Спосіб визначення персистуючого вірусу грипу у віл-інфікованих осіб в міжепідемічний по грипу період

Спосіб визначення персистуючого вірусу грипу у ВІЛ-інфікованих осіб в міжепідемічний по грипу 3 ПЛР - це спеціальний метод, що імітує природну реплікацію ДНК і дозволяє виявити єдину молекулу ДНК, специфічну для будь-якого мікроорганізму, при наявності мільйонів інших молекул [8]. В якості об'єкта дослідження використовують мазки з носоглотки, плазму та мононуклеарні клітини крові. Суть методу полягає в розмноженні (ампліфікації) у пробірці визначених ділянок ДНК у процесі багаторазового повторювання температурних циклів [8]. На кожному циклі, за допомогою ДНКполімерази, відбувається копіювання знов синтезованих молекул, завдяки чому специфічні фрагменти ДНК багатократно подвоюються. Для детекції результатів ампліфікації використовують методи гібрідізаційно-ферментного аналізу з використанням олігонуклеотидних зондів (ГІФА), електрофорезу, заснованого на розподілі молекул ДНК за молекулярною вагою, або вимірювання флуоресцентного сигналу у режимі реального часу за допомогою флуоресцентного ПЛРдетектору. Для виявлення РНК вірусів грипу А і В у клінічному матеріалі використовують набір реагентів (тест-систему) для ПЛР «АмплиСенс Influenza virus A/B-Eph» з електрофоретичною детекцією продуктів ампліфікації у агарозному гелі (м.Москва, Росія) [7]. Набір складався з комплектів реагентів: «Рибо-сорб» - для виділення РНК з біологічного матеріалу; «Реверта-R-100» - для отримання кДНК з виділеної РНК. «АмплиСенс- 100-R» - для проведення ПЛР; «ЭФ-200» - для аналізу продуктів ПЛР в агарозному гелі. В тест-системі фірми „АмплиСенс" (Росія) використовується внутрішній контрольний зразок (ВКО STI-550-rec) - модифікований, клонований в плазміді фрагмент кДНК досліджуваного вірусу, фланкований праймерами, що відібрані для ампліфікації кДНК. ДНК внутрішнього контрольного зразка (ВКО) ампліфікується разом з кДНК досліджуваного вірусу. Спочатку здійснюють лізис біологічної проби за допомогою гуанідінтиоцианатного методу (руйнування клітинної стінки лізуючим розчином - гуанідінтиоцианатом) і отримують вільну РНК. Сорбційним методом вільну РНК сорбують на силікагель (25мкл сорбенту на 100мкл досліджуваного зразка). Після багаторазового відмивання РНК з сорбентом від білків, солей та інших інгібіторів за допомогою розчину для відмивки, 70° етанолу та ацетону, сорбент підсушують при t=60°C. Елюірують РНК з сорбенту за допомогою ТЕбуферу інкубуванням при 60°С - 2 хвилини та центрифугують при 12тис. об/хв. протягом 1 хвилини. Потім, ДНК, комплементарну вірусній геномній РНК (кДНК), отримують за допомогою ферменту ревертази (M-MLV - reverse transcriptase), з набору «Реверта-R-100» фірми «АмплиСенс» (Росія), згідно інструкції виробника [7]. Реверта - рекомбінантна модифікована РНК-залежна ДНК- полімераза з вірусу лейкемії мишей, яку очищено до електро 43503 4 форетичної гомогенності методом метал-хілатної хроматографії, в буфері для зберігання (20mM Tris-HCl (рН=7,5), 0,2М NaCl, 0,1mМ EDTA, 1mМ DDT, 100mМ КСl, 0,01% NP-40, 50% glycerol). АКТИВНІСТЬ ревертази складає 200од/мкл. Кожну реакційну суміш з досліджуваним зразком та 0,5мкл ревертази прогрівають протягом 30 хвилин при 37°С. Ампліфікацію проводять на ампліфікаторі «Терцик» (ДНК-технологія, Росія) за відомою методикою. Режим ампліфікації включає три етапи: перший - «гарячий старт» при 95°С 5 