Новий поверхневий білок haemophilus influenzae (білок е; ре)

1. Композиція вакцини, що містить поверхневий білок, який може бути виявлений у Наетоphilus influenzae, що має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 1, або його фрагмент, де вказаний фрагмент містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 15 послідовних амінокислот з амінокислотної послідовності SEQ ID NO:1, вказаний фрагмент (при необхідності в поєднанні з носієм) здатний індукувати імунну відповідь, що розпізнає поліпептид SEQ ID NO:1. 2. Композиція вакцини, що містить імуногенний фрагмент поверхневого білка за пунктом 1, який може бути виявлений у Haemophilus influenzae. 3. Композиція вакцини, що містить рекомбінантний імуногенний білок на основі білка за пунктом 1, де амінокислоти в положеннях з 1 по 21 послідовності SEQ ID NO: 1 були видалені або замінені однією або декількома амінокислотами. 2 (19) 1 3 92782 4 11. Композиція вакцини за пунктом 10, де вка13. Застосування вакцини за будь-яким з пункзана композиція містить щонайменше один інтів 1-4 для виробництва лікарського засобу для ший антиген Haematophilus іnfІиеnzае. профілактики або лікування інфекції, де інфекція 12. Композиція вакцини за будь-яким з пунктів 1викликана Haematophilus іпfІиеnzае. 9, до складу якої входить білок D з Haematophilus іnfІиеnzае. Галузь, до якої належить винахід Даний винахід стосується поверхневого білка Е, фактора вірулентності, який існує у всіх інкапсульованих і атипових Haemophilus influenzae. Передумови до створення винаходу Як Haemophilus influenzae b типу (Hib), так і атипова Н. influenzae (NTHi) викликають цілий ряд захворювань у дітей і дорослих. Hib викликає бактеріальний менінгіт і інші інвазивні інфекції у дітей молодше 4-х років, тоді як NTHi була виділена у випадках середнього отиту, синуситу, епіглотиту, трахеобронхіту і пневмонії, і може викликати сепсис у новонароджених. У цей час відсутня комерційно доступна вакцина проти NTHi, а проти Hib використовують ряд вакцин. Ці вакцини складаються з капсульного полісахариду Hib, полірибозилрибітол фосфату, кон'югованого з різними білковими носіями (комплексом білків зовнішньої мембрани менінгокока, правцевим токсоїдом, нетоксичним мутантом дифтерійного токсину або дифтерійним токсоїдом) для подолання слабкої імунної відповіді на капсульний полісахарид у дітей молодше 18 місяців. Білки зовнішньої мембрани Н. influenzae (OMP) також розглядаються як носії полірибозилрибітол фосфату, оскільки показано, що вони є мішенями для антитіл хазяїна, супроводжуючи Hib і NTHi інфекції. Антитіла до ОМР Р1, Р2, Р4, Р5 і Р6 і білок 98-кДа були протестовані в in vivo протективних і in vitro бактерицидних дослідженнях відносно інфекцій, викликаних Н. influenzae, з антитілами до Р1, Р4 і Р6, демонструючи біологічну активність як у відношенні гомологічних, так і у відношенні гетерологічних штамів Н. influenzae. Недостатній гетерологічний захист з боку антитіл у відношенні інших ОМР частково має місце внаслідок антигенної варіабельності цих білків серед різних штамів Н. influenzae. Отже, ідеальний антиген повинен бути як представленим на поверхні бактерії, так і мати стабільні антигенні властивості. Лабораторно був виділений, клонований, секвенований мембранний білок 42-кДа (білок D), який широко поширений і є антигенно-стабільним серед обох штамів Hib і NTHi, і було показано, що він є патогенетичним чинником і можливим кандидатом для вакцини (1-5). Два десятиріччя назад, було показано, що Haemophilus influenzae і Μ. catarrhalis демонструють високу афінність відносно як розчинного, так і поверхнево-зв'язаного IgD людини (6). Представляється, що IgD-зв'язування порівнянне з подібною взаємодією з поверхнево зв'язаним IgD на клітинному рівні, феноменом, який пояснює сильні мітогенні впливи Н. influenzae і М. catarrhalis на лімфоцити людини (7-9). Був виділений і клонований IgD-зв'язувальний білок зовнішньої мембрани Н. influenzae (білок D), і було показано, що він є важливим патогенетичним фактором (1-5). Однак, білок D не зв'язується повсюдно з всіма IgDмієломами (10). Короткий виклад суті винаходу Беручи до уваги той факт, що було виявлено, що Н. influenzae є провідною причиною інфекцій верхніх і нижніх дихальних шляхів, в даний час існує необхідність розробити вакцини, які можна використовувати проти Н. influenzae. Таким чином, задачею даного винаходу було з'ясувати, яким чином Н. influenzae взаємодіє з клітинами в організмі і взаємодіє з імунною системою, і отримати новий тип вакцини. Відповідно до одного аспекту, даний винахід стосується поверхневого білка, який можна виявити у Haemophilus influenzae, з амінокислотною послідовністю, що відповідає послідовності SEQ ID NO: 1, або його фрагмента, гомолога, функціонального еквівалента, похідного, виродженого варіанта або продукту гідроксилювання, сульфонування або глікозилювання або іншого продукту вторинного процесингу. Відповідно до іншого аспекту даний винахід стосується імуногенного фрагмента вказаного поверхневого білка, цей фрагмент може бути виявлений у Haemophilus influenzae, або його природних або штучно модифікованих варіантів. Відповідно до додаткового аспекту даний винахід стосується рекомбінантного імуногенного білка, на основі згаданого вище поверхневого білка, в якому амінокислоти в положенні з 1 по 21 послідовності SEQ ID NO: 1 були видалені або замінені однією або декількома амінокислотами. В одному варіанті здійснення амінокислоти в положенні з 1 по 21 послідовності SEQ ID NO: 1 були замінені послідовністю від 0 до 21 необов'язкових амінокислот. В іншому варіанті здійснення рекомбінантний імуногенний білок має амінокислотну послідовність, що відповідає послідовності SEQ ID NO: 2, або його фрагмент, гомолог, функціональний еквівалент, похідне, вироджений варіант або продукт гідроксилювання, сульфонування або глікозилювання або інший продукт вторинного процесингу. Відповідно до додаткового аспекту даний винахід стосується білка, що має амінокислотну послідовність, що відповідає послідовності SEQ ID NO: 3, або його фрагмента, гомолога, функціонального еквівалента, похідного, виродженого варіанта або продукту гідроксилювання, сульфонування або глікозилювання або іншого продукту вторинного процесингу. Відповідно до іншого додаткового аспекту даний винахід стосується пептиду, що має амінокислотну послідовність, що відповідає послідовності SEQ ID NO: 4, або його фрагмента, гомолога, фун 5 92782 6 кціонального еквівалента, похідного, виродженого Відповідно до одного аспекту, даний винахід варіанта або продукту гідроксилювання, сульфостосується лікарського засобу, що містить, щонування або глікозилювання або іншого продукту найменше один білок, фрагмент або пептид, опивторинного процесингу. саний вище, і один або декілька фармацевтично Відповідно до ще одного додаткового аспекту прийнятних ад'ювантів, наповнювачів, ексципієнданий винахід стосується пептиду, що має амінотів, зв'язувальних, носіїв, консервантів, буферних кислотну послідовність, що відповідає послідовноагентів, емульгаторів, зволожувачів або сполук, сті SEQ ID NO: 5, або його фрагмента, гомолога, що полегшують трансфекцію. функціонального еквівалента, похідного, вироджеВідповідно до іншого аспекту даний винахід ного варіанта або продукту гідроксилювання, сустосується композиції вакцини, що містить щонайльфонування або глікозилювання або іншого променше один білок, фрагмент або пептид, описаний дукту вторинного процесингу. вище. В одному варіанті здійснення, вказана комВідповідно до додаткового аспекту даний випозиція вакцини містить щонайменше ди-, три- або нахід стосується пептиду, що має амінокислотну мультимер вказаного білка, фрагмента або пептипослідовність, що відповідає послідовності SEQ ID ду. В іншому варіанті здійснення композиція вакNO: 6, або його фрагмента, гомолога, функціонацини додатково містить один або декілька фармального еквівалента, похідного, виродженого варіацевтично прийнятних ад'ювантів, наповнювачів, нта або продукту гідроксилювання, сульфонування ексципієнтів, зв'язувальних, носіїв, консервантів, або глікозилювання або іншого продукту вториннобуферних агентів, емульгаторів, зволожувачів або го процесингу. сполук, що полегшують трансфекцію. Ще в одному Відповідно до іншого додаткового аспекту даваріанті здійснення вказана композиція вакцини ний винахід стосується пептиду, що має амінокисмістить щонайменше одну додаткову вакцину, а лотну послідовність, що відповідає послідовності ще в одному варіанті здійснення композиція вакSEQ ID NO: 7, або його фрагмента, гомолога, фунцини містить імуногенну частину іншої молекули, кціонального еквівалента, похідного, виродженого де ця імуногенна частина іншої молекули може варіанта або продукту гідроксилювання, сульфобути вибрана з групи, що включає білок D Н. нування або глікозилювання або іншого продукту influenzae (ЕР 594 610), MID Moraxella catarrhalis вторинного процесингу. (WO 03/004651, WO 97/41731 і WO96/34960), Відповідно до ще одного додаткового аспекту UspA1 або UspA2 Moraxella catarrhalis даний винахід стосується білка, що має амінокис(WO93/03761), і білок зовнішньої мембрани або лотну послідовність, що відповідає послідовності вуглеводну капсулу будь-якого патогену респіраSEQ ID NO: 8, або його фрагмента, гомолога, фунторного тракту, або ДНК олігонуклеотиди, такі як кціонального еквівалента, похідного, виродженого мотив CpG. варіанта або продукту гідроксилювання, сульфоВ одному аспекті даний винахід стосується понування або глікозилювання або іншого продукту слідовності нуклеїнової кислоти, що кодує білок, вторинного процесингу. фрагмент або пептид, описаний вище, а також її Відповідно до додаткового аспекту даний вигомологів, поліморфізму, вироджених варіантів і нахід стосується пептиду, що має амінокислотну варіантів сплайсингу. В одному варіанті здійсненпослідовність, що відповідає послідовності SEQ ID ня, вказана послідовність нуклеїнової кислоти злиNO: 9, або його фрагмента, гомолога, функціоната щонайменше з іншим геном. льного еквівалента, похідного, виродженого варіаВ іншому аспекті даний винахід стосується нта або продукту гідроксилювання, сульфонування плазміди або фага, що містить послідовність нукабо глікозилювання або іншого продукту вториннолеїнової кислоти, описану вище. го процесингу. Ще в одному варіанті здійснення даний винаВідповідно до іншого аспекту даний винахід хід стосується хазяїна, що не є людиною, що місстосується пептиду, що має амінокислотну послітить щонайменше одну плазміду, описану вище, і довність, що відповідає послідовності SEQ ID NO: здатного