що кованням у 2Х SSC (стандартний цитратний фізіолодується однією з Послідовностей № 1-8. За факугічний розчин), 0,1% SDS при температурі 50°С льтативним варіантом, два вектори можуть засто(знижена жорсткість), більш бажано у 7% додецисовуватись замість вектора, що містить промотор, лсульфату натрію (SDS), 0,5 Μ NaPO4, 1 мМ EDTA функціонально зв'язаний з кДHK Μ вірусу грипу, при температурі 50°С із промиванням у 1Х SSC, зв'язаною з термінатором, наприклад, вектор, що 0,1% SDS при температурі 50°С (помірна жорстмістить промотор, функціонально зв'язаний з кДHK кість), ще більш бажано у 7% додецилсульфату M1 вірусу грипу, зв'язаною з термінатором, і векнатрію (SDS), 0,5 Μ NaPO4, 1 мМ EDTA при темтор, що містить промотор, функціонально зв'язапературі 50°С з промиванням у 0,5Х SSC, 0,1% ний з кДHK М2 вірусу грипу, зв'язаною з термінаSDS при температурі 50°С (жорсткі умови), за ватором. ріантом, якому віддають перевагу, у 7% додецилЦей винахід пропонує виділені і очищені вексульфату натрію (SDS), 0,5 Μ NaPO4, 1 мМ EDTA тори або плазміди, що експресують або кодують при температурі 50°С із промиванням у 0,1Х SSC, білки вірусу грипу, або експресують чи кодують 0,1% SDS при температурі 50°С (більш жорсткі вPHK вірусу грипу, як нативну, так і рекомбінантну умови), за варіантом, якому віддають більшу певPHK. За варіантом, якому віддають перевагу, ревагу, у 7% додецилсульфату натрію (SDS), 0,5 вектори містять кДHK вірусу грипу, наприклад, Μ NaPO4, 1 мМ EDTA при температурі 50°С із вірусу грипу А (наприклад, будь-який ген вірусу промиванням у 0,1Х SSC, 0,1% SDS при темперагрипу А, що включає будь-який з 15 підтипів НА турі 65°С (дуже жорсткі умови). За одним із варіанабо 9 підтипів NA), В або ДHK С (дивись Розділ 45 тів здійснення, молекула нуклеїнової кислоти за і Розділ 46 книги Virology (під редакцією Філдс цим винаходом кодує поліпептид, що є по суті та(Fields) та інших), видавництво Lippincott-Raven ким самим, наприклад, має щонайменше 50%, Publ., Філадельфія, штат Пенсільванія (1996), яку наприклад, 60%, 70%, 80%, 90% або більшу іденконкретно включено до цього опису шляхом поситичність послідовностей суміжних амінокислот, що лання), хоча передбачається, що у векторах або і одна з Послідовностей № 1-8 і, за варіантом, способах за цим винаходом може(-уть) застосовуякому віддають перевагу, має по суті таку саму ватись ген(-и) будь-якого мікроорганізму. кДHK активність, що і відповідний непроцесований поліможе мати смислову або антисмислову орієнтацію пептид, який кодується однією з Послідовностей відносно промотора. Таким чином, вектор за цим № 1-8. винаходом може кодувати білок вірусу грипу (смиМолекула нуклеїнової кислоти за цим винахослова орієнтація) або вPHK (антисмислова орієндом може застосовуватись для експресії білків тація). Будь-який прийнятний промотор або термівірусу грипу, для одержання химерних генів, нанатор може застосовуватись для експресії білка приклад, із генами інших вірусів, у тому числі з або пептиду, наприклад, вірусного білка або пепгенами інших вірусів грипу, та/або для одержання тиду, білка або пептиду невірусного патогенного рекомбінантного вірусу. Таким чином, цей винахід мікроорганізму або терапевтичного білка чи пеппропонує також виділені поліпептиди, рекомбінантиду. тний вірус і клітини-хазяї, що контактують із молеЦей винахід пропонує композицію, що містить кулами нуклеїнової кислоти або рекомбінантним множину векторів вірусу грипу за цим винаходом. вірусом за цим винаходом. За одним із варіантів здійснення цього винаходу, Цей винахід пропонує також щонайменше композиція містить: а) щонайменше два вектори, один з наведених нижче виділених та/або очищевибрані з групи, що включає вектор, що містить них векторів: вектор, що включає промотор, функпромотор, функціонально зв'язаний з кДHK РА ціонально зв'язаний з кДHK РА вірусу грипу, зв'явірусу грипу, зв'язаною з термінатором, вектор, що заною з термінатором, вектор, що включає містить промотор, функціонально зв'язаний з кДHK промотор, функціонально зв'язаний з кДHK РВ1 РВ1 вірусу грипу, зв'язаною з термінатором, веквірусу грипу, зв'язаною з термінатором, вектор, що тор, що містить промотор, функціонально зв'язавключає промотор, функціонально зв'язаний з ний з кДHK РВ2 вірусу грипу, зв'язаною з термінакДHK РВ2 вірусу грипу, зв'язаною з термінатором, тором, вектор, що містить промотор, вектор, що включає промотор, функціонально функціонально зв'язаний з кДHK НА вірусу грипу, зв'язаний з кДHK НА вірусу грипу, зв'язаною з терзв'язаною з термінатором, вектор, що містить промінатором, вектор, що включає промотор, функцімотор, функціонально зв'язаний з кДHK NP вірусу онально зв'язаний з кДHK NP вірусу грипу, зв'язагрипу, зв'язаною з термінатором, вектор, що місною з термінатором, вектор, що включає тить промотор, функціонально зв'язаний з кДHK промотор, функціонально зв'язаний з кДHK NA NA вірусу грипу, зв'язаною з термінатором, вектор, вірусу грипу, зв'язаною з термінатором, вектор, що що містить промотор, функціонально зв'язаний з включає промотор, функціонально зв'язаний з кДHK Μ вірусу грипу, зв'язаною з термінатором і кДHK Μ вірусу грипу, зв'язаною з термінатором, вектор, що містить промотор, функціонально зв'явектор, що включає промотор, функціонально заний з кДHK NS вірусу грипу, зв'язаною з термізв'язаний з кДHK NS вірусу грипу, зв'язаною з тернатором, де щонайменше один вектор містить мінатором, де щонайменше один вектор включає промотор, функціонально зв'язаний з молекулою послідовності, що кодують НА, ΝΑ, РВ1, РВ2, ΡΑ, нуклеїнової кислоти за цим винаходом, зв'язаною ΝΡ, М, NS або їх частину, що мають по суті таку з термінатором; і b) щонайменше два вектори, саму активність, що і поліпептид, який кодується вибрані з групи, що включає вектор, який кодує РА однією з Послідовностей № 1-8, наприклад, послівірусу грипу, вектор, який кодує РВ1 вірусу грипу, довність, що кодує поліпептид із щонайменше 80% вектор, який кодує РВ2 вірусу грипу і вектор, який 11 92132 12 кодує NP вірусу грипу. За факультативним варіанвPHK може бути промотор PHK-полімерази І, протом, вектори b) включають один або декілька векмотор PHK-полімерази II, промотор PHKторів, що кодують NP, NS, М, наприклад, М1 і М2, полімерази III, промотор Т7, промотор Т3, а вектор НА і NA. За варіантом, якому віддають перевагу, факультативно містить термінатор, наприклад, вектори, які кодують вірусні білки, додатково містермінатор PHK-полімерази І, термінатор PHKтять термінатор. полімерази II, термінатор PHK-полімерази III або За іншим варіантом здійснення, композиція мірибозим. За одним із варіантів здійснення, вектор, стить: а) щонайменше два вектори, вибрані з грущо містить бажану нуклеїновокислотну послідовпи, що включає вектор, що містить промотор, фунність, містить кДHK, що становить інтерес. кДHK, кціонально зв'язаний з кДHK РА вірусу грипу, що становить інтерес, чи то у векторі для продукузв'язаною з термінатором, вектор, що містить провання вPHK, чи то у векторі для продукування білмотор, функціонально зв'язаний з кДHK РВ1 вірусу ка, може кодувати антигенну детермінанту з імуногрипу, зв'язаною з термінатором, вектор, що місгенним потенціалом, наприклад, антигенну тить промотор, функціонально зв'язаний з кДHK детермінанту, придатну для лікування раку або РВ2 вірусу грипу, зв'язаною з термінатором, векзастосування у ролі вакцини, або пептид чи політор, що містить промотор, функціонально зв'язапептид, придатний для генотерапії. При одержанні ний з кДHK НА вірусу грипу, зв'язаною з термінавірусу, вектором або плазмідою, що містить ген тором, вектор, що містить промотор, або кДHK, що становить інтерес, може бути заміфункціонально зв'язаний з кДHK NP вірусу грипу, нений вектор або плазміда для гена вірусу грипу зв'язаною з термінатором, вектор, що містить проабо вони можуть додаватись до векторів або пламотор, функціонально зв'язаний з