хвилин; другий - складається з 42 циклів, в кожному з яких відбувається денатурація (при 95°С 10с), віджиг (63°С 10с), елонгація (при 72°С 10с); третій - елонгація при 72°С протягом 1 хвилини. Для візуалізації результатів ампліфікації використовують метод електрофорезу, оснований на розподілі молекул ДНК за молекулярною вагою. Детекція ампліконів проводиться в 2% агарозному гелі з бромистим етидієм в УФ-світлі при довжині хвилі 302нм. Облік результатів здійснють за допомогою спеціалізованої системи обробки зображень «BIOTEST-A» («ВІОКОМ», Росія), згідно інструкції виробника [7]. Приклад 2. Визначення ефективності способу. Ефективність способу визначають за частотою виявлення вірусів грипу А і В у ВІЛ-інфікованих пацієнтів з симптомами гострої респіраторної інфекції при порівняльному аналізі результатів одночасного дослідження кліннічного матеріалу, отриманого з різних відділів дихальних шляхів, та плазми периферичої крові методом ПЛР. Забір крові у ВІЛ-інфікованих осіб проводять із периферичної вени одноразовою голкою (діаметр 0,8-1,1мм) в спеціальну вакуумну систему типу «Venoject» (з 6% ЕДТА), або «Vacuett®» (з 6% ЕДТА) у співвідношенні ЕДТА до крові як 1:20. Під час забору пробку «Vacuett®» проколюють спеціальною насадкою з голкою, завдяки чому кров в стерильних умовах потрапляє до вакуумної системи, яка містить антикоагулянт. Для отримання плазми закриту пробірку з цільною кров'ю та коагулянтом перевертають 3-4 рази, потім - центрифугують при 1500об./хв. протягом 20 хвилин при кімнатній температурі. Плазму, кількістю не менш 1мл, відбирають окремими наконечниками з аерозольним бар'єром в одноразові стерильні пробірки типу „eppendorf", об'ємом 1,5мл. Зразки плазми зберігають при температурі мінус 70°С (до використання). Одночасно мазки із порожнини носа (нижній носовий хід, зовнішня стінка носу) і ротоглотки (ньобні мигдалини, передні дужки, задня стінка) забирають одноразовими зондами з ватними тампонами. Після взяття матеріалу зонди поміщають в стерильні пробірки, які містять 500мкл транспортувального середовища (0,14М фізіологічний розчин NaCl з додаванням 1% бичачої сироватки). До проведення дослідження зразки зберігають при 70°С. Взятий клінічний матеріал, отриманий від 29 пацієнтів з симптомами гострої респіраторної інфекції, тестують запропонованим способом. Для 5 43503 виділення РНК збудників із клінічних проб використовують набір «Рибо-сорб», для проведення реакції зворотної транскрипції - набір «Реверта», ампліфікацію специфічних нуклеотидних послідовностей вірусу грипу проводять з використанням набору «АмплиСенс-100-R». Детекцію продуктів ампліфікації здійснюють методом електрофорезу у 2% агарозному гелі. 6 Грипозну інфекцію вдалось встановити у 12 із 29 (41,3%), пацієнтів. Серед вірусів грипу частка грипу типу А склала 83,3%, грипу типу В - 16,7%, що відповідало даним вірусологічного дослідження. Було також проаналізовано частоту виявлення РНК вірусу грипу А при тестуванні клінічного матеріалу, отриманого з різних відділів дихальних шляхів, та в плазмі периферичої крові (табл.1). Таблиця 1 Частота виявлення РНК вірусу грипу типу А в клінічному матеріалі, отриманому від ВІЛ-інфікованих з симптомами гострої респіраторної інфекції Досліджувані зразки Мазки з порожнини носа Мазки з порожнини глотки Мазки з порожнини носа та глотки одночасно Плазма крові РНК вірусу грипу А Кількість зраків з позитив- Частота виявлення