продукувати білок, фрагмент або пептид, 10, або його фрагмента, гомолога, функціональноописаний вище, а також їх гомологи, поліморфізм, го еквівалента, похідного, виродженого варіанта вироджені варіанти і варіанти сплайсингу, цей хаабо продукту гідроксилювання, сульфонування зяїн вибраний серед бактерій, дріжджів і рослин. В або глікозилювання або іншого продукту вторинноодному варіанті здійснення вказаним хазяїном є Е. го процесингу. coli. Відповідно до іншого аспекту даний винахід Ще в одному аспекті даний винахід стосується стосується застосування щонайменше одного білзлитого білка або поліпептиду, де білок, фрагмент ка, фрагмента або пептиду, описаного вище, для або пептид, описаний вище, об'єднаний щонаймевиробництва лікарського засобу для профілактики нше з іншим білком, шляхом використання рекомабо лікування інфекції. В одному варіанті здійсбінантної послідовності нуклеїнової кислоти, опинення ця інфекція викликана Haemophilus саної вище. В одному варіанті здійснення вказаний influenzae, а в іншому аспекті Haemophilus злитий білок являє собою ди-, три- або мультимер influenzae є інкапсульованою або атиповою. Ще в білка, фрагмента або пептиду, описаного вище. одному варіанті здійснення вказане застосування В одному аспекті, даний винахід стосується служить для профілактики або лікування середпродукту злиття, в якому білок, фрагмент або пепнього отиту, синуситу або інфекцій нижніх дихальтид, описаний вище, ковалентно, або за допомоних шляхів у дітей, а також у дорослих, наприклад, гою будь-якого іншого способу, зв'язаний з білком, з хронічною обструктивною хворобою легень вуглеводом або матрицею. (ХОХЛ). 7 92782 8 Ще в одному аспекті даний винахід стосується льшим інкубуванням з кон'югованими з пероксидаспособу виділення білка, фрагмента або пептиду, зою хрону козячими поліклональними антитілами описаного вище, вказаний спосіб включає стадії: до IgD людини. Зразки кип'ятили в присутності 2a) вирощування Haemophilus influenzae або Е. меркаптоетанолу протягом 10 хвилин до завантаcoli, що містить ДНК, що кодує вказаний білок, ження. фрагмент або пептид, збирання бактерій і видіФіг. 2. Профілі проточної цитометрії рЕлення зовнішніх мембран або тілець включення; експресуючої Е. coli в порівнянні з Н. influenzae b) розчинення тілець включення сильним роз3655 дикого типу і мутанта з дефіцитом рЕ. Е. coli, чинником; що містить пустий вектор pUC18 (А) порівнюють з c) додавання ренатуруючого агента; і бактерією, трансформованою pUC18, що містить d) діалізу отриманої внаслідок суспензії проти геномну ДНК з H. influenzae 772 (гени з НІ0175 по буфера рН від 8 до 10. НІ0178) (В). Показана експресія рЕ у атипової Н. В одному варіанті здійснення вказаного спосоinfluenzae 3655 дикого типу (С) і у відповідного бу сильний розчинник являє собою гуанідину гідмутанта (D). Е. coli штам JM83 і Н. influenzae вирохлорид, а в іншому варіанті здійснення ренатурощували в рідких культурах протягом ночі. Е. coli руючим агентом є аргінін. інкубували з lgD( ) мієломи людини на льоду. ЧеВ іншому аспекті даний винахід стосується лірез 1 годину і після промивання, додавали кон'юкарського засобу або композиції вакцини, описаної говані з FITC кролячі pAb до IgD людини протягом вище, що містить вказаний злитий білок або полідодаткових 30 хвилин з подальшими стадіями пептид, або вказаний продукт злиття. промивання і подальшим аналізом з допомогою В одному аспекті даний винахід стосується проточної цитометрії. Ті ж самі операції проводили способу профілактики або лікування інфекції у з Н. influenzae 3655 або похідним мутантом рЕ, індивідуума, що передбачає введення фармацеввикористовуючи специфічні кролячі поліклональні тично ефективної кількості лікарського засобу або антитіла до рЕ і кон'юговані з FITC козячі антикрокомпозиції вакцини, описаної вище. В одному валячі pAb. ріанті здійснення вказана інфекція викликається Фіг. 3. Експресія рЕ Н. influenzae і споріднених Haemophilus influenzae, як інкапсульованою, так і видів, виявлена за даними проточної цитометрії і з атиповою, а в іншому варіанті здійснення інфеквикористанням IgD( ) мієломної сироватки. Було ційне захворювання вибране з групи, що складапроаналізовано двадцять два штами NTHi і 27 ється з середнього отиту, синуситу або інфекцій штамів гемофільних видів або споріднені бактерії. нижніх дихальних шляхів. Бактерії вирощували до стаціонарної фази і інкуДаний винахід стосується поліпептидів білка Ε бували з IgD( ) мієломи людини на льоду. Через 1 і полінуклеотидів білка Е, рекомбінантного матерігодину і після промивань, додавали кон'юговані з алу і способів їх отримання. В іншому аспекті виFITC кролячі поліклональні антитіла до IgD людинахід стосується способів використання таких пони (pAb) додатково на 30 хв. з подальшими стаділіпептидів і полінуклеотидів, включаючи серед ями промивання і подальшим аналізом з допомоіншого, профілактику і лікування мікробних захвогою проточної цитометрії. рювань. У додатковому аспекті винахід стосується Фіг. 4. рЕ експресується у NTHi і інкапсульовадіагностичних аналізів для виявлення захворюних Н. influenzae по даним Вестерн-блотів. Бактевань, пов'язаних з мікробними інфекціями, і станів, рійні білки вказаних штамів отримували, викориспов'язаних з такими інфекціями, наприклад, аналітовуючи Empigen , і наносили на SDS-гель з зи для виявлення експресії або активності полінуподальшим проведенням Вестерн-блотингу, зонклеотидів білка Ε або поліпептидів. дованого lgD( ) мієломи людини і козячими полікРізні зміни і модифікації суті і об'єму описаного лональними pAb до IgD людини, кон'югованими з винаходу будуть очевидні фахівцям в даній галузі пероксидазою хрону як детектуючими антитілами. з наступних описів і з інших частин даного виклаФіг. 5. Рекомбінантний рЕ22-160, заснований ду. на послідовності NTHi 772 в порівнянні з нативним Опис фігур рЕ Н. influenzae MinnA. На А показана амінокінцеФіг. 1. Білок Ε 16,3 кДа Haemophilus influenzae ва послідовність рЕ-похідного фрагмента А в порівиявляють за допомогою мієломного білка IgD( ). внянні з передбачуваною амінокислотною посліНа А показаний аналіз експресії рЕ з допомогою довністю нативного білка рЕ. На В показана проточної цитометрії у Н. influenzae 772. Показані схематична ілюстрація рЕ(А) з гістидиновою мітSDS-PAGE і Вестерн-блот (В) і 2-мірний SDSкою. На С показаний розмір і чистота на PAGE, поліакриламідний гель-електрофорез (С) білків забарвленому Кумасі. На D і Е, екстракт білка зовзовнішньої мембрани Н. influenzae MinnA, обробнішньої мембрани (ОМР) Н. influenzae MinnA порілених Empigen . Показані екстракти білка зовнішвнюють з рЕ(А), отриманим рекомбінантним шляньої мембрани до (В) і після розділення на Qхом, на гелі, забарвленому Кумасі, і Вестерн-блоті, Сефарозі (С). Стрілка на панелі С вказує очікувану відповідно. На А, сигнальна пептидна послідовлокалізацію рЕ на основі даних Вестерн-блотингу ність була видалена, крім амінокислотного залиш(використовуючи IgD( ) як зонд) відповідного гелю. ку глутаміну 21. Дев'ять амінокислот отримували На А, бактерії навантажували мієломним білком на основі вектора експресії рЕТ26(+), як указано. IgD( ) з подальшою інкубацією з кролячими FITCЧисла представляють положення амінокислот, кон'югованими анти-IgD рАb і аналізом з допомопочинаючи з початку трансляції рЕ. Рекомбінантгою проточної цитометрії. На В показані SDS-гель, ний рЕ(А) отримували в Е. coli, очищали і піддавазабарвлений Кумасі блакитним (пляма), і Вестернли руйнуванню по Едману для аналізу сайту розблот, зондований IgD( ) мієломи людини з подащеплення сигнальної пептидази. На D і Е, два гелі 9 92782 10 проганяли одночасно, один забарвлювали Кумасі логія, що використовується тут і термінологія придіамантовим блакитним, а інший блотували на значена для опису, а не для обмеження. У даній заявці описується клонування і ексІмобілон-Р мембрани, зондовані білком lgD( ) мієпресія нового білка зовнішньої мембрани Н. ломи людини з подальшим інкубуванням з відповіinfluenzae, позначеного білком Ε (pΕ). Цей білок дними вторинними антитілами, кон'югованими з пероксидазою хрону. Фракцію ОМР очищали, вибув відкритий з використанням IgD( ) сироватки мієломи людини зі специфічною афінністю у відкористовуючи Empigen , як описано в розділі "Маношенні рЕ. теріали і методи". Для максимального збільшення виходу рекомФіг. 6. Білок Ε є надзвичайно консервативним. бінантного рЕ, був отриманий зрізаний фрагмент Показана частота точкових мутацій в 13-31 штарЕ, що складається з амінокислотних залишків з мах Haemophilus influenzae (Таблиця 2), включаюлізину 22 до лізину 160. N-кінцевий сигнальний чи як інкапсульовані, так і атипові ізоляти. Резульпептид, що містить амінокислоту глутамін 21, був, тати були отримані секвенуванням, з таким чином, видалений і замінений лідерним пепвикористанням фланкуючих праймерів. Всі послітидом в доповнення до дев'яти залишків, що подовності порівнювали з послідовністю рЕ Н. ходять з вектора рЕТ26(+). Зрізаний рЕ (тобто, influenzae Rd, яку використовували як еталонну рЕ22-160) позначили рЕ(А). послідовність, і представили тут. Даний винахід включає білок зовнішньої мемФіг. 7. Профіль гідрофобності рЕ. Вказані гідбрани Haemophilus рЕ і рЕ-похідні пептиди рЕ22рофобні і гідрофільні частини індивідуальних амі60, рЕ22-95, рЕ22-125, рЕ41-68, рЕ56-125, рЕ56нокислотних залишків. Також відмічений передба160, рЕ86-160, рЕ115-160, і їх ди, три- або олігочуваний сигнальний пептид. Дані були отримані з мери. Зокрема, послідовностям рЕ або похідних використанням стандартного способу, як описано пептидів, які є поверхневими, надається більш (21). важливе першорядне значення. Фіг. 8. SDS-PAGE, що демонструє рекомбінанТаким чином, композиції вакцини за даним витний рЕ22-160 (фрагмент А), і серії зрізаних фрагнаходом містять як імуногенні компоненти поверхментів, позначені з В по Н. На А показана схема невий білок, який може бути виявлений у всіх різних фрагментів, а на В показаний SDS-PAGE. Haemophilus influenzae, імуногенний фрагмент ДНК, що кодує різні білки, лігували у вектор ексвказаного поверхневого білка, рекомбінантний пресії рЕТ26(+) і рекомбінантно експресували в Е. імуногенний білок на основі вказаного поверхневоcoli. Отримані в результаті гіперекспресовані білки го білка, рекомбінантний імуногенний білок, що очищали на нікелевих смолах і розділяли на SDSмає амінокислотну послідовність відповідно до PAGE з подальшим фарбуванням Кумасі діаманпослідовності SEQ ID NO: 2, і/або пептид, що має товим блакитним. амінокислотну послідовність у відповідності з SEQ Фіг. 9. Мутантний штам, дефіцитний по рЕ ID NO: 3-10, або їх фрагмент, гомолог, функціона(NTHi 3655) має в 100-1000 разів меншу здатність льний еквівалент, похідне, вироджений варіант викликати гострий середній отит у щурів. Інфікуабо продукт гідроксилювання, сульфонування або вання викликали у самців щурів Sprague-Dawley глікозилювання або інший продукт вторинного вентральним серединним розрізом на шиї, з подапроцесингу. Композиції вакцини також можуть місльшим введенням в порожнину середнього вуха тити злитий білок або поліпептид, або продукт вказаного числа бактерій в 0,05 мл. Дані показані з злиття відповідно до даного винаходу як імуноген3 дня зараження і є репрезентативними по 5 твані компоненти. Імуногенні компоненти здатні виринах в кожній групі. кликати антитільну або іншу імунну відповідь на Фіг. 10. Середні концентрації антитіл IgG і IgA, Haemophilus influenzae, при якій утворені антитіла направлених проти рЕ, в сироватках різних вікових інгібують патогенну дію бактерій Haemophilus груп. Анти-рЕ антитіла аналізували з допомогою influenzae на клітини індивіда. «Імуногенна доза» сендвич ELISA, використовуючи рекомбінантний композиції вакцини відповідно до винаходу являє рЕ(А). Чистота рЕ(А) була, як показано на Фіг. 5. собою дозу, яка індукує після введення детектоваФіг. 