кДHK NA і NB змід для усіх генів вірусу грипу. вірусу грипу, зв'язаною з термінатором, вектор, що Численні вектори за цим винаходом можуть містить промотор, функціонально зв'язаний з кДHK бути фізично зв'язані з або кожен вектор може Μ вірусу грипу, зв'язаною з термінатором, вектор, бути представленим на окремій плазміді або інщо містить промотор, функціонально зв'язаний з шому носії, наприклад, лінійній нуклеїновій кислоті. кДHK NS вірусу грипу, зв'язаною з термінатором і Промотор або термінатор у векторі експресії вектор, що містить промотор, функціонально зв'явPHK або вірусного білка може бути однаковим заний з кДHK ВМ2 вірусу грипу, функціонально або різним, порівняно з промотором або будь-яким зв'язаною з термінатором, де щонайменше один іншим вектором. За варіантом, якому віддають вектор містить промотор, функціонально зв'язаний перевагу, вектор або плазміда, що експресує з молекулою нуклеїнової кислоти за цим винаховPHK вірусу грипу, містить промотор, придатний дом, зв'язаною з термінатором; і b) щонайменше для експресії у щонайменше одній конкретній клідва вектори, вибрані з групи, що включає вектор, тині-хазяїні, наприклад, клітинах-хазяях птахів або який кодує РА вірусу грипу, вектор, який кодує РВ1 ссавця, наприклад, клітинах собаки, кішки, коня, вірусу грипу, вектор, який кодує РВ2 вірусу грипу і великої рогатої худоби, вівці або примата, у тому вектор, який кодує ΝΡ вірусу грипу. За факультачислі клітинах людини або, за варіантом, якому тивним варіантом, вектори b) включають один або віддають перевагу, для експресії у більше ніж оддекілька векторів, що кодують NP, NS, М, НА або ному хазяїні. ΝΑ. За варіантом, якому віддають перевагу, вектоЗа одним із варіантів здійснення, один або дери, які кодують вірусні білки, додатково містять кілька векторів для продукування вPHK містять термінатор. промотор, у тому числі, але без обмеження, проКомпозиція за цим винаходом може також мотор PHK-полімерази І, наприклад промотор включати ген або відкриту рамку зчитування, яка людської PHK-полімерази І, промотор PHKстановить інтерес, наприклад, чужорідний ген, що полімерази II, промотор PHK-полімерази III, прокодує імуногенний пептид або білок, придатний як мотор Т7 або промотор Т3. Термінатори для веквакцина. Таким чином, іншим варіантом здійсненторів вPHK, яким віддають перевагу, включають, ня цього винаходу є композиція за цим винаходом, але без обмеження, термінатор PHK-полімерази І, як описано вище, в якій один із векторів замінюють термінатор PHK-полімерази II, термінатор PHKабо композиція додатково включає вектор, що полімерази III або рибозим. Рибозими, у межах містить промотор, зв'язаний з 5'-кінцевими посліобсягу винаходу, включають, але без обмеження, довностями вірусу грипу (у тому числі факультатирибозими тетрагімен, PHKазу Р, рибозими акуливно з 5'-кінцевими кодувальними послідовностями молота, рибозими "шпильки", рибозими вірусу гевірусу грипу або їх частиною), зв'язаними з бажапатиту, а також синтетичні рибозими. ною нуклеїновокислотною послідовністю, наприЗа одним із варіантів здійснення, щонайменше клад, бажаною кДHK, зв'язаною з 3'-кінцевими поодин вектор вPHK містить промотор PHKслідовностями вірусу грипу (у тому числі, за полімерази II, зв'язаний з послідовністю рибозиму, факультативним варіантом, з 3'-кінцевими кодувазв'язаною з вірусними кодувальними послідовносльними послідовностями вірусу грипу або їх частями, зв'язаними з іншими послідовностями риботиною), зв'язаними з термінатором. За варіантом, зиму, факультативно зв'язаними з термінатором якому віддають перевагу, бажана нуклеїновокисPHK-полімерази II. За одним із варіантів здійсненлотна послідовність, наприклад, кДHK, має антисня, щонайменше 2, а за варіантом, якому віддають мислову орієнтацію. Наслідком введення такої перевагу, декілька, наприклад, 3, 4, 5, 6, 7 або 8, композиції до клітини-хазяїна, пермісивної для векторів для продукування вPHK, містять промореплікації вірусу, є рекомбінантний вірус, що містор PHK-полімерази II, послідовність першого ритить вPHK, що відповідає послідовностям вектора. бозиму, яка спрямована 5'-кінцем до послідовносПромотором у такому векторі для продукування ті, що відповідає вірусним послідовностям, у тому 13 92132 14 числі вірусним кодувальним послідовностям, яка ня ссавцю кількості виділеного вірусу за цим винаспрямована 5'-кінцем до послідовності другого ходом, ефективної для збільшення або підвищенрибозиму, яка спрямована 5'-кінцем до термінатоня кількості ендогенного білка у ссавця. За варіанра. Кожен промотор PHK-полімерази у кожному том, якому віддають перевагу, згаданим ссавцем є векторі вPHK може бути таким самим або відрізнялюдина. тись від промотора PHK-полімерази II у будьФіг. 1. Принципова схема розроблених зворотякому іншому векторі вPHK. Подібним чином, кожногенетичних систем. За способом трансфекції на послідовність рибозиму у кожному векторі вPHK рибонуклеопротеїнами (А), очищений NP і полімеможе бути такою самою або відрізнятись від посразні білки складаються в рибонуклеопротеїни лідовностей рибозиму у будь-якому іншому векторі (РНП) за допомогою синтезованої in vitro вPHK. вPHK. За одним із варіантів здійснення, послідовКлітини трансфікують рибонуклеопротеїнами з ності рибозиму у одному векторі не є однаковими. подальшим інфікуванням вірусом-помічником. За Цей винахід пропонує також спосіб одержання способом PHK-полімерази І (В), клітини трансфівірусу грипу. Спосіб включає контактування клітикують плазмідою, що містить промотор PHKни з деякою кількістю векторів за цим винаходом, полімерази І, кДHK, що кодує призначену для збенаприклад, послідовно або одночасно, наприклад, реження вPHK, і термінатор PHK-полімерази І. із застосуванням композиції за цим винаходом, у Внутрішньоклітинна транскрипція за допомогою кількості, ефективній для одержання інфекційного PHK-полімерази І забезпечує одержання вPHK, вірусу грипу. Винахід включає також виділення яка пакується до потомства вірусних частинок при вірусу з клітини, що контактувала зі згаданою комінфікуванні вірусом-помічником. За допомогою позицією. Таким чином, винахід додатково пропообох способів, віруси-трансфектанти (тобто віруси, нує виділений вірус, а також клітину-хазяїна, що що містять PHK, одержану з клонованої кДHK) контактувала з композицією або вірусом за цим відбирають із популяції віруса-помічника. винаходом. За іншим варіантом здійснення, винаФіг. 2. Принципова схема продукування геннохід включає контактування клітини з одним або інженерних конструкцій на основі PHK-полімерази декількома векторами (векторами для продукуІ. кДHK, одержані від вірусу грипу, ампліфікували вання вPHK або білка) перед іншими векторами шляхом полімеразної ланцюгової реакції, розще(векторами для продукування вPHK або білка). пили BsmBl і клонували до сайтів BsmBl вектора Спосіб за цим винаходом надає можливість рНН21 (Е. Гоффман (Е. Hoffmann), дисертація на легкого маніпулювання з вірусами грипу, наприздобуття наукового ступеня кандидата наук, клад, шляхом введення атенуювальних мутацій до Justus, Liebig-University, Giessen, Германія), що вірусного геному. Окрім того, оскільки віруси грипу містить промотор (Р) людської PHK-полімерази І і індукують сильний гуморальний і клітинний імунітермінатор (Т) мишачої PHK-полімерази І. Нуклеотет, цей винахід значно посилює ці віруси як вактид тимідину у 3'-5' напрямку відносно термінатора цинні вектори, зокрема, з точки зору доступності (*Т) представляє 3'-кінець PHK вірусу грипу. Посприродних варіантів вірусу, які можуть застосовулідовності вірусу грипу А показані жирними літеватись послідовно, із забезпеченням можливості рами (Послідовності № 29-40). повторного застосування для генотерапії. Фіг. 3. Запропонований зворотногенетичний Способи продукування вірусу, опис яких навоспосіб продукування "мінус-ниткових" вірусів із диться, що не потребують інфікування