генетичноКількість зразків ним результатом го матеріалу вірусу (%) 24 7 30 24 2 8 24 13 54 10 5 50 При дослідженні зразків плазми крові вірус грипу типу А було виявлено в 50% випадків, вірус грипу типу В у плазмі був відсутній. Одночасно у мазках з порожнини носа і глотки вірус грипу типу А було виявлено у 54%, тільки в мазках з носа, при відсутності в мазках з глотки - у 30%, тільки в мазках з глотки, при відсутності в мазках з носа - у 8% випадків, що свідчило про доцільність забору клінічного матеріалу в одну пробірку одночасно з слизових оболонок носа і глотки для підвищення частоти виявлення вірусів грипу А і В у ВІЛ-інфікованих пацієнтів з симптомами гострої респіраторної інфекції. Ефективність способу визначають також за можливістю виявлення персистентних форм вірусів грипу А і В у ВІЛ-інфікованих пацієнтів. До досліджуваної групи включають ВІЛінфікованих пацієнтів, для яких характерні часті (до 6-10 разів протягом року) захворювання на ГРІ, що може свідчити про персистування в організмі хворого вірусу грипу у формі імунного комплексу «вірус грипу-антитіло».Тому забір крові здійснюють у міжепідемічний період. В якості об'єкта дослідженнявикористовують мононуклеари периферичної крові, оскільки імунні комплекси «вірус грипу-антитіло» виявляються протягом тривалого часу переважно у мононуклеарній фракції периферичної крові. З метою отримання мононуклеарних клітин забір крові у ВІЛ-інфікованих осіб проводять із периферичної вени, з використанням стерильних одноразових пробірок Becton Dickinson's VACUTAINER® CPT™ Cell Preparation Tube, що містять цитрат натрію в якості антикоагулянту. Закриті пробірки з відібраною кров'ю обережно перевертають 8-10 разів для перемішування цільної крові з антикоагулянтом та центрифугують на центрифузі з горизонтальним ротором при 2000об./хв. протягом 30 хвилин. Мононуклеарні клітини переносять в стерильні пробірки типу „eppendorf, об'ємом 1,5мл та двічі відмивають фосфатно-сольовим буфером, який не містить Са++ або Mg++. Зразки зберігають при температурі мінус 70°С. Далі проводять визначення генетичного матеріалу вірусів грипу А і В у зразках мононуклеарних клітин периферичної крові запропонованим способом. Результати визначення РНК вірусу грипу методом ПЛР у клінічних зразках, отриманих від 49 ВІЛ-інфікованих пацієнтів у міжепідемічний по грипу період, представлені в таблиці 2. При дослідженні зразків плазми крові, отриманих від ВІЛ-інфікованих пацієнтів, які часто хворіютьна ГРІ, РІЖ вірусу грипу типу А було виявлено в 8,3% випадків, вірусу грипу типу В - у 2,1%. В мазках з порожнини носа і глотки, отриманих від цих пацієнтів, віруси грипу були відсутні. В той же час у зразках мононуклеарних клітин крові наявність РНК вірусу грипу типу А було встановлено в 38,7%, вірусу грипу типу В - в 6,1% випадків. Визначення генетичного матеріалу вірусів грипу А і В у зразках плазми та мононуклеарних клітин крові, отриманих від ВІЛ-інфікованих осіб у міжепідемчний по грипу період, свідчить про персистування у них вірусу у формі імунних та інфекцйних комплексів. 