11. рЕ є надзвичайно консервативним в ну гуморальну і/або клітинну імунну відповідь в межах різних гемофільних штамів. Ген ре був секпорівнянні зі стандартною імунною відповіддю до венований у Н. influenzae інкапсульованого типу a введення. (n=2), b (n=2), с (n=2), d (n=1), e (n=2) і f (n=3), NTHi Послідовності нуклеїнових кислот, вакцини, (n=8), H. influenzae біовар aegypticus (n=6) і Η. що використовуються в композиції за даним винаaegypticus (n=5), використовуючи фланкуючі ходом, для отримання антигенів можуть бути праймери. Rd означає Н. influenzae штам Rd вставлені в будь-якому з широкої різноманітності (Нi0178), а 772 NTHi штам 772. Числа з 65 по 577 векторів експресії за допомогою цілого ряду сповідповідають штамам, відміченим в Таблиці 1. собів. Вважається, що такі способи відомі фахівОпис винаходу цям в даній галузі. Перед докладним поясненням даного винахоКомпозиції вакцини легко отримати, викорисду важливо зрозуміти, що винахід не обмежений товуючи відомі способи і методики, і їх можна ввоцією заявкою подробицями описаних тут варіантів дити різними шляхами, переважно парентерально здійснення і стадій. Наведені приклади ілюструють або інтраназально. Склади, що підходять для павинахід, а не обмежують його яким-небудь чином. рентерального або інтраназального введення Винахід може мати інші варіанти здійснення, і його включають водні або неводні стерильні ін'єкційні можна здійснити на практиці і виконати різними розчини, які можуть містити антиоксиданти, буфеспособами. Повинно бути зрозуміло, що фразеори, бактеріостатики і розчини, які надають складу 11 92782 12 ізотонічності з фізіологічною рідиною конкретного Е», а також їх біологічно, діагностично, профілакпацієнта; і водні і неводні стерильні суспензії, які тично, клінічно або терапевтично придатних варіаможуть включають суспендуючі агенти або загуснтів, і композицій, що містять вищезазначене. ники. Активний імуногенний інгредієнт часто зміДаний винахід додатково стосується: шують з ексципієнтами, які є фармацевтично при(a) виділеного поліпептиду, який містить амійнятними, наприклад, водою, фізіологічним нокислотну послідовність, що має щонайменше розчином, декстрозою, гліцерином, етанолом або 85% ідентичність, переважно, щонайменше 90% подібними. Крім того, композиція вакцини також ідентичність, більш переважно щонайменше 95% може містити незначні кількості допоміжних речоідентичність, найбільш переважно щонайменше вин, таких як зволожувачі або емульгатори, рН 97-99% або повну ідентичність будь-якої послідовбуферні агенти, зв'язувальні, носії або консерванності SEQ ID NO: 1-10; ти. (b) поліпептиду, що кодується виділеним поліКомпозиції вакцини також можуть включати нуклеотидом, що містить полінуклеотидну посліад'юванти для посилення імуногенності композиції, довність, що має щонайменше 85% ідентичність, такі як ад'юванти Фрейнда або інші системи, відомі переважно щонайменше 90% ідентичність, більш в даній галузі. Імуногенні компоненти композицій переважно щонайменше 95% ідентичність, ще вакцини, тобто білки, фрагменти, пептиди, злиті більш переважно щонайменше 97-99% або повну білки або поліпептиди, або продукти злиття відпоідентичність будь-якої послідовності SEQ ID NO: відно до даного винаходу, можуть бути складені у 11 протягом повної довжини вибраної послідовновакцину у вигляді нейтральних або сольових сті SEQ ID NO: 0; або форм. (с) поліпептиду, що кодується виділеним поліДозування композицій вакцини буде залежати нуклеотидом, що містить полінуклеотидну послівід специфічної активності вакцини, і її легко видовність, що кодує поліпептид, що має щонаймезначити за допомогою загальноприйнятих експенше 85% ідентичність, переважно щонайменше риментів. Композиції вакцини вводять в такій кіль90% ідентичність, більш переважно щонайменше кості, яка буде терапевтично ефективною і 95% ідентичність, ще більш переважно щонаймеімуногенною, і кількість залежить від індивіда. нше 97-99% або повну ідентичність, амінокислотВинахід стосується поліпептидів білка Ε і поліної послідовності будь-якої з послідовностей SEQ нуклеотидів, більш детально описаних нижче. ЗокIDNO: 1-10. рема, винахід стосується поліпептидів і полінуклеПоліпептиди білка Е, представлені в SEQ ID отидів білка Ε атипової Н. influenzae. Поліпептиди NO: 1-10, являють собою поліпептиди білка Ε з білка Ε мають сигнальну послідовність і представатипових штамів H. influenzae. Додаткові послідолені на поверхні бактерії. Сигнальний пептид розвності білка Ε були виявлені з штамів H. influenzae, ташований від залишку 1 до залишку 20 поліпепперерахованих в Таблиці 1. тиду білка Е. Винахід також стосується імуногенного фрагУ даному винаході посилання на «білок Е» є мента поліпептиду білка Е, тобто, суміжної частипосиланням на будь-який з пептидів, імуногенних ни поліпептиду білка Е, який має таку ж або по суті фрагментів, злиття, поліпептидів або білків за витаку ж імуногенну активність, що і поліпептид, що находом, таких, що розглядаються тут (як SEQ ID містить відповідну амінокислотну послідовність, NO: 1 з сигнальною послідовністю, або без неї). вибрану з SEQ ID NO: 1-10; іншими словами, цей «Полінуклеотид, що кодує білок Е» стосується фрагмент (при необхідності коли сполучений з будь-якої полінуклеотидної послідовності, що коносієм) здатний індукувати імунну відповідь, яка дує будь-який з пептидів імуногенних фрагментів, розпізнає поліпептид білка Е. Альтернативно, або злиття, поліпептидів або білків за винаходом, що додатково, імуногенний фрагмент може зберігати розглядаються тут. IgD зв'язувальну функцію повнорозмірного білка Термін «що містить» в контексті даного вина(як описано в розділі Приклади, наприклад, здатходу альтернативно може бути замінений терміність зв'язувати IgD( ) від The Binding Site ном «що складається з». (Birmingham, England). Такий імуногенний фрагВинахід головним чином стосується полінукмент може включати, наприклад, поліпептид білка леотидів білка Ε або перерахованих поліпептидів, Е, позбавлений N-кінцевої лідерної послідовності що тут кодуються. і/або трансмембранного домену і/або С-кінцевого Зрозуміло, що послідовності, викладені в наякірного домену. В переважному аспекті імуногенведеному нижче списку послідовностей як «ДНК», ний фрагмент білка Е, відповідно до винаходу міспредставляють ілюстрацію одного варіанту здійстить по суті позаклітинні домени поліпептиду, який нення винаходу, оскільки фахівцям буде зрозумімає щонайменше 85% ідентичність, переважно ло, що такі послідовності можуть бути успішно вищонайменше 90% ідентичність, більш переважно користані по суті, включаючи рибополінуклеотиди. щонайменше 95% ідентичність, найбільш переваПослідовності полінуклеотидів білка Ε преджно щонайменше 97-99% ідентичність послідовноставлені в SEQ ID NO: 11 (з ntHi штам 772). Послісті, вибраної з SEQ ID NO: 1-10, по всій довжині довності поліпептидів білка Е, що кодуються, вказаної послідовності. представлені в SEQ ID NO: 1 (з ntHi штаму 772), 2, Фрагмент являє собою поліпептид, що має 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10. амінокислотну послідовність, яка є повністю анаПоліпептіди логічною як частина, а не як ціле, будь-якій аміноВ одному аспекті винахід стосується поліпепкислотній послідовності будь-якого поліпептиду за тидів Н. influenzae (зокрема атипової Н. influenzae), винаходом. Як і у разі поліпептидів білка Е, фрагщо називаються тут «білок Е» і «поліпептиди білка менти можуть бути «самостійними» або укладені в 13 92782 14 більш великий поліпептид, частину або область поліпептид за даним винаходом, або його фрагякого вони утворюють, найбільш переважно, у вимент, і різні частини константних областей важких гляді окремої безперервної ділянки в окремому або легких ланцюгів імуноглобулінів різних підклабільш великому поліпептиді, фрагмент може бути сів (IgG, IgM, IgA, IgE). Переважною як імуноглобукоротшим за нативну послідовність повної довжилін є константна область важкого ланцюга IgG ни, або, у разі висновку в більш великому поліпеплюдини, зокрема lgG1, в якій злиття має місце в тиді, може являти собою повнорозмірну нативну шарнірній області. У конкретному варіанті здійспослідовність або більш довгий злитий білок. нення, Fc-частина може бути просто видалена Переважні фрагменти включають, наприклад, шляхом включення послідовності, що розщеплюзрізані поліпептиди, що мають частину амінокисється, яка може розщеплюватися фактором зсілотної послідовності, вибраної з SEQ ID NO: 1-10, дання крові Ха. або їх варіанти, такі як безперервні серії залишків, Більш того, цей винахід стосується способів які містять аміно- і/або карбоксикінцеву амінокисотримання таких злитих білків за допомогою генної лотну послідовність. Переважними також є розщеінженерії, і до їх застосування для скринінгу лікарплення форми поліпептидів по винаходу, що проських засобів, діагностики і лікування. Додатковий дукуються клітиною-хазяїном або в клітині-хазяїні. аспект винаходу також стосується полінуклеотиКрім того, переважними є фрагменти, що характедів, що кодують такі злиті білки. Приклади техноризуються структурними або функціональними логії отримання злитих білків можна знайти в міжвластивостями, наприклад, фрагменти, які містять народних патентних заявках №№ WO94/29458 і альфа-спіраль і області, що утворюють