вірусомсегментованою PHK. Плазміди, що містять промопомічником, є придатними для проведення дослітор PHK-полімерази І, кДHK для кожного з восьми джень у галузі вірусного мутагенезу та для продусегментів вірусної PHK І і термінатор PHKкування вакцин (наприклад, проти СНІДу, грипу, полімерази І, трансфікують до клітин разом із плагепатиту В, гепатиту С, ріновірусу, філовірусу, мазмідами, що експресують білок. Незважаючи на те, лярії, герпесу і ящуру) і генотерапевтичних вектощо інфекційні віруси можуть продукуватись із пларів (наприклад, проти раку, СНІДу, дефіциту адезмідами, що експресують РА, РВ1, РВ2 і NP, екснозиндеамінази, м'язової дистрофії, дефіциту пресія всіх інших структурних білків (які показані у орнітинтранскарбамілази і пухлин центральної дужках) підвищує ефективність продукування вірунервової системи). Таким чином, пропонується сів у залежності від продукованого вірусу. вірус для застосування у медицині (наприклад, Фіг. 4. Титр різних вірусів грипу. для вакцини або генотерапії). Визначення Цей винахід пропонує також спосіб імунізації Терміни "виділений та/або очищений", що заіндивіда проти патогенного мікроорганізму, напристосовують у цьому описі, означають in vitro одерклад, бактерії, вірусу, паразиту або злоякісної пухжання, виділення та/або очищення вектора, плазлини. Спосіб включає введення індивіду кількості міди або вірусу за цим винаходом таким чином, щонайменше одного виділеного вірусу за цим вищоб вони не були пов'язані з in vivo речовинами находом, факультативно у комбінації з ад'юванабо були по суті очищеними від in vivo речовин. том, ефективної для імунізації індивіда. Вірус місВиділений вірусний препарат одержують, як пратить вPHK, що включає поліпептид, який кодується вило, шляхом in vitro культивування і розмноження патогенним мікроорганізмом або пухлиноспецифіі він є по суті вільним від інших інфекційних агенчний поліпептид. тів. Пропонується також спосіб підвищення або Словосполучення "по суті вільний", що застопосилення експресії ендогенного білка у ссавця, совують у цьому описі, нижче означає рівень вищо має симптоми або захворювання, яке характеявлення конкретного інфекційного агента за допоризується зниженою кількістю або відсутністю енмогою стандартних способів виявлення цього догенного білка. Згаданий спосіб включає введенагента. 15 92132 16 "Рекомбінантним" є вірус, підданий обробці in наприклад, не має білка М2 з активністю іонного vitro, наприклад, із застосуванням методів рекомканалу. Подібним чином, вірус грипу С не має білбінантних ДHK, для внесення змін до вірусного ка М2 з активністю іонного каналу. Ймовірно, одгеному. нак, що білок СМ1 має таку активність. Активність Термін "рекомбінантна нуклеїнова кислота" білка, як іонного каналу, може визначатись за доабо "послідовність або сегмент рекомбінантної помогою добре відомих у цій галузі техніки спосоДHK", вживаний у цьому описі, означає нуклеїнову бів, дивись, наприклад, Холсінгер (Holsinger) та кислоту, наприклад, ДHK, яку одержали або видіінші (1994) і WO 01/79273. лили з джерела, і яка у подальшому може бути Клітинні лінії і віруси грипу, що можуть застохімічно змінена in vitro таким чином, що її послідосовуватись у цьому винаході За цим винаходом вність не зустрічається за природних умов або не може застосовуватись будь-яка клітина, що підтвідповідає послідовностям, що зустрічаються за римує ефективну реплікацію вірусу грипу, у тому природних умов, що знаходяться не у тому полочислі, мутантні клітини, що експресують зменшені женні, у якому вони знаходились би у нативному або знижені рівні однієї або декількох сіалових геномі. Прикладом ДHK, "одержаної" з джерела, кислот, що є рецепторами вірусу грипу. Віруси, може бути послідовність ДHK, яка ідентифікується одержані за цими способами, можуть перетворюяк корисний фрагмент і яка у подальшому синтеватись на реасортантні віруси. зується хімічним шляхом у по суті чистій формі. За варіантом, якому віддають перевагу, згадаПрикладом такої ДHK, "виділеної" з джерела, може ними клітинами є стабільні клітинні лінії, які прохобути корисна послідовність ДHK; яку вирізають або дять сертифікацію або сертифіковані Всесвітньою видаляють зі згаданого джерела хімічними засоорганізацією охорони здоров'я (ВООЗ). Вимоги до бами, наприклад, за допомогою рестриктаз, завдясертифікації таких клітинних ліній включають вики чому вона може піддаватись додатковим манізначення характеристик принаймні за одним із пуляціям за генно-інженерними методиками, таких пунктів: генеалогія, ростові характеристики, наприклад, ампліфікуватись, для застосування за імунологічні маркери, сприйнятливість до вірусу, цим винаходом. онкогенність, умови зберігання, а також перевірку Реплікація вірусу грипу на тваринах, яйцях і культурах клітин. Ці характеГеном вірусів грипу А складається з восьми ристики застосовують на підтвердження того, що однонитчастих "мінус -ниткових" вірусних PHK клітини не мають додаткових агентів, що підда(вPHK), які, загалом, кодують десять білків. Житються визначенню. У деяких країнах може також тєвий цикл вірусу грипу розпочинається зі зв'язувиникнути необхідність надання каріологічних давання гемаглютиніну (НА) з рецепторами, що місних. Окрім того, за варіантом, якому віддають петять сіалову кислоту і знаходяться на поверхні ревагу, онкогенність може перевірятись на клітиклітини-хазяїна, з подальшим опосередкованим нах, що знаходяться на тому самому рівні рецептором ендоцитозом. Низький рН в пізніх енпасажування, що і клітини, застосовані для продудосомах ініціює конформаційний зсув НА, завдяки кування вакцини. Вірус, за варіантом, якому відчому стає доступним N-кінець субодиниці НА2 (так дають перевагу, перед інактивацією або атенуюзваного гібридного пептиду). Гібридний пептид ванням для продукування вакцини очищають ініціює злиття вірусної і ендосомної мембран, і до способом, який, як було показано, забезпечує цитоплазми виділяються комплекси матричного одержання стабільних результатів (дивись, наприбілка (М1) і рибонуклеопротеїнів. Рибонуклеопроклад, World Health Orgamzation (Всесвітня органітеїни складаються з нуклеопротеїну (NP), який зація охорони здоров'я), 1982). капсидує вPHK, і комплексу вірусних полімераз, до За варіантом, якому віддають перевагу, кліскладу якого входять білки PA, PB1 і РВ2. Рибонутинні лінії, призначені для застосування, піддають клеопротеїни транспортуються до ядра, де відбуповному визначенню характеристик із можливим вається транскрипція і реплікація. Комплекс PHKвключенням відповідних тестів на чистоту готового полімераз каталізує три різні реакції: синтез мPHK продукту. Дані, що можуть застосовуватись для з 5'-кепом і 3' полі(А) структурою, непроцесованої визначення характеристик клітини, призначеної комплементарної PHK (кPHK) і геномної вPHK із для застосування у цьому винаході, включають: (а) застосуванням кДHK як матриці. Після цього новоінформацію щодо її походження, одержання і пасинтезовані вPHK, NP і полімеразні білки складасажування; (b) інформацію щодо її ростових і ються у рибонуклеопротеїни, виводяться з ядра і морфологічних характеристик; (с) результати петранспортуються до плазматичної мембрани, де ревірок на присутність додаткових агентів; (d) хавідбувається активна реплікація потомства вірусрактерні особливості, наприклад, біохімічний, імуних частинок. Білок нейрамінідаза (NA) відіграє нологічний і цитогенетичний профілі, які вирішальну роль на пізній стадії інфекції шляхом уможливлюють її чітке розпізнавання серед інших видалення сіалової кислоти із сіалілолігосахариклітинних ліній; і (e) результати тестів на онкогендів, вивільненням завдяки цьому новоскладених ність. За варіантом, якому віддають перевагу, рівіріонів із поверхні клітин і запобіганням аутоагревень пасажування або подвоєння популяції застогації вірусних частинок. Незважаючи на те, що сованої клітини-хазяїна повинен бути