7 43503 8 Таблиця 2 Частота виявлення РНК вірусів грипу А і В у клінічних зразках, отриманих від ВІЛ-інфікованих осіб у міжепідемічний по грипу період Досліджувані зразки Мазки з порожнини носа Мазки з порожнини рота Плазма крові Мононуклеарні клітини крові РНК вірусу грипу А РНК вірусу грипу В Частота виявленЧастота виявКількість осіб з поня генетичного Кількість осіб з пози- лення генетичзитивним результаматеріалу вірусу тивним результатом ного матеріалу том (%) вірусу (%) 0 0 0 0 4 8,3 1 2,1 19 Результати визначення частоти виявлення генетичного матеріалу вірусів грипу А і В у зразках плазми та мононулеарних клітин крові свідчать, що застосований нами спосіб є ефективним, сприяє розширенню можливостей способу для дослідження персистентних форм вірусу грипу та дає можливість визначати їх у ВІЛ-інфікованих в міжепідемічний період. Таким чином, запропонований корисною моделлю спосіб виявлення персистентних форм вірусу грипу у ВІЛ-інфікованих осіб у міжепідемічний по грипу період має значні переваги над відомим спрощує спосіб, оскільки не потребує вивільнення вірусу із сформованих структур «антиген+антитіло» (з використанням антиглобулінової сироватки або інших додатових дій для руйнування імунних комплексів) для подальшого визначення наявності вірусу грипу в організмі за допомогою класичних вірусологічних методів [9,10]; дозволяє у короткий термін визначати наявність персистентних форм вірусу грипу і перехід їх у реплікативно активні форми, що зумовить своєчасне проведення профілактичних і лікувальних заходів для попередження розповсюдження грипозної інфекції серед ВІЛ-інфікованих і матиме вплив на тривалість та якість життя хворих. Література: 1. Методические рекомендации по унифицированным методам вирусологической и серологической диагностики гриппа и острых респираторных вирусных заболеваний (Утверждены бюро Президиума Ученого Медицинского совета МЗ УССР 9.10.79 г., протокол № 27). - Киев, 1979.-21 с. 2. Карпухин Г.И., Карпухина О.Г. Диагностика, профилактика и лечение острых респираторных заболеваний. - Санкт-Петербург.: Изд-во «Гиппократ», 2000. - 179 с. Комп’ютерна верстка А. Крижанівський 38,7 3 6,1 3. Новые возможности диагностики острых респираторных инфекций у детей / Е.В.Кожевникова, А.А.Мухина, Г.А.Шипулин и др.// Генодиагностика инфекционных болезней. Сб. трудов 5-й Всероссийской научно-практич. конф.- Москва. - 2004.Т.П.- С.54-56. 4. Шаркова В.Е., Власов Г.С., Свежова Н.В. Ошибки при проведении иммуноферментного анализа// Клин. лаб. диагностика.- 2007.- № З.-С. 42-45. 5. Разработка и апробация новых молекулярно-биологических тест-систем для диагностики респираторных вирусных инфекций у иммунодепрессивных онкогематологических больных / А.В.Волков, Н.Б.Румель, Е.И.Кайтанджан и др.//Генодиагностика инфекционных заболеваний. Сб тезисов 4-й Всероссийской научно-практич. Конф. Москва. - 2002.- С.204-205. 6. Этиологическая структура ОРЗ у детей /СБ. Яцышина, Т.Ю.Кондратьева, А.В.Горелов и др. // Генодиагностика инфекционных болезней-2007. Сб. трудов VI Всероссийской научно-практич. Конференции.- Москва.- 2007.- т. 7. Мухина А.А., Шипулин Г.А., Кожевникова Е.Н.,Кузьмина В.Н. ГЩР-диагностика респираторных вирусных инфекций// Генодиагностика инфекционных заболеваний. Сб тезисов 4-й Всероссийской научно-практич. конф. Москва. - 2002.- С.231233. 8. Полімеразна ланцюгова реакція для виявлення збудників патологічних процесів // Тимчасові методичні вказівки ТМВ 9.9.1. - 2001. - МОЗ України. Видання офіційне. 9. Грипп/ А.Ф.Фролов, Е.А.Шабловская, Л.Ф.Шевченко и др. - К.: Здоров'я, 1985.-128 с. 10. Фролов А.Ф. Персистенция вирусов (Механизмы и клинико-эпидемиологические аспекты). В.: Изд-во Винницкого медуниверситета, 1995.233с. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601