альфаWO94/22914. спіраль, бета-складку і області, що утворюють беБілки можуть бути кон'юговані хімічно або екста-складку, вигин і області, що утворюють вигин, пресовані у вигляді рекомбінантних злитих білків, гідрофільні області, гідрофобні області, альфадаючи можливість отримувати підвищені рівні в амфіпатичні області, бета-амфіпатичні області, експресійній системі в порівнянні з незлитим білшарнірні області, області, що формують поверхню, ком. Партнер злиття може сприяти забезпеченню ділянки зв'язування з субстратом і області з висоепітопів Т-хелперів (імунологічний партнер злитким антигенним індексом. тя), переважно епітопів Т-хелперів, розпізнаваних Крім того, переважні фрагменти включають людьми, або сприяти експресії білка (енхарсер виділений поліпептид, що містить амінокислотну експресії) з більш високими виходами, ніж нативпослідовність, що має щонайменше 15, 20, 30, 40, ний рекомбінантний білок. Переважно партнер 50 або 100 суміжних амінокислот з амінокислотної злиття буде як імунологічним партнером злиття, послідовності, вибраної з SEQ ID NO: 1-10, або так і партнером, що посилює експресію. виділений поліпептид, що містить амінокислотну Злиті білки включають білок D з Haemophilus послідовність, що має щонайменше 15, 20, 30, 40, influenzae (ЕР 594610) і неструктурний білок вірусу 50 або 100 суміжних амінокислот, відсічених або грипу, NS1 (гемаглютинін). Іншим партнером злитвидалених з амінокислотної послідовності, вибратя є білок, відомий як Omp26 (WO 97/01638). Інший ної з SEQ ID NO: 1-10. партнер злиття являє собою білок, відомий як Крім того, інші переважні фрагменти являють LytA. Переважно використовують С-кінцеву частисобою фрагменти, що містять В-клітинний епітоп, ну молекули. LytA отримують з Streptococcus наприклад, ті фрагменти/пептиди, які описані в pneumoniae, який синтезує N-ацетил-LПридатних епітопах. аланінамідазу, амідазу LytA, (кодується геном lytA Фрагменти поліпептидів по винаходу можуть {Gene, 43 (1986) сторінки 265-272}) аутолізин, який бути використані для отримання відповідного повспецифічно руйнує певні зв'язки в кістяку пептидонорозмірного поліпептиду з допомогою пептидного гліканів. С-кінцевий домен білка LytA відповідає за синтезу; отже, ці фрагменти можуть бути викорисафінність у відношенні холіну або деяких аналогів тані як проміжні сполуки для отримання повнорозхоліну, таких як DEAE. Ця властивість була викомірних поліпептидів по винаходу. ристана для розробки експресуючих плазмід Е.coli Особливо переважними є варіанти, в яких деC-LytA, придатних для експресії злитих білків. Букілька, 5-10, 1-5, 1-3, 1-2 або 1 амінокислота заміло описане очищення гібридних білків, що містять нені, видалені або додані в будь-якому поєднанні. фрагмент C-LytA на їх амінокінцях {Biotechnology: Поліпептиди або імуногенні фрагменти по ви10, (1992) сторінки 795-798}. Можливо використати находу можуть бути в формі «зрілого» білка або повторювану частину молекули LytA, знайдену на можуть бути частиною більш великого білка, такоС-кінці, починаючи із залишку 178, наприклад, заго як попередник або злитий білок. Часто перевалишки 188-305. жно включати додаткову амінокислотну послідовДаний винахід також включає варіанти згаданість, що містить секреторні або лідерні них вище поліпептидів, тобто поліпептидів, які відпослідовності, про-послідовності, послідовності, різняються від еталонних поліпептидів консерваякі допомагають очищенню, такі як численні залитивними амінокислотними замінами, при яких шки гістидину, або додаткова послідовність для залишок замінюється іншим залишком з аналогічстабільності при отриманні рекомбінантним шляними властивостями. Такі характерні заміни знахом. Більш того, також розглядається додавання ходяться серед Ala, Val, Leu і IIе; серед Ser і Thr; екзогенного поліпептиду або ліпідного хвоста, або серед кислих залишків Asp і Glu; серед Asn і Gln; і полінуклеотидних послідовностей для підвищення серед основних залишків Lys і Arg; або ароматичні імуногенного потенціалу кінцевої молекули. залишки Phe і Туr. В одному аспекті винахід стосується генноПоліпептиди за даним винаходом можуть бути інженерних розчинних злитих білків, що містять отримані будь-яким відповідним способом. Такі 15 92782 16 поліпептиди включають виділені природні поліпеппереважно 17-мер або довше, отриманим з неповтиди, поліпептиди, отримані рекомбінантним шляної послідовності. Клони, що несуть ДНК, ідентичхом, поліпептиди, отримані синтетично, або поліну до ДНК зонду, потім можуть бути виділені з допептиди, отримані за допомогою комбінації цих помогою гібридизації в суворих умовах. Шляхом способів. Засоби для отримання таких поліпептисеквенування індивідуальні клони, таким чином, дів широко поширені в рівні техніки. ідентифікують гібридизацією з праймерами для Найбільш переважно, щоб поліпептид за висеквенування, сконструйованими з вихідної полінаходом був отриманий з атипової Н. influenzae, пептидної або полінуклеотидної послідовності, однак, переважно він може бути отриманий з інпотім можливо продовжити полінуклеотидну посших організмів того ж таксономічного роду. Полілідовність в обох напрямах для визначення посліпептид за винаходом також може бути отриманий, довності всього гена. Таке секвенування зручно наприклад, з організмів того ж таксономічного сіпроводити, наприклад, використовуючи денатуромейства або порядку. вану двоспіральну ДНК, отриману з плазмідного Полінуклеотиди клону. Відповідні методики описані у Maniatis, Т., Об'єктом винаходу є полінуклеотиди, які кодуFritsch, E.F. і Sambrook et al., MOLECULAR ють поліпептиди білка Е, зокрема, полінуклеотиди, CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed.; які кодують поліпептиди, позначені тут білком Е. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring В особливо переважному варіанті здійснення Harbor, New York (1989). (зокрема, див. розділи винаходу полінуклеотиди містять область, що коScreening By Hybridization 1.90 and Sequencing дує поліпептиди білка Е, що містить послідовності, Denatured Double-Stranded DNA Templates 13.70). представлені в SEQ ID NO: 11, яка включає повТакож можна провести прямий сиквенс геномної норозмірний ген або його варіант. ДНК для отримання повної довжини послідовності Полінуклеотиди білка Ε, наведені в SEQ ID гена. Полінуклеотиди, що ілюструють цей винахід, NO: 11, являють собою полінуклеотиди білка Ε з представлені в SEQ ID NO: 11, були відкриті в бібатипової Н. influenzae штаму 772. Інші послідовноліотеці ДНК, отриманій з атипової Н. influenzae. сті були визначені у генів, що кодують білок Ε з Крім того, кожна послідовність ДНК, представштамів H. influenzae, перерахованих в Таблиці 1. лена в SEQ ID NO: 11, містить відкриту рамку зчиЯк додатковий аспект винаходу представлені тування, що кодує білок, що має приблизно ряд виділені молекули нуклеїнової кислоти, що кодуамінокислотних залишків, викладених в SEQ ID ють і/або експресують поліпептиди білка Е, і поліNO: 1, з встановленою молекулярною масою, яку нуклеотиди, головним чином, поліпептиди і полінуможна обчислити, використовуючи значення маси клеотиди білка Ε атипової H. influenzae, в тому амінокислотних залишків, добре відомі фахівцям в числі, наприклад, непроцесовані РНК, рибозимні даній галузі. РНК, мРНК, кДНК, геномні ДНК, В- і Z-ДНК. ДодатПолінуклеотиди SEQ ID NO: 0, між стартовим кові варіанти здійснення винаходу включають біокодоном і стоп-кодоном, кодують відповідно полілогічно, діагностично, профілактично, клінічно або пептид послідовності SEQ ID NO: 1. терапевтично придатні полінуклеотиди і поліпепУ додатковому аспекті, даний винахід стосутиди, і їх варіанти, і композиції, що містять їх. ється виділеного полінуклеотиду, що містить або Інший аспект даного винаходу стосується вищо складається з: ділених полінуклеотидів, в тому числі щонаймен(a) полінуклеотидної послідовності, яка щоше одного повнорозмірного гена, який кодує полінайменше має 85% ідентичність, переважно щопептид білка Е, що має розшифровану найменше 90% ідентичність, більш переважно амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 1-10 і щонайменше 95% ідентичність, ще більш переваполінуклеотидів, близькоспоріднених йому, і їх жно щонайменше 97-99% або повну ідентичність варіантів. будь-якій полінуклеотидній послідовності з SEQ ID В іншому особливо переважному варіанті здійNO: 11 по всій довжині полінуклеотидної послідовснення винахід стосується поліпептиду білка Ε з ності від SEQ ID NO: 0; або атипової Н. influenzae, що містить або що склада(b) полінуклеотидної послідовності, що кодує ється з SEQ ID NO: 1-10, або його варіанта. поліпептид, який має щонайменше 85% ідентичВикористовуючи представлену тут інформаність, переважно щонайменше 90% ідентичність, цію, таку як полінуклеотидні послідовності, предбільш переважно щонайменше 95% ідентичність, ставлені в SEQ ID NO: 11, полінуклеотид за винаще більш переважно щонайменше 97-99% або ходом, що кодує поліпептиди білка Е, може бути 100% повну ідентичність, будь-якій амінокислотній отриманий з використанням стандартних способів послідовності, вибраній з SEQ ID NO: 1-10 (або її клонування і скринінгу, наприклад, для клонування фрагменту), по всій довжині амінокислотної посліі секвенування фрагментів хромосомної ДНК з довності з SEQ ID NO: 1-10 (або її фрагмента). бактерій, використовуючи клітини атипової H. Полінуклеотид, що кодує поліпептид за даним influenzae штаму 3224А (або 772) як початковий винаходом, включаючи гомологи або ортологи матеріал, з подальшим отриманням повнорозмірвидів, що відрізняються від атипової Н. influenzae, ного клону. Наприклад, для отримання полінуклеможе бути отриманий способом, який включає отидної послідовності за винаходом, наприклад, стадії скринінгу відповідної бібліотеки в суворих полінуклеотидної послідовності, наведеної в SEQ умовах гібридизації (наприклад, використовуючи ID NO: 0, звичайно бібліотеку клонів хромосомної температуру в інтервалі 45-65°С і концентрацію ДНК атипової H. influenzae штаму 3224А (або 772) SDS від 0,1 до 1%) з міченим або детектованим в Е.coli або якомусь іншому відповідному хазяїні зондом, що складається з, або що містить, будьзондують радіоактивноміченим олігонуклеотидом, яку послідовність, вибрану з SEQ ID NO: 11, або її 17 92782 18 фрагмент; і виділення повнорозмірного гена і/або Винахід додатково стосується варіантів полїгеномних клонів, що містить вказану полінуклеонуклеотидів, описаних тут, які кодують варіанти тидну послідовність. поліпептиду, що має розшифровану амінокислотну Винахід стосується полінуклеотидної послідопослідовність будь-якої з