максимально складання вірусу включає білок-білкові і білокнизьким. вPHK взаємодії, природа цих взаємодій є по суті За варіантом, якому віддають перевагу, вірус, невідомою. продукований у клітині, перед введенням його до Хоча віруси грипу В і грипу С є подібними до складу вакцини або застосуванням у генотерапії, вірусу грипу А у структурному і функціональному повинен мати високий ступінь чистоти. Взагалі, відношеннях, існують деякі різниці. Вірус грипу В, способи очищення забезпечать екстенсивне вида 17 92132 18 лення клітинної ДHK, інших клітинних компонентів і тивованих вакцин, що можуть застосовуватись за додаткових агентів. Можуть застосовуватись також цим винаходом, можуть бути включені суцільноспособи, що викликають екстенсивний розклад віріонні (WV) вакцини або субвіріонні (SV) розщепабо денатурацію ДHK. Дивись, наприклад, Мізрахі лені (спліт) вакцини. WV вакцина містить інтактний (Mizrahi), 1990. інактивований вірус, у той час як SV вакцина місВакцини тить очищений вірус, зруйнований детергентами, Вакцина за цим винаходом може включати які солюбілізують ліпідовмісну вірусну оболонку, з імуногенні білки, у тому числі глікопротеїни будьподальшою хімічною інактивацією залишкового якого патогенного мікроорганізму, наприклад, імувірусу. ногенний білок однієї або декількох бактерій, віруНа додаток до цього, до вакцин, що можуть сів, дріжджів або грибів. Так, за одним із варіантів застосовуватись, належать ті, що містять виділені здійснення, віруси грипу за цим винаходом можуть поверхневі білки НА і NA. Ці вакцини називають бути вакцинними векторами для вірусу грипу або поверхневоантигенними або субодиничними вакінших вірусних патогенних мікроорганізмів, у тому цинами. Взагалі, реакції на SV і поверхневоантичислі, але без обмеження, лентівірусів, наприклад, генні (тобто, з очищеними НА і NA) вакцини є одВІЛ, вірусу гепатиту В, вірусу гепатиту С, вірусів наковими. Експериментальна інактивована WV герпесу, наприклад, вірусу цитомегалії або вірусу вакцина, що містить антиген NA, імунологічно спогерпесу чи вірусу ящуру. ріднений з епідемічним вірусом, і неспоріднений Корпускулярну (віріонну) вакцину концентруНА, видається менш ефективною, аніж традиційні ють шляхом ультрафільтрації, після чого піддають вакцини (Огра (Ogra), 1977). Перевагу віддають очищенню шляхом зонного центрифугування або інактивованим вакцинам, що містять обидва відхроматографування. Перед або після очищення повідні поверхневі антигени. вакцину інактивують за допомогою, наприклад, Живі атенуйовані вірус-вакцини. Вірус-вакцини формаліну або бета-пропіолактону. на основі живого атенуйованого вірусу грипу моСубодинична вакцина містить очищені глікопжуть також застосовуватись для запобігання або ротеїни. Така вакцина може бути одержана навелікування грипозної інфекції, за стадіями відомого деним нижче чином: з вірусних суспензій, фрагмеспособу. Атенуювання, за варіантом, якому віддантованих шляхом обробки детергентом, ють перевагу, здійснюють одностадійним спосоочищають, наприклад, ультрацентрифугуванням, бом шляхом перенесення атенуйованих генів від поверхневі антигени. Таким чином, субодиничні атенуйованого віруса-донора до реплікованого вакцини містять, головним чином, білок НА, а таізоляту або реасортантного вірусу за відомими кож NA. Застосованим детергентом може бути, способами (дивись, наприклад, Мерфі (Murphy), наприклад, катіонний детергент, наприклад, гекса1993). Оскільки резистентність до вірусу грипу А депилтриметиламонійбромід (Бахмейєр опосередковується розвитком імунної реакції на (Bachmeyer), 1975), аніонний детергент, наприглікопротеїни НА і NA, гени, що кодують ці поверхклад, амонію дезоксихолат (Лавер (Laver), Уебстер неві антигени, повинні прийти з реасортантних (Webster), 1976) або неіонний детергент, напривірусів або високопродуктивних клінічних ізолятів. клад, детергент, що продається під назвою тритон Атенуйовані гени одержують від антенуйованого Х100 (TRITON X100) Гемаглютинін також може родоначальника. За цим варіантом підходу, гени, бути виділеним після обробки віріонів протеазою, що забезпечують атенуювання, за варіантом, яконаприклад, бромеліном, із подальшим очищенням му віддають перевагу, не кодують глікопротеїни за способом, описаним, наприклад, Гранд (Grand) і НА і NA. У іншому випадку, ці гени не могли б бути Скехел (Skehel) (1972). перенесеними до реасортантних вірусів, що неРозщеплена (спліт) вакцина містить віріони, суть поверхневі антигени клінічного вірусного ізоякі були піддані обробці агентами, що розчиняють ляту. ліпіди. Розщеплену вакцину можна одержати таБагато вірусів-донорів піддавали оцінці щодо ким чином: водну суспензію очищеного вірусу, їх здатності до відтворюваного атенуювання віруодержану, як описувалось вище, інактивовану або сів грипу. Як необмежувальний приклад, для проні, обробляють, із перемішуванням, розчинниками дукування атенуйованої вакцини може застосовуліпідів, наприклад, етиловим ефіром або хлороватись адаптований до холоду (са) вірус-донор формом у поєднанні з детергентами. Наслідком A/AnnArbor(AA)/6/60 (H2N2) (дивись, наприклад, розчинення ліпідів вірусної оболонки є фрагменЕдвардс (Edwards), 1994; Мерфі (Murphy), 1993). тація вірусних частинок. Водну фазу, що містить На додаток до цього, вакцини на основі живого розщеплену вакцину, регенерують. атенуйованого реасортантного вірусу можна одеРозщеплена вакцина містить, головним чином, ржати шляхом парування адаптованого до холоду гемаглютинін і нейрамінідазу з видаленим вихід(са) віруса-донора з вірулентним реплікованим ним ліпідним середовищем, а також нуклеоїд або вірусом за цим винаходом. Після цього потомство продукти його розкладу. Після цього здійснюють реасортантного вірусу відбирають при температурі інактивацію залишкових інфекційних частинок, 25°С (рестриктивній для реплікації вірулентного якщо це не було зроблено раніше. вірусу) у присутності антисироватки H2N2, яка Інактивовані вакцини. Інактивовані протигрипригнічує реплікацію вірусів, що несуть поверхневі позні вакцини за цим винаходом одержують шляантигени атенуйованого, адаптованого до холоду хом інактивації реплікованого вірусу за цим винавіруса-донора A/AA/6/60(H2N2). ходом із застосуванням відомих способів, Великі групи реасортантних вірусів H1N1 і наприклад, але без обмеження, шляхом обробки H3N2 оцінювали на людях із встановленням їх задовільності: (а) інфекційні, (b) атенуйовані для формаліном або -пропіолактоном. До числа інак 19 92132 20 серонегативних дітей і імунологічно праймованих Фармацевтичні композиції за цим винаходом, дорослих, (с) імуногенні і (d) генетично стабільні. придатні для вакцинації або для парентерального Імуногенність адаптованих до холоду реасортантчи перорального введення, містять атенуйовані них вірусів відповідає рівню їх реплікації. Так, наабо інактивовані віруси грипу, які факультативно буття шести переносних генів адаптованого до додатково містять стерильні водні або неводні холоду віруса-донора новими вірусами дикого типу розчини, суспензії та емульсії. Згадані композиції забезпечило відтворювану атенуацію цих вірусів можуть додатково містити допоміжні речовини або для застосування при вакцинації сприйнятливих наповнювачі, відомі у цій галузі. Дивись, напридорослих і дітей. клад, Берков (Berkow) та інші, 1987; Averv's DruR Інші атенуювальні мутації можуть вводитись Treatment, 1987; Осол (Osol), 1980; Кацунг до генів вірусу грипу шляхом сайт-спрямованого (Katzung), 1992. Композиція за цим винаходом, як мутагенезу для збереження інфекційних вірусів, правило, представлена у формі індивідуальних що несуть ці мутантні гени. Атенуювальні мутації доз (одиничних доз). можуть вводитись як до некодувальних, так і до Традиційні вакцини, як правило, містять від кодувальних ділянок геному. Такі атенуювальні приблизно 0,1 мкг до 200 мкг, за варіантом, якому мутації можуть також вводитись до інших генів, віддають перевагу, від 10 мкг до 15 мкг гемаглюокрім генів НА і NA, наприклад, до гена полімерази тиніну від кожного зі штамів, що входять до їх РВ2 (Суббарао (Subbarao) та інші, 1993). Так, москладу. Вакцина, що є головною складовою вакжуть також продукуватись нові віруси-донори, що цинної композиції за цим винаходом, може містити несуть атенуювальні мутації, введенні сайтвірус типу А, типу В або типу С чи будь-яку їх комспрямованим мутагенезом, і такі нові вірусибінацію, наприклад, щонайменше двох із трьох донори можуть застосовуватись для зменшення типів, щонайменше двох різних підтипів, щонайкількості живих атенуйованих вакцинних реасорменше двох одного типу, щонайменше двох однотантних вірусів H1N1 і H3N2 способом, аналогічго підтипу або різних ізоляту(-ів) чи реасортантноним описаному вище для віруса-донора А/АА/6/60. го(-их) вірусу(-ів). Людський вірус грипу типу А Подібним чином, інші відомі і придатні атенуйовані включає підтипи H1N1, H2N2 і H3N2. штами-донори можуть реаранжуватись із вірусом Препарати для парентерального введення грипу за цим винаходом для одержання атенуйовключають стерильні водні або неводні розчини, ваних вакцин, придатних для застосування для суспензії та/або емульсії, які можуть містити допоімунізації ссавців (Енамі (Enami) та інші, 1990; Маміжні агенти або наповнювачі, відомі у цій галузі. стер (Muster) та інші, 1991; Суббарао (Subbarao) Прикладами неводних розчинників є пропіленгліта інші, 1993). коль, поліетиленгліколь, рослинні олії, наприклад, Перевагу віддають тому, щоб такі атенуйовані оливкова олія, та органічні складні ефіри для ін'єквіруси зберігали гени від вірусу, що кодує антигенцій, наприклад, етилолеат. Носії або оклюзивні ні детермінанти, по суті подібні генам вихідних пов'язки можуть застосовуватись для підвищення клінічних ізолятів. Таким чином, метою атенуйовашкірної проникності та підсилення абсорбції антиної вакцини є забезпечення по суті такої самої генів. Рідкі дозовані лікарські форми для перораантигенності, що і антигенність вихідного клінічнольного введення можуть, взагалі, включати розчин го ізоляту вірусу, з відсутністю, разом з цим, інфеліпосом у вигляді рідкої лікарської форми. Придатктивності до такого ступеня, що вакцина викликає ними формами для суспендування ліпосом є емумінімальну зміну індукування серйозного патогенльсії, суспензії, розчини, сиропи і еліксири, що місного стану у вакцинованого ссавця. тять інертні розріджувачі, що традиційно Вірус, таким чином, може бути атенуйованим застосовуються у цій галузі, наприклад, дистильоабо інактивованим, включеним до складу і введевану воду. Окрім інертних розріджувачів, такі комним, за відомими способами, у вигляді вакцини позиції можуть також включати ад'юванти, змочудля індукування імунної реакції у тварини, напривальні речовини, емульгатори і суспендувальні клад, ссавця. У цій галузі є добре відомі способи агенти або підсолоджуючі речовини, коригенти чи визначення, чи зберегли такі атенуйовані або інакречовина для надання запаху. Дивись, наприклад, тивовані вакцини ступінь антигенності, подібний Берков (Berkow) та інші, 1992; Ейвері (Avery), 1987; ступеню антигенності клінічного ізоляту або одерОсол (Osol), 1980; Кацунг (Katzung), 1992. жаного з нього високопродуктивного штаму. Такі У разі, коли композиція за цим винаходом завідомі способи включають застосування антисиростосовується для введення індивіду, вона може ваток або антитіл для виключення вірусів, що ексдодатково містити солі, буфери, ад'юванти або пресують антигенні детермінанти віруса-донора; інші речовини, що є бажаними для поліпшення хімічний добір (наприклад, амантадин або риманефективності композиції. Для вакцин можуть затидин); визначення активності і пригнічення НА і стосовуватись ад'юванти, тобто речовини, що моNA; скринінг ДHK (наприклад, гібридизація зонда жуть посилити специфічну імунну реакцію. За норабо полімеразна ланцюгова реакція) для підтвермальних умов, ад'ювант і композицію змішують дження відсутності у атенуйованих вірусів донорперед презентацією імунній системі або презентуських генів, що кодують антигенні детермінанти ють окремо, однак на тій самій ділянці організму, (наприклад, генів НА і NA). Дивись, наприклад, який піддається імунізації. Приклади матеріалів, Робертсон (Robertson) та інші, 1988; Кілбурн придатних для застосування у вакцинних компози(Kilbourne), 1969; Аймард-Генрі (Aymard-Henry) та ціях, наведені у Осол (Osol) (1980). інші, 1985; Робертсон (Robertson) та інші, 1992). Гетерогенність вакцини може забезпечуватись Фармацевтичні композиції шляхом змішування реплікованих вірусів щонайменше двох штамів вірусу грипу, наприклад, 2-50 21 92132 22 штамів або будь-якої їх кількості у зазначених меКомпозицію вважають "фармакологічно прижах. Перевагу віддають штамам вірусів грипу А йнятною", якщо її введення може зноситись рециабо грипу В, що мають сучасний антигенний склад. пієнтом. Такий агент вважається введеним у "теЗа цим винаходом, із застосуванням методик, вірапевтично ефективній кількості", якщо введена домих у цій галузі, можуть пропонуватись вакцини кількість є фізіологічно значущою. Композиція за з варіаціями у межах одного штаму вірусу грипу. цим винаходом є фізіологічно значущою, якщо Фармацевтична композиція за цим винаходом наслідком її присутності є зміна фізіології реципієможе додатково містити щонайменше одну хіміонта, що піддається виявленню, наприклад, вона терапевтичну сполуку, наприклад, для генотерапії, посилює щонайменше одну первинну або вторинімунодепресанти, протизапальні засоби або підсину гуморальну або клітинну імунну реакцію проти лювачі імуногенних властивостей, і для вакцин, щонайменше одного штаму інфекційного вірусу хіміотерапевтичні засоби, у тому числі, але без грипу. обмеження ними, гамма-глобулін, амантадин, гуаЗабезпечуваний "захист" не повинен бути абсолютним, тобто грип не слід повністю запобігати нідин, гідроксибензимідазол, -інтерферон, або ліквідувати, якщо спостерігається статистично інтерферон, -інтерферон, фактор некрозу пухлин значуще поліпшення, порівняно з контрольною альфа, тіосемікарбазони, метіазон, рифампін, рипопуляцією або групою хворих. Захист може оббавірин, аналог піримідину, аналог пурину, фоскамежуватись полегшенням тяжкості або уповільрнет, фосфоноцтову кислоту, ацикловір, дидезокненням швидкості появи симптомів грипу. синуклеозиди, інгібітор протеаз або ганцикловір. Фармацевтичне введення Дивись, наприклад, Кацунг (Katzung) (1992) і посиКомпозиція за цим винаходом може забезпелання, наведені у його роботі на стор. 798-800 і чувати резистентність до одного або декількох 680-681, відповідно. патогенних мікроорганізмів, наприклад, до одного Композиції можуть також містити змінні, але або декількох штамів вірусу грипу, шляхом пасивневеликі кількості вільного від ендотоксину форної або активної імунізації. У разі активної імунізамальдегіду і консервантів, що є безпечними і не ції інактивовану або атенуйовану живу вакцинну додають свого вкладу до небажаних ефектів у композицію вводять хазяїну (наприклад, ссавцю) з організмі, до якого вводять композицію. профілактичною метою, і імунна реакція хазяїна на Фармацевтичні цілі введення захищає його від інфекції та/або захвоВведення композиції (або антисироваток, рювання. У разі пасивної імунізації утворені антиутворення яких вона викликає) може здійснювасироватки можуть відбиратися і вводитись реципітись із "профілактичною" або "терапевтичною" єнту з підозрою на присутність інфекції, що є метою. У разі профілактичного застосування, комвикликана щонайменше одним штамом вірусу грипозиції за цим винаходом, які являють собою вакпу. Генотерапевтична композиція за цим винахоцини, вводять до появи будь-якого симптому інфедом може забезпечити одержання профілактичних кції, викликаної патогенним мікроорганізмом. або терапевтичних рівнів бажаного генного