послідовностей SEQ ID вності, ідентичної по всій її довжині кодуючій посNO: 1-10. Фрагменти полїнуклеотидів по винаходу лідовності (відкрита рамка зчитування), представможуть бути використані, наприклад, для синтезу леної в SEQ ID NO: 11. Крім того, винахід повної довжини полїнуклеотидів по винаходу. стосується кодуючої послідовності зрілого поліпеПереважними фрагментами є ті полінуклеотиптиду або його фрагмента, як такого, а також коди, які кодують В-клітинний епітоп, наприклад, дуючої послідовності зрілого поліпептиду або фрафрагменти/пептиди, описані в Придатних епітопах, гмента в рамці зчитування з іншою кодуючою і рекомбінантні химерні гени, що містять вказані послідовністю, такою як послідовність, що кодує полінуклеотидні фрагменти. лідерну або секреторну послідовність, пре-, або Додатковими особливо переважними варіанпро- або препро-білкову послідовність. Полінуклетами здійснення є полінуклеотиди, що кодують отид за винаходом також може містити щонаймеваріанти білка Е, які мають амінокислотну послінше одну некодуючу послідовність, в тому числі, довність поліпептиду білка Ε будь-якої з послідовнаприклад, щонайменше одну некодуючу 5'- і 3'ностей SEQ ID NO: 1-10, в яких декілька, небагато, послідовність, такі як транскрибовані, але нетран5-10, 1-5, 1-3, 2, 1 або жодного амінокислотного сльовані послідовності, сигнали термінації (такі як залишку замінено, модифіковано, видалено і/або rho-залежні і rho-незалежні сигнали термінації), додано, в будь-якій комбінації. Особливо перевасайти зв'язування з рибосомою, послідовності жними серед них є мовчазні заміни, додатки і деKozak, послідовності, які стабілізують мРНК, інтролеції, які не змінюють властивостей і активності ни і сигнали поліаденілювання, але не тільки. Пополіпептиду білка Ε (наприклад, властивості, опилінуклеотидна послідовність також може містити сані тут в експериментальній частині). додаткову кодуючу послідовність, що кодує додатДодатковими переважними варіантами здійскові амінокислоти. Наприклад, може бути закодонення винаходу є полінуклеотиди, які щонайменше вана маркерна послідовність, яка полегшує очина 85% ідентичні по всій довжині полінуклеотидам, щення злитого поліпептиду. У деяких варіантах що кодують поліпептиди білка Е, що мають аміноздійснення винаходу маркерна послідовність явкислотну послідовність, представлену в будь-якій з ляє собою гекса-гістидиновий пептид, що забезпепослідовностей SEQ ID NO: 1-10, і полінуклеотичується вектором pQE (Qiagen, Inc.) і описаний у дам, які комплементарні таким полінуклеотидам. Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Set, USA 86: 821-824 Альтернативно, найбільш переважними є полінук(1989), або пептидний таг НА (Wilson et al., Cell 37: леотиди, які містять область, яка щонайменше на 767 (1984), обидва з яких можуть бути придатні 90% ідентична по всій довжині полінуклеотидам, для очищення поліпептидної послідовності, злитої що кодують поліпептиди білка Е, і полінуклеотиз ними. Полінуклеотиди за винаходом також вклюдам, комплементарним ним. У цьому значенні, чають, але не тільки, полінуклеотиди, що містять особливо переважними є полінуклеотиди, які щоструктурний ген і послідовності, зв'язані з ним в найменше на 95% ідентичні повнорозмірній нуклеприроді, який контролює експресію гена. отидній послідовності. Крім того, полінуклеотиди, Нуклеотидна послідовність, що кодує поліпепякі щонайменше на 97% ідентичні повнорозмірній тид білка Ε послідовності SEQ ID NO: 1-10, може послідовності більш переважні, ніж полінуклеотиди бути ідентична відповідній полінуклеотидній кодуз щонайменше 95% ідентичністю, а найбільш пеючій послідовності SEQ ID NO: 11 (або що місреважні полінуклеотиди, які щонайменше на 98% і титься в межах SEQ ID NO: 11). Альтернативно це щонайменше на 99% ідентичні повнорозмірній може бути будь-яка послідовність, яка внаслідок послідовності, причому найбільш переважними є надмірності (виродженості) генетичного коду також послідовності, які щонайменше на 99% ідентичні кодує поліпептид послідовності SEQ ID NO: 1-10. повнорозмірній послідовності. Термін «полінуклеотид, що кодує поліпептид» Переважними варіантами здійснення є полінув контексті даної заявки охоплює полінуклеотиди, клеотиди, що кодують поліпептиди, які зберігають які включають послідовність, що кодує поліпептид по суті ту ж біологічну функцію або активність, що і по винаходу, зокрема бактерійний поліпептид, і зрілий поліпептид, що кодується послідовністю більш конкретно поліпептид білка Ε атипової H. ДНК, вибраною з SEQ ID NO: 11 (наприклад, та influenzae, що має амінокислотну послідовність, активність, яка описана тут в експериментальній представлену в будь-якій з послідовностей SEQ ID частині). NO: 1-10, або її фрагмент. Цей термін також охопВідповідно до деяких переважних варіантів лює полінулеотиди, які включають окрему безпездійснення, винахід стосується полінуклеотидів, рервну область або дискретні області, що кодують які гібридизуються, зокрема в суворих умовах, з цей поліпептид (наприклад, полінуклеотиди, переполінуклеотидними послідовностями білка Е, тарвані інтегрованим фагом, інтегрованою вставкокими як полінуклеотиди SEQ ID NO: 11. вою послідовністю, інтегрованою векторною посВинахід додатково стосується полінуклеотилідовністю, інтегрованою транспозонною дів, які гібридизуються з представленими тут поліпослідовністю, або внаслідок «редагування» РНК нуклеотидними послідовностями. У цьому значенні або реорганізації геномної ДНК) разом з додатковинахід стосується полінуклеотидів, які гібридизувими областями, які також можуть містити кодуючі ються в суворих умовах з описаними тут полінукі/або некодуючі послідовності. леотидами. У контексті даної заявки терміни «суворі умови» і «гібридизації в суворих умовах» 19 92782 20 означає гібридизацію, що відбувається тільки в Недавні модифікації цього методу, прикладом яких тому випадку, якщо існує щонайменше 95% і, пеє технологічний процес Marathon (Clontech реважно, щонайменше 97% ідентичність між посLaboratories Inc.), значно спростили пошук довголідовностями. Конкретним прикладом гібридизації мерних кДНК. У методі Marathon , кДНК отримув суворих умовах є інкубація протягом ночі при ють з мРНК, виділеної з вибраної тканини, і «адап42°С в розчині, що містить: 50% формаміду, 5 торну» послідовність лігують до кожного кінця. SSC (150 мМ NaCl, 15 мМ тринатрію цитрат), 50 Потім проводять ампліфікацію нуклеїнової кислоти мМ фосфату натрію (рН 7,6), 5 Розчину Денхард(ПЛР) для ампліфікування «пропущеного» 5'-кінця та, 10% сульфату декстрану і 20 мікрограм/мл деданої ДНК, з використанням комбінації геннатурованої, розщепленої ДНК сперми лосося з специфічних і адаптор-специфічних олігонуклеоподальшим промиванням гібридизаційної підкладтидних праймерів. Потім ПЛР-реакцію повторюють з використанням «гніздових» праймерів, тобто, ки в 0,1 SSC приблизно при 65°С. Умови гібридипраймерів, сконструйованих для відпалу всередині зації і промивання добре відомі і пояснені на прикампліфікованого продукту (звичайно, адапторладах у Sambrook, et al., Molecular Cloning: A специфічний праймер, який випалюється після 3' в Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring адапторній послідовності, і ген-специфічний прайHarbor, N.Y., (1989), зокрема в Частині 11. Розчин мер, який випалюється після 5' у вибраній послідля гібридизації також може бути використаний з довності гена). Потім аналіз продуктів цієї реакції полінуклеотидними послідовностями за даним можна провести з допомогою секвенування ДНК, і винаходом. повнорозмірна ДНК може бути сконструйована Винахід також стосується полінуклеотиду, що шляхом приєднання цього продукту безпосередскладається з або що містить полінуклеотидну ньо до існуючої ДНК для утворення повної посліпослідовність, отриману скринінгом відповідної довності, або проведення окремої ПЛР протяжних бібліотеки, що містить повний ген для полінуклеоділянок ДНК з використанням інформації про нову тидної послідовності, викладеної в будь-якій з поспослідовність для конструкції 5'-праймера. лідовностей SEQ ID NO: 11, в суворих умовах гібПолінуклеотиди і поліпептиди за винаходом ридизації із зондом, що має послідовність вказаної можуть бути використані, наприклад, як реактиви полінуклеотидної послідовності, викладеної у віддля досліджень і матеріалів для пошуку способів повідній послідовності SEQ ID NO: 11, або її фраглікування і діагностики захворювань, зокрема заменту; і виділення вказаної поліпептидної послідохворювання людей, як розглянуто далі в цій заявці вності. Фрагменти, що підходять для отримання відносно полінуклеотидних аналізів. такого полінуклеотиду, включають, наприклад, Полінуклеотиди за винаходом, які являють созонди і праймери, описані в цій заявці в інших місбою олігонуклеотиди, що походять з послідовності цях. SEQ ID NO: 11, можуть бути використані в описаПолінуклеотидні аналізи, що розглядаються в них тут способах, але, переважно для ПЛР, для інших місцях даного опису, відповідно до винаховизначення, чи транскрибуються ідентифіковані ду, наприклад, полінуклеотиди за винаходом, мотут полінуклеотиди повністю або частково в бактежуть бути використані як гібридизаційний зонд для рії в інфікованій тканині, чи ні. Зрозуміло, що такі РНК, кДНК і геномної ДНК для виділення повноропослідовності також будуть застосовні в діагностизмірних кДНК і геномних клонів, що кодують білок ці стадій інфекційного процесу і отриманні типу Е, і для виділення кДНК і геномних клонів інших інфекційного патогену. генів, які мають високу ідентичність, зокрема, виВинахід також стосується полінуклеотидів, які соку ідентичність послідовностей, з генами білка кодують поліпептид, який являє собою зрілий біЕ. Такі зонди, в основному, будуть містити щонайлок плюс додаткові аміно або карбоксикінцеві аміменше 15 нуклеотидних залишків або пар основ. нокислоти, або амінокислоти всередині зрілого Переважно, такі зонди будуть мати щонайменше поліпептиду (коли зріла форма має більше за один 30 нуклеотидних залишків або пар основ і можуть поліпептидний ланцюг, наприклад). Такі послідовмати щонайменше 50 нуклеотидних залишків або ності можуть грати роль в процесингу білка з попар основ. Особливо переважні зонди будуть мати передника в зрілу форму, можуть забезпечувати щонайменше 20 нуклеотидних залишків або пар транспорт білка, можуть подовжувати або укорооснов і будуть мати менше за 30 нуклеотидних чувати період напівжиття білка або можуть полегзалишків або пар основ. шувати обробку білка для аналізу або отримання, Кодуюча область генів білка Ε може бути видікрім всього іншого. Як правило, це випадок in vivo, лена скринінгом з використанням ДНК послідовнододаткові амінокислоти можуть бути процесовані сті, наведеної в SEQ ID NO: 11 для синтезу олігопоза зрілим білком клітинними ферментами. нуклеотидного зонду. Мічений олігонуклеотид, що Для кожного і всіх полінуклеотидів за винахомає послідовність, комплементарну послідовності дом тут представлений полінуклеотид, комплемегена за винаходом, потім використовують для нтарний йому. Переважно, щоб ці комплементарні скринінгу бібліотеки кДНК, геномної ДНК або мРНК полінуклеотиди були повністю комплементарними для визначення, з якими членами бібліотеки гібрикожному полінуклеотиду, якому вони комплемендизується цей зонд. тарні. Існує декілька доступних і добре відомих фахіБілок-попередник, що має зрілу форму поліпевцеві в рівні техніки способів отримання повнороптиду, злитого з однією або декількома пропослізмірних ДНК або подовження коротких ДНК, надовностями, може являти собою неактивну форму приклад ті, які засновані на методі швидкої поліпептиду. Коли пропослідовності видалені, такі ампліфікації кінців кДНК (RACE) (див., наприклад, неактивні попередники, як правило, активуються. Frohman, et al., PNAS USA 85: 8998-9002, 1988). 