продуПрофілактичне введення композиції здійснюють кту шляхом активної імунізації. для запобігання або ослаблення будь-якої подаЗа одним із варіантів здійснення, вакцину ввольшої інфекції. У разі профілактичного застосудять ссавцю-самиці (під час або перед вагітністю вання, генотерапевтичні композиції за цим винаабо пологами) за умови достатності часу і кількості ходом вводять до появи будь-якого симптому для спричинення імунної реакції, яка забезпечує захворювання. Профілактичне введення композизахист як самиці, так і плода або новонародженого ції здійснюють для запобігання або ослаблення (шляхом пасивного засвоєння антитіл через плаодного або декількох симптомів, пов'язаних із заценту або з молоком матері). хворюванням. Цей винахід включає також способи запобіганУ разі терапевтичного застосування, атенуйоня або ослаблення розладу або захворювання, вану або інактивовану вірусну вакцину вводять наприклад, інфекції, що викликається щонайменпри виявленні симптомів реальної інфекції. Тераше одним штамом патогенного мікроорганізму. За певтичне введення сполук(-и) сприяє послабленнаведеним описом, вважається, що вакцина заню будь-якої реальної інфекції. Дивись, наприбезпечує запобігання або ослаблення захворюклад, Берков (Berkow) та інші, 1992; Ейвері (Avery), вання, якщо наслідком її введення є повне або 1987; Кацунг (Katzung), 1992. У разі терапевтичночасткове ослаблення (тобто пригнічення) симптого застосування, генотерапевтичну композицію му або стану захворювання, або повний чи частковводять при виявленні симптому або ознаки завий імунітет індивіда до згаданого захворювання. хворювання. Терапевтичне введення сполук(-и) За наведеним описом, вважається, що генотерасприяє послабленню симптому або ознаки цього певтична композиція забезпечує запобігання або захворювання. ослаблення захворювання, якщо наслідком її ввеТаким чином, атенуйована або інактивована дення є повне або часткове ослаблення (тобто вакцинна композиція за цим винаходом може запригнічення) симптому або стану захворювання, стосовуватись або перед початком інфекції (для або повний чи частковий імунітет індивіда до згазапобігання або ослаблення передбачуваної інфеданого захворювання. кції), або після початку реальної інфекції. ПодібЩонайменше один інактивований або атенуним чином, у разі генотерапії, композиція може йований вірус грипу або композиція на його основі застосовуватись перед появою будь-якого симпза цим винаходом може вводитись за допомогою тому розладу або захворювання або після виявбудь-якого засобу, що забезпечує досягнення пелення одного або декількох симптомів. 23 92132 24 редбачуваних цілей, із застосуванням фармацевВинахід буде додатково описуватись наведетичної композиції, як описувалось вище. ними далі прикладами. Введення такої композиції може здійснюваПриклад 1 тись, наприклад, різноманітними парентеральними Матеріали і методи шляхами, наприклад, підшкірним, внутрішньовенКлітини і віруси. Клітини нирок людського заним, внутрішньошкірним, внутрішньом'язовим, родка лінії 293Т і клітини нирок собаки лінії Madinвнутрішньоочеревинним, інтраназальним, перораDarby (MDCK) підтримували у модифікованому за льним або черезшкірним шляхами. Парентеральспособом Дульбекко середовищі Ігла (DMEM), доне введення може здійснюватись шляхом ін'єкції повненому 10% сироватки зародка великої рогатої ударної дози або поступовим вливанням впродовж худоби, і у модифікованому середовищі Ігла певного періоду часу. Способом застосування фа(MEM), що містило 5% сироватки новонародженормацевтичної композиції за цим винаходом, якому го теляти, відповідно. Усі клітини підтримували при віддають перевагу, є введення внутрішньом'язотемпературі 37°С у 5% атмосфері СО2. Віруси гривим або підшкірним шляхом. Дивись, наприклад, пу A/WSN/33(H1N1) і A/PR/8/34(H1N1) розмножуБерков (Berkow) та інші, 1992; Ейвері (Avery), 1987; вали на 10-денних яйцях. Кацунг (Katzung), 1992. Конструювання плазмід. Для одержання генТипова схема запобігання, пригнічення або ліно-інженерних конструкцій на основі PHKкування захворювання, пов'язаного з вірусом гриполімерази І, клоновані кДHK, одержані з вірусної пу, включає введення за описом ефективної кільPHK A/WSN/33 або A/PR/8/34, вводили між промокості вакцинної композиції одноразовою дозою або тором і термінатором PHK-полімерази І. Стисло, підсиленими чи бустер-дозами впродовж періоду клоновані кДHK ампліфікували за допомогою почасу від одного тижня до приблизно 24 місяців або лімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) із праймерабудь-яких періодів у зазначених межах. ми, що містили сайти BsmBI, розщеплювали за "Ефективною кількістю" композиції за цим видопомогою BsmBI і клонували до сайгів BsmBl векнаходом є кількість, достатня для досягнення батора рНН21, що містить промотор людської PHKжаного біологічного ефекту. Слід розуміти, що полімерази І і термінатор мишачої PHKефективна доза буде залежати від віку, статі, стаполімерази І, відокремлені сайтами BsmBI (Фіг. 2). ну здоров'я і маси реципієнта, виду одночасно Гени РВ2, РВ1, РА, НА, ΝΡ, ΝΑ, Μ і NS штаму здійснюваного лікування, у разі його проведення, A/WSN/33 ампліфікували за допомогою полімерачастоти лікування та природи бажаного ефекту. зної ланцюгової реакції із застосуванням таких Наведені нижче діапазони ефективних доз не приплазмід: pSCWPB2, pGW-PB1 і pSCWPA (усі плазначені для обмеження винаходу і являють собою зміди одержали від д-ра Дебі Наяк (Debi Nayak), діапазони доз, яким віддають перевагу. Однак, Каліфорнійський університет, Лос-Анджелес), доза, якій віддають найбільшу перевагу, буде підpWH17, pWNP152, pT3WNA15 (Каструччі биратись для індивідуального суб'єкта, як розумі(Castrucci) та інші, 1992), pGT3WM і pWNS1, відпоється і визначається фахівцем у цій галузі. Дивись, відно. Ген РВ1 вірусу грипу A/PR/8/34 ампліфікунаприклад, Берков (Berkow) та інші, 1992; Ейвері вали із застосуванням pcDNA774 (PB1) (Перес (Avery), 1987; Кацунг (Katzung), 1992. (Perez) та інші, 1998) у ролі матриці. Послідовності Доза атенуйованої вірусної вакцини для доропраймерів дивись на Фіг. 6. Для забезпечення тослого ссавця (наприклад, людини) або птаха може го, щоб гени не мали небажаних мутацій, фрагмедорівнювати приблизно 103-107 бляшкотвірних нти, одержані за допомогою полімеразної ланцюодиниць (PFU)/kt або становити будь-яку кількість гової реакції, піддавали секвенуванню на у зазначених межах. Доза інактивованої вакцини автоматичному секвенаторі (фірма Applied може коливатись у межах від приблизно 0,1 мкг до Biosystem Inc, штат Каліфорнія, США) за методи200 мкг і дорівнювати, наприклад, 50 мкг гемаглюкою, рекомендованою виробником. кДHK, що котиніну. Доза, однак, повинна являти собою безпедують гени НА, ΝΡ, ΝΑ і M1 вірусу A/WSN/33, клочну і ефективну кількість, що визначається традинували, як описано (Хаддлстоун (Huddleston), ційними способами із застосуванням існуючих 1982) і субклонували до еукаріотного експресійновакцин як вихідної точки. го вектора pCAGGS/MCS (контрольованого проКількість імунореактивного НА у кожній дозі мотором курячого -актину) (Ніва (Niwa) та інші, реплікованої вірусної вакцини може стандартизу1991) з одержанням pEWSN-HA, pCAGGS-WSNватись, щоб містити прийнятну кількість, наприNP0-14, pCAGGS-WNA15 і pCAGGS-WSN-M1-2/l, клад, 1-50 мкг або становити будь-яку кількість у відповідно. Гени М2 і NS2 вірусу A/PR/8/34 амплізазначених межах, або дорівнювати кількості, рефікували за допомогою полімеразної ланцюгової комендованій Федеральним відомством охорони реакції і клонували до pCAGGS/MCS з одержанздоров'я США (PHS), що, як правило, становить 15 ням рЕР24с і pCA-NS2. Нарешті, pcDNA774(PB1), мкг на компонент для дітей, старіших за 3 роки і pcDNA762(PB2) і pcDNA787(PA) застосовували 7,5 мкг на компонент для дітей віком 103 бляшкотвірних одиниць/мл, підвищився до >106 бляшкотвірних одиниць/мл через 48 год після трансфікування (Таблиця 2). Для визначення відсотка трансфікованих плазмідами клітин, що продукували віруси, клітини лінії 293Т обробляли EDTA (0,02%) через 24 год після трансфікування для диспергування клітин, після чого проводили дослідження з кінцевим розведенням. У цьому експерименті вільного вірусу у культуральному супернатанті у цій часовій точці виявлено не було. Результати вказували на те, що 1 з 103,3 клітин продукувала інфекційні вірусні частинки. Таблиця 2 Кінетика продукування вірусу після трансфекції клітин лінії 293Т плазмідами* Час після трансфікування плазмід, год 6 12 18 24 30 36 42 48 Титр вірусу у культуральному супернатанті (бляшкотвірні одиниці/мл) Експеримент 1 2 3 0 ND ND 0 ND 0 0 ND 0 0 2 103 6 103 ND 5 104 9 104 2 5 6 10 >1 10 7 105 6 ND >1 10 5 106 4 6 8 10 >1 10 1 107 * Клітини лінії 293Т трансфікували вісьмома плазмідами PHK-полімерази І, що кодують гени вірусу A/WSN/33, за винятком гена РВ1, який одержують із вірусу A/PR/8/34, та дев'ятьма плазмідами, що експресують білок, як описано у тексті. Вірус у культуральному супернатанті клітин лінії MDCK титрувався нами у різні часові точки. ND=нe здійснювали. Виділення вірусу грипу, що містить антигенну детермінанту FLAG на білку NA. Для перевірки того, чи надає нова зворотногенетична система можливість введення мутацій до геному вірусів грипу А, продукували вірус, що містив антигенну детермінанту FLAG (Каструччі (Castrucci) та інші, 29 92132 30 1992) на білку NA. Клітини лінії 293Т трансфікуваньоклітинного синтезу вPHK із застосуванням ли плазмідою PHK-полімерази І (pPolI-WSNPHK-полімерази І і шляхом стимульованої плазміNA/FL79), що містила кДHK, яка кодує як білок NA, дами експресії вірусних полімеразних білків і NP. так і антигенну детермінанту FLAG у нижній частиОкрім того, завдяки застосуванню клітин лінії 293Т, ні "головки" білка, разом із необхідною PHKякі легко трансфікуються плазмідами (Гото (Goto) полімеразою І і плазмідами, що експресують білок. та інші, 1997), велика популяція клітин одержала Для підтвердження того, що виділений вірус (PR8усі плазміди, необхідні для продукування вірусу. WSN-FL79) дійсно експресує білок NA-FLAG, проНа додаток до цього, велика кількість транскрипвели аналізи з імунозабарвлюванням клітин, інфітів, продукована PHK-полімеразою І, яка належить кованих PR8-WSN-FL79 або вірусом дикого типу до найбільш експресованих ферментів у культивоA/WSN/33. Моноклональне антитіло до антигенної ваних клітинах, ймовірно, сприяла загальній ефекдетермінанти FLAG виявляло клітини, інфіковані тивності системи. Завдяки цим особливостям відPR8-WSN-FL79, але не виявляло клітин, інфіковаповідно одержали велику кількість транскриптів них вірусом дикого типу. Ефективність виділення вPHK і відповідні кількості вірусного білка для капвірусу PR8-WSN-FL79 була такою самою, як і ефесидування вPHK, утворення рибонуклеопротеїнів у ктивність виділення неміченого вірусу дикого типу ядрі і експортуванні цих комплексів до клітинної (дані не представлені). Ці результати вказують на мембрани, де складаються і виділяються нові віте, що нова зворотногенетична система уможливруси. лює введення мутацій до геному вірусу грипу А. Раніше розроблені зворотногенетичні системи Одержання інфекційного вірусу грипу, що міс(Енамі (Enami) та інші, 1990; Ньюманн (Neumann) тить мутації у гені РА. Для одержання вірусів, що та інші, 1994; Лютьєс (Luytjes) та інші, 1989; Плешмають мутації у гені РА, ввели дві мутації, що мовка (Pleschka) та інші, 1996) потребують інфікуванчать, зі створенням нових розпізнавальних посліня вірусами-помічниками і, унаслідок цього, спосодовностей для рестриктаз (Bsp120I у положенні бів добору, які надають можливість відбирання 846 і PvuII у положенні 1284 мPHK). Раніше можневеликої кількості трансфектантів з великої кільливості модифікування цього гена засобами звокості вірусів-помічників. Таку стратегію було засторотної генетики не було із-за відсутності надійної совано для одержання вірусів грипу, що мають селекційної системи. Виділили вірусиодин із вказаних нижче генів, одержаних з кДHK: трансфектанти, РА-Т846С і РА-А1284. Виділені РВ2 (Суббарао (Subbarao) та інші, 1993), НА (Енавіруси-трансфектанти піддавали біологічному кломі (Enami) та інші, 1991; Хорімото (Horimoto) та нуванню шляхом двох послідовних кінцевих розінші, 1994), NP (Лі (Li) та інші, 1995), NA (Енамі ведень. Для перевірки того, що виділені віруси (Enami) та інші, 1990), Μ (Каструччі (Castrucci) та дійсно були вірусами-трансфектантами з мутаціяінші, 1995; Ясуда (Yasuda) та інші, 1994) і NS ми гена РА, кДHK гена РА одержали за допомогою (Енамі (Enami) та інші, 1991). Більшість способів полімеразної ланцюгової реакції зі зворотною традобору, за виключенням тих, що застосовуються нскриптазою. Віруси РА-Т846С і РА-А1284С мали до генів НА і NA, базується на температурі культиочікувані мутації у межах гена РА, що було продевування, обмеженні кола хазяїв або чутливості до монстровано присутністю нововведених сайтів лікарських препаратів, що обмежує придатність рестрикції. Оскільки при проведенні полімеразної зворотної генетики для функціонального аналізу ланцюгової реакції з тими самими зразками вірусів генних продуктів. Навіть у разі генів НА і NA, для і праймерами без стадії застосування зворотної яких існують надійні стимульовані антитілами систранскриптази жодних продуктів не одержали (дані теми добору, важко одержати віруси з чітко виране наведені), це вказувало на те, що кДHK РА дійженими дефектами росту. У протилежність до цьосно походила з вPHK, а не з плазмід, що застосого, описані зворотногенетичні системи не вувались для одержання вірусів. Ці результати потребують віруса-помічника і надають можливість показують, яким чином можуть бути одержані і одержання трансфектантів з мутаціями у будьвиділені віруси з мутантними генами без застосуякому сегменті гена або з тяжкими дефектами ровання вірусів-помічників. сту. Доступність технології введення будь-якої Обговорення життєздатної мутації до геному вірусу грипу А, Описані зворотногенетичні системи надають надає дослідникам можливість вирішення ряду можливість ефективного продукування вірусів гридавніх проблем, наприклад, визначення природи пу А повністю з клонованих кДHK. Бріджен регуляторних послідовностей на нетрансльованих (Bridgen) і Елліотт (Elliott) (1996) також застосовуділянках вірусного геному, структуриовали зворотну генетику для одержання вірусу Буфункціональних взаємозв'язків вірусних білків та ньямвера (сімейство Bunyaviridae), однак він місмолекулярної основи обмеження кола хазяїв і вітив лише три сегменти "мінус-ниткової" PHK, і русної патогенності. ефективність його продукування була низькою, 102 Незважаючи на існування інактивованих пробляшкотвірних одиниць/107 клітин. Хоча вихід вітигрипозних вакцин, їхня ефективність є субоптирусу був різним у різних експериментах, у разі вімальною унаслідок, частково, їхньої обмеженої русу грипу, що містив вісім сегментів, спостерігаздатності до викликання місцевих IgA та цитотоклась постійна ефективність продукування, >103 сичних Т-клітинних імунних реакцій. Результати бляшкотвірних одиниць/106 клітин. Існує декілька клінічних випробувань адаптованих до холоду жипояснень високої ефективності описаної вище вих протигрипозних вакцин, які проводяться зараз, зворотногенетичної системи. Замість продукуванвказують на те, що такі вакцини є оптимально атеня рибонуклеопротеїнів in vitro (Лютьєс (Luytjes) та нуйованими, завдяки чому вони не будуть виклиінші, 1989), їх одержували in vivo шляхом внутрішкати симптомів грипу, але, незважаючи на це, бу 31 92132 32 дуть індукувати захисний імунітет (оглядова стаття сегментованих "мінус-ниткових" вірусів (наприКейтел (Keitel), Пьєдра (Piedra), 1998). Попередні клад, Bunyaviridae, Arenaviridae). Можливість манірезультати вказують, однак, на те, що ці живі вірупулювання вірусним геномом без