21 92782 22 Деякі або всі пропослідовності можуть бути видами, і до отримання поліпептидів за винаходом з лені до активації. В основному, такі попередники допомогою рекомбінантних технологій. називаються пробілками. Для рекомбінантного отримання поліпептидів Крім стандартних A, G, C, T/U позначень нукза винаходом клітини-хазяїни можуть бути генетилеотидів, також може використовуватися термін чно сконструйовані для включення експресійних «N» при описі деяких полінуклеотидів за винахосистем або їх частин або полінуклеотидів за винадом. «N» означає, що будь-який з чотирьох ДНК ходом. Включення полінуклеотиду в клітину-хазяїн або РНК нуклеотидів може бути присутнім в цьому може здійснюватися способами, описаними в бапозначеному положенні в ДНК або РНК послідовгатьох типових лабораторних керівництвах, таких ності, за винятком того, що переважно, щоб N не як Davis, et al., BASIC METHODS IN MOLECULAR являв собою нуклеїнову кислоту, яка в комбінації з BIOLOGY, (1986) і Sambrook, et al., MOLECULAR суміжними положеннями нуклеотидів при зчитуCLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., ванні в правильній рамці зчитування, не приводиCold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring ла б до появи кодону передчасної термінації в Harbor, N.Y. (1989), такими як, трансфекція з фостакій рамці зчитування. фатом кальцію, DЕАЕ-декстран-опосередкована Загалом, полінуклеотид за винаходом може трансфекція, трансвекція, мікроін'єкція, катіонна кодувати зрілий білок, зрілий білок плюс лідерну ліпід-опосередкована трансфекція, електропорапослідовність (який можна назвати пребілком), ція, кон'югація, трансдукція, введення при зішкріпопередника зрілого білка, що має одну або декібанні, введення балістичним методом і інфікуванлька пропослідовностей, які не є лідерними посліня. довностями пребілка, або препробілок, який є поХарактерні приклади відповідних хазяїнів передником пробілка, що має лідерну включають бактерійні клітини, такі як клітини стрепослідовність і одну або декілька пропослідовноспротококів, стафілококів, ентерококів, Е. coli, стретей, які, як правило, віддаляються під час стадій птоміцетів, ціанобактерій, Bacillus subtilis, Neisseria процесингу, які дають активні і зрілі форми поліпеmeningitidis, Haemophilus influenzae і Moraxella птиду. catarrhalis; клітини грибів, наприклад, клітини дріжВідповідно до одного аспекту винахід стосуджів, Kluveromyces, Saccharomyces, Pichia, бізиється застосування полінуклеотиду за винаходом доміцетів, Candida albicans і Aspergillus; клітини для терапевтичних або профілактичних цілей, зоккомах, таких як Drosophila S2 і Spodoptera Sf9; клірема генетичної імунізації. тини тварин, такі як СНО, COS, HeLa, С127, ЗТЗ, Застосування полінуклеотиду за винаходом в ВНК, 293, CV-1 і клітини меланоми Bowes; і клітини генетичній імунізації буде переважно використовурослин, такі як клітини голонасінних або вкритонаватися у відповідному способі доставки, такому як сінних. пряме внесення плазмідної ДНК в м'язи (Wolff et Величезна різноманітність експресійних сисal., Hum Mol Genet (1992) 1: 363, Manthorpe et al., тем може бути використана для отримання поліHum. Gene Ther. (1983) 4: 419), доставка ДНК в пептидів за винаходом. Такі вектори включають, комплексі зі специфічними білками-переносниками серед іншого, вектори хромосомного, епісомаль(Wu et al., J Biol Chem. (1989) 264: 16985), спільна ного або вірусного походження, наприклад, вектопреципітація ДНК з фосфатом кальцію (Benvenisty ри, отримані з бактерійних плазмід, з бактеріофа& Reshef, PNAS USA, (1986) 83: 9551), інкапсуляга, з транспозонів, з дріжджових епісом, з ція ДНК в різні форми ліпосом (Kaneda et al., вставкових елементів, з хромосомних елементів Science (1989) 243: 375), бомбардування частинок дріжджів, з вірусів, таких як бакуловіруси, папіло(Tang et al., Nature (1992) 356:152, Eisenbraun et мавіруси, такі як SV40, віруси коров'ячої віспи, al., DNA Cell Biol (1993) 12: 791) і in vivo інфікуванаденовіруси, віруси віспи птахів, віруси псевдосканя з використанням клонованих ретровірусних зу, пікорнавіруси, ретровіруси і альфавіруси, і веквекторів (Seeger et al., PNAS USA (1984) 81:5849). тори, отримані з їх комбінацій, наприклад, ті, які Вектори, клгтини-хазяїни, системи експресії отримані з генетичних елементів плазміди і бактеВинахід також стосується векторів, які містять ріофага, наприклад, косміди і фагеміди. Конструкполінуклеотид або полінуклеотиди за винаходом, ції експресійних систем можуть містити контрольні клітин-хазяїнів, які створені методами генної інжеобласті, які регулюють, а також викликають екснерії з векторами за винаходом, і отриманню поліпресію. В основному, будь-яка система або вектор, пептидів за винаходом з допомогою рекомбінантщо підходить для змісту, репродукції або експресій них технологій. Безклітинні системи трансляції полінуклеотидів і/або для експресії поліпептиду в також можуть бути використані для отримання хазяїні можуть бути використані для експресії в таких білків, з використанням РНК, отриманих з цьому значенні. Відповідна послідовність ДНК моконструкцій ДНК відповідно до винаходу. же бути вставлена в експресійну систему будьРекомбінантні поліпептиди за даним винахояким з різних добре відомих і способів, що звичайдом можуть бути отримані способами, добре відоно використовуються, наприклад, таких, які описамими фахівцям в даній галузі, з генетично сконстні у Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A руйованих клітин-хазяїнів, що містять експресійні LABORATORY MANUAL, (вище). системи. Відповідно до цього, в додатковому аспеУ рекомбінантних системах експресії еукаріот, кті даний винахід стосується експресійних систем, для секреції білка, що транслюється в просвіт енякі містять полінуклеотид або полінуклеотиди за доплазматичного ретикулума, в периплазматичний даним винаходом, до клітин-хазяїнів, які генетично простір або у позаклітинне оточення, відповідні сконструйовані з такими експресійними системасекреторні сигнали можуть бути включені в поліпептид, що експресується. Ці сигнали можуть бути 23 92782 24 ендогенними у відношенні поліпептиду або вони допомогою аналізу генотипа вибраного полінуклеможуть бути гетерологічними сигналами. отиду організму. Делеції і вставки можна виявити Поліпептиди за даним винаходом можуть бути шляхом зміни розміру ампліфікованого продукту в відновлені і очищені з рекомбінантних клітинних порівнянні з генотипом еталонної послідовності, культур добре відомими способами, в тому числі вибраної зі спорідненого організму, переважно преципітацією сульфатом амонію або етанолом, різних видів того ж роду або різних штамів одних і кислою екстракцією, аніон- або катіон-обмінною тих же видів. Точкові мутації можуть бути ідентихроматографією, фосфоцелюлозною хроматографіковані шляхом гібридизації ампліфікованої ДНК фією, хроматографією гідрофобних взаємодій, з міченими полінуклеотидними послідовностями афінною хроматографією, гідроксилапатитною білка Е. Точно спарені або спарені значною мірою хроматографією і лектиновою хроматографією. послідовності можна відрізнити від неповністю або Найбільш переважно для очищення використовузначно в більшій мірі неправильно спарених дупють афінну хроматографію іона металу (ІМАС). лексів з допомогою розщеплення ДНазою або Добре відомі способи переукладки білка можуть РНазою, для ДНК або РНК, відповідно, або шлябути використані для регенерації активної конфохом виявлення відмінностей в температурах плаврмації, коли поліпептид денатурують при внутрішлення або кінетики ренатурації. Відмінності полінуньоклітинному синтезі, виділенні і/або очищенні. клеотидних послідовностей також можна виявити Експресійна система також може являти соза допомогою змін електрофоретичної рухливості бою рекомбінантний живий організм, такий як вірус полінуклеотидних фрагментів в гелях в порівнянні або бактерія. Ген, що представляє інтерес, може з еталонною послідовністю. Це можна провести з бути вставлений в геном живого рекомбінантного денатуруючими агентами або без них. Відмінності вірусу або бактерії. Інокуляція і in vivo інфікування полінуклеотидів також можна виявляти безпосецим живим вектором приведе до in vivo експресії реднім секвенуванням ДНК або РНК. Див., наприантигену і індукції імунних реакцій. Віруси і бактеклад, Myers et al., Science, 230: 1242 (1985). Зміни рії, що використовуються для цієї мети, являють послідовності в певних локалізаціях також можуть собою, наприклад: поксвіруси (наприклад; коров'ябути виявлені за допомогою методів захисту від чої віспи, віспи птахів, віспи канарок), альфавіруси нуклеази, наприклад, методом захисту від РНази, (вірус Синдбіс, вірус Semliki Forest, вірус венесуєV1 і S1 або способом хімічного розщеплення. Див., льского енцефаліту коней), аденовіруси, аденонаприклад, Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, асоційовані віруси, пікорнавіруси (поліовірус, ри85: 4397-4401 (1985). новірус), віруси герпесу (вірус вітряної віспи, і т.