технічних обмесні вакцини будуть не набагато ефективнішими, жень має глибоке значення для дослідження аніж найкращі інактивовані вакцини (оглядова життєвих циклів вірусів та їх регуляції, функції вістаття Кейтел (Keitel), Пьєдра (Piedra), 1998), що русних білків і молекулярних механізмів патогензалишає можливість додаткового поліпшення. Одності вірусів. нією з можливостей може бути модифікація адапПриклад 2 тованої до холоду вакцини за допомогою описаної Для розробки зворотногенетичної системи для вище зворотногенетичної системи. За альтернативірусу грипу A/Puerto Rico/8/34, вірусну PHK екствним варіантом, можна розпочати роботу на голорагували з алантоїсної рідини A/Puerto Rico/8/34 му місці шляхом одержання, за допомогою зворо(H1N1), високопродуктивного варіанта Madison тної генетики, "вихідного" штаму вірусу грипу А з (PR8HG), за допомогою набору RNeasy Mini kit численними атенуювальними мутаціями в генах, (фірма Qiagen) за методикою виробника. кДHK що кодують внутрішні білки. Найцікавіше застосусинтезували за допомогою набору MMLV-RTase вання описаної зворотногенетичної системи може (фірма Promega) і праймеру Unit 12. кДHK ампліполягати у швидкому продукуванні атенуйованих фікували впродовж ночі за допомогою полімеразживих вірусних вакцин у разі очікуваних пандемій, ної ланцюгової реакції із застосуванням наведенощо залучають нові підтипи НА або NA вірусу грипу. го нижче: Ця нова зворотногенетична система, ймовір35 но, посприяє застосуванню вірусів грипу як вакНабори праймерів цинних векторів. Ці віруси можуть конструюватись РВ1: таким чином, щоб експресувати чужорідні білки Ва РВ1-1 і PB1-1735R (передній фрагмент) та або антигенні детермінанти з імуногенним потенРВ1-903 і Ba-PB1-2341R (задній фрагмент) ціалом на додаток до білків вірусу грипу. Можна, Ва-РВ1-1 наприклад, продукувати віруси з чужорідними білCACACACGGTCTCCGGGAGCGAAAGCAGGCA ками, що відіграють роль дев'ятого сегмента (Ена(Послідовність № 9) мі (Enami) та інші, 1991), і застосовувати їх, як живі 173PB1-1735R вакцини. Віруси грипу не лише стимулюють сильні GGGTTTGTATTTGTGTGTCACC (Послідовність № клітинноопосередковані і гуморальні імунні реакції, 10) але вони також надають великий набір віріонних 233РВ1-903 поверхневих білків НА і NA (наприклад, 15 підтипів CCAGGACACTGAAATTTCTTTCAC (Послідовність НА, 9 підтипів NA та їхні епідемічні варіанти), що № 11) забезпечує можливість повторної вакцинації насеBa-PB1-2341R лення. CACACAGGTCTCCTATTAGTAGAAACAAGGCATT Частинки, подібні вірусу грипу, що мають штуT (Послідовність № 12) чну вPHK, яка кодує репортерний ген, одержали РВ2: шляхом експресії вірусних структурних білків і Ва РВ2-1 та В2 1260R (передній фрагмент) та вPHK системою вірусу коров'ячої віспи-полімерази WSN PB2 seq-2 та Ва-PB2-2341R (задній фрагТ7 (Мена (Mena) та інші, 1996). Зараз, за допомомент) гою зворотної генетики, можна одержати вірусоВа-РВ2-1 подібні частинки (VLPs), що містять вPHK, які коCACACAGGTCTCCGGGAGCGAAAGCAGGTC (Подують білки, необхідні для транскрипції та слідовність № 13) реплікації вPHK (тобто РА, РВ1, РВ2 і NP), а також В2 1260R вPHK, які кодують білки, що становляють інтерес. CACACACGTCTCCATCATACAATCCTCTTG (ПосТакі вірусоподібні частинки можуть виявитись колідовність № 14) рисними засобами доставки генів. Важливо те, що WSN PB2 seq-2 CTCCTCTGATGGTGGCATAC відсутність у них генів, що кодують вірусні структу(Послідовність № 15) рні білки, забезпечує те, що після VLP-генотерапії Ba-PB2-2341R не буде відбуватись продукування інфекційних CACACAGGTCTCCTATTAGTAGAAACAAGGTCGT вірусів. Оскільки геном вірусів грипу не інтегруєтьTT (Послідовність № 16) ся до хазяйської хромосоми, VLP система може РА: бути придатною для генотерапії у ситуаціях, які Bm-PA-1 потребують лише короткочасної трансдукції клітин CACACACGTCTCCGGGAGCGAAAGCAGGTAC (наприклад, для лікування раку). У протилежність (Послідовність № 17) до векторів на основі аденовірусів (Ковешді Bm-PA-2233R (Kovesdi) та інші, 1997), частинки, подібні вірусу CACACACGTCTCCTATTAGTAGAAACAAGGTACTT грипу, можуть містити варіанти як НА, так і NA, що (Послідовність № 18) надає можливість повторної обробки населення, НА: що піддається вакцинації. Вт-НА-1: Сімейство Orthomyxoviridae включає віруси CACACACGTCTCCGGGAGCAAAAGCAGGGG (Погрипу А, В і С, а також нещодавно класифікований слідовність № ) тоготовірус (Thogotovirus). Описана стратегія проBm-NS-890R: дукування інфекційних вірусів грипу А повністю з CACACACGTCTCCTATTAGTAGAAACAAGGGTGT клонованих кДHK може бути застосована до будьTTT (Послідовність № 20) яких ортоміксовірусів, а можливо також і до інших NP: 33 92132 34 Bm-NP-1 (фірма Qiagen) і літували впродовж ночі між сайCACACACGTCTCCGGGAGCAAAAGCAGGGTA тами Bsm BI вектора pPolIR. (Послідовність № 21) Ліговані гени РВ1, ΡΑ, ΝΡ, Μ і NS-pPolIR заДHK-полімераза: pfu (бляшкотвірних одиниць) стосовували для трансформування JM109 (гени Μ нативної ДHK-полімерази (фірма Stratagene) і NS) або DH5alpha (гени РВ1, РА і NP) впродовж Продукти полімеразної ланцюгової реакції ночі. Колонії трансформованих бактерій культиву(PCR) відділяли шляхом гель-електрофорезу і вали у LB (середовищі Луріа) впродовж ночі. Лігоекстрагували з гелю агарози за допомогою набору ваний PB2-pPolIR застосовували для трансформудля екстракції з гелю (фірма Qiagen). Екстраговані вання JM109 впродовж ночі. гени літували до дефосфорилованого вектора Плазміди екстрагували з бактеріальних кульрТ7Blue (фірма Novagen) за допомогою набору тур і присутність генних вставок підтверджували для літування фірми Takara, версія II (фірма шляхом ферментативного розщеплення. Колонії Takara). Через 5 год ліговані гени перетворювали бактерій, трансформованих PB2-PolIR, культивуна JM109 (гени РВ2, Μ і NS) або DH5alpha (PA, вали у LB впродовж 8 год. Після цього плазміди PB1 і NP). Шість колоній для кожного гена культиекстрагували і присутність генної вставки підтвервували у триптоновому живильному середовищі джували шляхом ферментативного розщеплення. (ТВ) впродовж 8 год. Плазміди екстрагували з куУсі генно-інженерні конструкції на основі рРоlІ підльтури бактерій і секвенували у кількості чотирьох давали секвенуванню для перевірки того, що вони клонів на ген. не містять небажаних мутацій. Гени PA, NP, M і NS у pT7Blue вирізали за доГенно-інженерні конструкції на основі pPolIR помогою ферменту BsmBl (фірма New England для PR8HG трансфікували до клітин нирок людсьBiolabs). Ген РВ1 вирізали за допомогою Bsa І (фікого зародка лінії 293Т із генно-інженерними консрма New England Biolabs). Вирізані гени літували трукціями на основі Poll для A/WSN/33(WSN)-HA і впродовж ночі з вектором pPolIR, що містить проNA, A/Hong Kong/483/97(HK)-Havir і ΝΑ або мотор людської PHK-полімерази І і термінатор A/Kawasaki/01(Kawasaki)-HA і ΝΑ та чотирма генмишачої PHK-полімерази І, який був розщеплений но-інженерними конструкціями для експресії поліза допомогою Bsm BI. Передній фрагмент гена меразних білків і ΝΡ A/WSN/33. Супернатанти траРВ2 у рТ7Blue вирізали за допомогою Bsr GI (фірнсфікованих клітин лінії 293Т піддавали серійному ма New England Biolabs) і Ват НІ (фірма Roche), а розведенню (нерозведені до 10-7) і інфікували низадній фрагмент вирізали за допомогою Bsr GI ми алантоїсні порожнини 9-денних курячих яєць з (фірма New England Biolabs) i Spe І (фірма Roche). ембріонами, що розвиваються. Алантоїсну рідину Вирізані фрагменти змішували і розщеплювали за інфікованих яєць збирали і титри вірусу визначали допомогою Bsa І. Через б год розщеплені гени за допомогою реакції гемаглютинації (НА) (Таблиочищали за допомогою набору для PCR-очищення ця 3). Таблиця 3 Вірус, що має гени РВ8 разом з наведеними нижче генами НА і NA WSN-HA NA HK-Havir NA Kawasaki-НА ΝΑ Титр гемаглютинінів (HAU/мл) алантоїсної рідини яєць, інфікованих супернатантами 293Т, розбавленими до: нерозведений 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7