п.), В іншому варіанті здійснення може бути сконсЛістерія, Сальмонелла, Шигелла, BCG, стрептокотруйована матриця олігонуклеотидних зондів, що ки. Ці віруси і бактерії можуть бути вірулентний містять нуклеотидні послідовності білка Ε або їх або атенуйовані різними шляхами для отримання фрагменти для проведення ефективного скринінгу, живих вакцин. Такі живі вакцини також становлять наприклад, генетичних мутацій, серотипу, таксочастину винаходу. номічної класифікації або ідентифікації. Способи Діагностичні, прогностичні аналізи, серотипуматричних технологій добре відомі і мають повсювання і дослідження мутацій дне застосування і можуть бути використані для Цей винахід також стосується застосування рішення цілого ряду питань в молекулярній генеполінуклеотидів білка Ε і поліпептидів за винахотиці, включаючи генну експресію, зчеплене успаддом для використання як діагностичних реактивів. кування і генетичну варіабельність (див., наприВиявлення полінуклеотидів і/або поліпептидів білклад, Chee et al. Science, 274: 610 (1996)). ка Ε у еукаріот, зокрема, ссавців, і особливо у люТаким чином, в іншому аспекті даний винахід дей забезпечить діагностичний спосіб для діагносстосується діагностичного набору, який містить: тики захворювання, стадії захворювання або (a) полінуклеотид за даним винаходом, перереакцій збудника інфекції на лікарські засоби. Еуважно будь-яку з нуклеотидних послідовностей каріоти, зокрема ссавці, і особливо люди, зокрема SEQ ID NO: 11, або їх фрагмент; інфіковані організмом, або у яких підозрюють ін(b) нуклеотидну послідовність, комплементарфекцію, що містить гени білка Ε або білки, можна ну послідовності (а); виявити на рівні нуклеїнових кислот або амінокис(c) поліпептид за даним винаходом, переважлот цілим рядом відомих методик, а також спосоно будь-який з поліпептидів SEQ ID NO: 1-10 або бами, описаними тут. його фрагмент; або Поліпептиди і полінуклеотиди для прогнозу(d) антитіло до пептиду за даним винаходом, вання, діагностики або іншого аналізу можуть бути переважно до будь-якого з поліпептидів SEQ ID отримані з приблизно інфікованих і/або інфіковаNO: 1-10. них матеріалів організму індивідуума. ПолінуклеоБуде зрозуміло, що в будь-якому такому наботиди з будь-яких цих джерел, особливо ДНК або рі (а), (b), (с) або (d) може містити основний комРНК, можуть бути використані для детекції безпопонент. Такий набір буде застосовуватися в діагсередньо, або можуть бути ферментативно ампностиці захворювання або підозри на ліфіковані з допомогою ПЛР або будь-яких інших захворювання, серед іншого. способів ампліфікації перед аналізом. РНК, зокреЦей винахід також стосується застосування ма мРНК, кДНК і геномна ДНК також можуть бути полінуклеотидів за даним винаходом як діагностивикористані таким же чином. Використовуючи амчних реактивів. Виявлення мутантної форми поліпліфікацію, характеристика видів і штамів збуднинуклеотиду за винаходом, переважно будь-якої ка інфекції або резидентного організму, що знахопослідовності SEQ ID NO: 11, пов'язаної із захводиться у індивідуума, може бути здійснена за рюванням або патогенністю, буде забезпечувати 25 92782 26 діагностичний інструмент, який може доповнити ліз, сендвич-аналізи з використанням антитіл, деабо встановити діагноз захворювання, прогноз текція антитіла і ELISA. перебігу захворювання, визначення стадії захвоПолінуклеотиди за винаходом можуть бути вирювання або схильності до захворювання, яке є користані як компоненти полінуклеотидних матрезультатом недостатньої експресії, гіперекспресії риць, переважно матриць високої щільності, або або зміненої експресії цього полінуклеотиду. Оргагридів. Ці матриці високої щільності головним чинізми, зокрема збудники інфекції, що несуть мутаном використовують з діагностичними і прогностиції в такому полінуклеотиді, можуть бути виявлені чними цілями. Наприклад, набір плям, кожна з на полінуклеотидному рівні за допомогою цілого яких містить різний ген і додатково містить полінуряду методик, наприклад, описаних в будь-якому клеотид або полінуклеотиди за винаходом, може місці цієї заявки. бути використаний для зондування, наприклад, з Клітини організму, що несе мутації або полівикористанням гібридизації або ампліфікації нукморфізми (алельні варіанти) в полінуклеотиді і/або леїнової кислоти, з використанням зондів, отримаполіпептиді за винаходом, також можна виявити них з біологічного зразка, або що походять з нього, на полінуклеотидному або поліпептидному рівні за для визначення наявності у індивідуума конкретної допомогою цілого ряду методик, наприклад, для полінуклеотидної послідовності або спорідненої можливості здійснення серотипування. Наприклад, послідовності. Така наявність може вказувати на може бути використана ЗТ-ПЛР для виявлення присутність патогену, зокрема атипової Н. мутацій в РНК. Особливо переважно використовуinfluenzae, і може бути використана в діагностиці вати ЗТ-ПЛР спільно з автоматизованими систеі/або прогнозуванні захворювання або перебігу мами детекції, наприклад, такими як GeneScan. захворювання. Переважним є грид, що містить ряд РНК, кДНК або геномна ДНК також можуть бути варіантів будь-якої полінуклеотидної послідовності використані для тієї ж мети ПЛР. Як приклад, ПЛРSEQ ID NO: 11. Також переважним є ряд варіантів праймери, комплементарні полінуклеотиду, що полінуклеотидної послідовності, що кодує будь-яку кодує поліпептиди білка Е, можуть бути викорисполіпептидну послідовність SEQ ID NO: 1-10. тані для ідентифікації і аналізу мутацій. Антитіла Винахід додатково стосується праймерів з 1, Поліпептиди і полінуклеотиди за винаходом 2, 3 або 4 нуклеотидами, видаленими з 5'- і/або 3'або їх варіанти, або клітини, що експресують їх, кінця. Ці праймери можуть бути використані, серед можуть бути використані як імуногени для отриіншого, для ампліфікації ДНК білка Ε і/або РНК, мання антитіл, імунологічно специфічних у відновиділеної із зразка, отриманого від індивідуума, шенні таких поліпептидів або полінуклеотидів, відтакого як біологічний матеріал. Праймери можуть повідно. Альтернативно, мімотопи, зокрема, бути використані для ампліфікації полінуклеотиду, пептидні мімотопи, епітопів в межах поліпептидної виділеного від інфікованого індивідуума, таким послідовності також можуть бути використані як чином, щоб цей полінуклеотид потім можна було імуногени для отримання антитіл, імунологічно піддати різним методикам для з'ясування полінукспецифічних у відношенні поліпептиду за винахолеотидної послідовності. Отже, мутації в полінукдом. Термін «імунологічно специфічні» означає, леотидній послідовності можуть бути детектовані і що ці антитіла мають по суті більш високу афінвикористані для діагностики і/або прогнозу інфекції ність у відношенні поліпептидів за винаходом, ніж або її стадії, або перебігу або для серотипування їх афінність у відношенні інших споріднених поліі/або класифікації інфекційного агента. пептидів, відомих з рівня техніки. Винахід додатково стосується способу діагноУ деяких переважних варіантах здійснення вистики захворювання, переважно бактерійних інфенахід стосується антитіл проти поліпептидів або кцій, більш переважно, інфекцій, що викликаються полінуклеотидів білка Е. атиповою Н. influenzae, що включає виявлення із Антитіла, що виробляються проти поліпептизразка, отриманого від індивідуума, такого як біодів або полінуклеотидів за винаходом, можуть буматеріал, підвищеного рівня експресії полінуклеоти отримані шляхом введення поліпептидів і/або тиду, що має послідовність будь-яку з послідовнополінуклеотидів за винаходом, або фрагментів, що стей SEQ ID NO: 11. Підвищена або знижена несуть епітоп, одного з них, або обох, аналогів експресія полінуклеотиду білка Ε може бути виміодного або обох, або клітин, що експресують будьряна за допомогою будь-якого з добре відомих в який або обидва разом, тварині, переважно, не цій галузі способів для кількісної оцінки полінуклелюдині, використовуючи звичайні протоколи. Для отидів, наприклад, таких як ампліфікація, ПЛР, ЗТотримання моноклональних антитіл, може бути ПЛР, захист від РНази, Нозерн-блотинг, спектровикористана будь-яка методика, відома в рівні метрія, і інших способів гібридизації. техніки, яка забезпечує отримання антитіл, що Крім того, діагностичне дослідження відповідпродукуються культурами стабільних клітинних но до винаходу для виявлення гіперекспресії поліліній. Приклади включають різні методики, такі як у пептидів білка Ε в порівнянні із зразками нормальKohler, G. і Milstein, С, Nature 256: 495-497 (1975); них контрольних тканин може бути використане, Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole наприклад, для виявлення наявності інфекції. Меet al., pg. 77-96 в MONOCLONAL ANTIBODIES AND тодики дослідження, які можуть бути використані CANCER THERAPY, AlanR. Liss, Inc. (1985). для визначення рівнів поліпептидів білка Е, в зразМетодики отримання одноланцюгових антитіл ку, отриманому від хазяїна, такому як біоматеріал, (патент США № 4946778) можуть бути пристосодобре відомі фахівцям в цій галузі. Такі способи вані для отримання одноланцюгових антитіл до дослідження включають радіоімуноаналізи, аналіполіпептидів або полінуклеотидів за винаходом. зи конкурентного зв'язування, Вестерн-блот анаТакож, трансгенні миші або інші організми або 27 92782 28 тварини, такі як інші ссавці, можуть бути викорисджують в присутності відомого агоніста і спостерітані для експресії гуманізованих антитіл, імунологають за впливом присутньої кандидатної сполуки гічно специфічних у відношенні поліпептидів або на активацію під дією агоніста. Конститутивно акполінуклеотидів за винаходом. тивний поліпептид і/або поліпептиди і полінуклеоАльтернативно технологія фагового дисплея тиди, що конститутивно експресуються, можуть може бути використана для відбору генів антитіл зі бути використані в способах скринінгу на інверсію зв'язувальною активністю у відношенні поліпептиагоністів або інгібіторів, у відсутності агоніста або ду за винаходом або з репертуару ампліфікововаінгібітору, шляхом тестування, чи приведе кандиних за допомогою ПЛР v-генів лімфоцитів людей, датна сполука до інгібування або активації поліпепідданих скринінгу на наявність анти-білка Е, або з птиду або полінуклеотиду, в залежності від конкприродних бібліотек (McCafferty, et al., (1990), ретного випадку. Крім того, способи скринінгу Nature 348, 552-554; Marks, et al., (1992) можуть просто включати стадії змішування кандиBiotechnology 10, 779-783). Афінність цих антитіл датної сполуки з розчином, що містить поліпептид також може бути поліпшена, наприклад, ланцюгоабо полінуклеотид за даним винаходом, з отривим шафлінгом (Clackson et al., (1P91) Nature 352: манням суміші, вимірювання активності поліпепти628). дів і/або полінуклеотидів білка Ε в суміші, і порівОписані вище антитіла можуть бути викорисняння активності поліпептидів і/або тані для виділення або для ідентифікації клонів, полінуклеотидів білка Ε суміші зі стандартом. Злиті що експресують поліпептиди або полінуклеотиди білки, такі як білки, отримані з Fc-частини і поліпеза винаходом, для очищення поліпептидів або птидів білка Е, описаних тут раніше, також можуть полінуклеотидів, наприклад, з допомогою афінної бути використані для скринінгових досліджень з хроматографії. високою пропускною спроможністю для ідентифіТаким чином, серед іншого, антитіла проти кації антагоністів поліпептидів за даним винахополіпептидів білка Ε або полінуклеотидів білка Ε дом, а також філогенетично і/або функціонально можуть бути використані для лікування інфекцій, споріднених поліпептидів (див. D. Bennett et al., J зокрема, бактерійних інфекцій. Mol Recognition, 8:52-58 (1995); і K. Johanson et al., Поліпептидні варіанти, що включають антиJ Biol Chem, 270(16):9459-9471 (1995)). генно, епітопно або імунологічно еквівалентні ваПолінуклеотиди, поліпептиди і антитіла, які ріанти, складають особливий аспект винаходу. зв'язуються і/або взаємодіють з поліпептидом за Переважно, антитіло або його варіант модифіданим винаходом, також можуть бути використані кують для зменшення його імуногенності у індивідля створення способів скринінгу для визначення дуума. Наприклад, якщо індивідуумом є людина, дії додаткових компонентів на продукцію мРНК найбільш переважно, антитіло може бути «гуманіі/або поліпептиду в клітинах. Наприклад, ELISA зоване», де область, або області, що визначає можна провести для вимірювання секретованих комплементарність, гібридомного антитіла були або клітиннозв'язаних рівнів поліпептиду, використрансплантовані в моноклональне антитіло людитовуючи моноклональні і поліклональні антитіла, ни, наприклад, як описано у Jones et al. (1986), за допомогою стандартних способів, відомих в Nature 321, 522-525 або Tempest et al., (1991) рівні техніки. Цей аналіз може бути використаний Biotechnology 9, 266-273. для виявлення агентів, які можуть інгібувати або Антагоністи і агоністи - дослідження і молекули посилювати продукцію поліпептиду (також званих Поліпептиди і полінуклеотиди за винаходом антагоністом або агоністом, відповідно) з обробтакож можуть бути використані для оцінки зв'язулених відповідним чином клітин або тканин. вання дрібномолекулярних субстратів і лігандів, Винахід також стосується способу скринінгу наприклад, в клітинах, безклітинних препаратах, сполук для ідентифікації тих, які посилюють (агохімічних бібліотеках і сумішах природних продукніст) або блокують (антагоніст) дію поліпептидів тів. Ці субстрати і ліганди можуть бути природними або полінуклеотидів білка Е, особливо тих сполук, субстратами і лігандами, або можуть бути структуякі є бактеріостатичними і/або бактерицидними. рними або функціональними міметиками. Див., Спосіб скринінгу може включати методики з висонаприклад, Coligan et al., Current Protocols in кою пропускною спроможністю. Наприклад, для Immunology 1(2): Chapter 5 (1991). скринінгу агоністів або антагоністів, синтетичну Способами скринінгу можна просто вимірювареакційну суміш, клітинний компартмент, такий як ти зв'язування кандидатної сполуки з поліпептимембрана, клітинна оболонка або клітинна стінка, дом або полінуклеотидом, або з клітинами або або препарат будь-якого з них, що містять поліпемембранами, що несуть поліпептид або полінукптиди білка Ε і мічений субстрат або ліганд такого леотид, або злитий білок поліпептиду, за допомополіпептиду, інкубують у відсутності або присутногою мітки, безпосередньо прямо або опосередкості кандидатної молекули, яка може бути агоністом вано зв'язаної з кандидатною сполукою. або антагоністом білка Е. Здатність кандидатної Альтернативно, спосіб скринінгу може включати молекули викликати агонізм або антагонізм відноконкуренцію з міченою конкурентною речовиною. сно поліпептиду білка Ε відбивається в зниженні Крім того, цими способами скринінгу можна перезв'язування міченого ліганду або зниженні утвовірити, чи приводить кандидатна сполука в ререння продукту з цього субстрату. Молекули, які зультаті до сигналу, генерованого активацією або зв'язуються необгрунтовано, тобто не роблячи інгібуванням поліпептиду або полінуклеотиду, вивпливу на поліпептид білка Е, найбільш ймовірно є користовуючи системи детекції, що відповідають хорошими антагоністами. Молекули, які зв'язуютьклітинам, що містять цей поліпептид або полінукся добре, і, відповідно, збільшують швидкість леотид. Інгібітори активації в основному досліутворення продукту з субстрату, посилюють пере 29 92782 30 дачу сигналу, або підвищують активність хімічного Fc-частина може бути видалена простим включенканалу, є агоністами. Визначення швидкості або ням послідовності, що розщеплюється, яка може рівня, в залежності від кожного конкретного випадрозщеплюватися під дією фактора згортання крові ку, утворення продукту з субстрату, передачі сигХа. Крім того, цей винахід стосується способів налу або активності хімічного каналу, можна поотримання цих злитих білків за допомогою генної ліпшити використанням репортерної системи. інженерії, і їх застосування для скринінгу лікарсьРепортерні системи, які можуть бути використані в ких засобів, діагностики і лікування. Додатковий цьому відношенні, включають, але не тільки, колоаспект винаходу також стосується полінуклеотириметричні, перетворення міченого субстрату в дів, що кодують такі злиті білки. Приклади технопродукт, репортерний ген, який відповідає за зміни логії злитих білків можна знайти в міжнародних активності полінуклеотидів або поліпептидів білка патентних заявках WO94/29458 і WO94/22914. Е, і аналізи зв'язування, відомі в рівні техніки. Кожна з представлених тут полінуклеотидних Іншим прикладом дослідження у відношенні послідовностей може бути використана для виявагоністів білка Ε є конкурентний аналіз, який об'єлення і розробки антибактерійних сполук. Білок, днує білок Ε і потенційний агоніст з молекулами, що кодується, після експресії може бути викорисщо зв'язуються з білком Е, рекомбінантними молетаний як мішень для скринінгу антибактерійних кулами, що зв'язуються з білком Е, природними лікарських засобів. Додатково, полінуклеотидні субстратами або лігандами, або міметиками субпослідовності, що кодують амінокінцеві області страту або ліганду, у відповідних умовах для анабілка, що кодується, або послідовність Шайналізу конкурентного інгібування. Білок Ε можна поДальгарно або інші послідовності, що полегшують мітити, наприклад, радіоактивною або трансляцію відповідної мРНК, можуть бути викоколориметричною сполукою, таким чином, щоб ристані для конструювання антисмислових посліможна було точно визначити кількість молекул довностей для контролю експресії кодуючої послібілка Е, що зв'язалися зі зв'язувальною молекулою довності, що представляє інтерес. або що перетворювалися в продукт, для оцінки Винахід також стосується застосування поліефективності потенційного антагоніста. пептиду, полінуклеотиду, агоніста або антагоніста Потенційні антагоністи включають, серед інза винаходом для надання протидії вихідній фізишого, низькомолекулярні органічні молекули, пепчній взаємодії між патогеном або патогенами і еутиди, поліпептиди і антитіла, які зв'язуються з покаріотичним хазяїном, переважно ссавцем, що лінуклеотидом і/або поліпептидом за винаходом і, відповідає на наслідки інфікування. Зокрема, мотим самим, інгібують або пригнічують їх активність лекули за винаходом можуть бути використані для або експресію. Потенційні антагоністи також мозапобігання адгезії бактерій, зокрема, грампозитижуть являти собою низькомолекулярні органічні вних і/або грамнегативних бактерій, до білків позамолекули, пептид, поліпептид, наприклад близькоклітинного матриксу еукаріот, переважно ссавців, споріднений білок або антитіло, який зв'язується з на імплантованих пристроях або до білків позаклітими ж сайтами на зв'язувальній молекулі, такій як тинного матриксу в ранах; для блокування бактезв'язувальна молекула, не індукуючи активність, рійної адгезії між білками позаклітинного матриксу що індукується білком Е, тим самим запобігаючи еукаріот, переважно ссавців, і білка Ε бактерій, які дії або експресії поліпептидів білка Ε і/або полінуопосередковують пошкодження тканин, і/або для клеотидів, виключаючи поліпептиди і/або полінукблокування нормального розвитку патогенезу при леотиди білка Ε із зв'язування. інфекціях, викликаних іншими причинами, крім Потенційні антагоністи включають малу молеімплантації постійних пристроїв або іншої хірургічкулу, яка зв'язується і займає сайт зв'язування ної техніки. поліпептиду, тим самим запобігаючи зв'язуванню з Відповідно до ще одного аспекту, винахід стоклітинними молекулами зв'язування, так, щоб не сується агоністів і антагоністів білка Е, переважно допустити нормальну біологічну активність. Прикбактерістатичних або бактерицидних агоністів і лади низькомолекулярних молекул включають, антагоністів. але не тільки, низькомолекулярні органічні молеАнтагоністи і агоністи за винаходом можуть кули, пептиди або пептидоподібні молекули. Інші бути використані, наприклад, для профілактики, потенційні антагоністи включають антисмислові інгібування і/або лікування захворювань. молекули (опис цих молекул див. у Okano, J. У додатковому аспекті, даний винахід стосуNeurochem. 56: 560 (1991); ється мімотопів поліпептиду за винаходом. МімоOLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTISENSE топ являє собою пептидну послідовність, в достаINHIBITORS OF GENE EXPRESSION, CRC Press, тній мірі схожу на нативний пептид (по Boca Raton, FL (1988)). Переважні антагоністи послідовності і структурно), яка може розпізнававключають сполуки, споріднені білку Ε або варіантися антитілами, що розпізнають нативний пептид; ти білка Е. або здатні індукувати утворення антитіл, які розпіУ додатковому аспекті даний винахід стосузнають нативний пептид при з'єднанні з відповідється генноінженерних розчинних злитих білків, що ним носієм. містять поліпептид за даним винаходом, або його Пептидні мімотопи можуть створюватися для фрагмент, і різні частини константних областей конкретної мети шляхом додавання, делеції або важких або легких ланцюгів імуноглобулінів різних заміни вибраних амінокислот. Отже, пептиди мопідкласів (IgG, IgM, IgA, IgE). Як імуноглобулін пежуть бути модифіковані з метою полегшення кон'реважною є константна область важкого ланцюга югації з білком-переносником. Наприклад, може IgG людини, зокрема lgG1, де злиття має місце в бути бажаним для деяких хімічних способів кон'юшарнірній області. В окремому варіанті здійснення, гації включати кінцевий цистеїн. Додатково може 31 92782 32 бути бажаним для пептидів, кон'югованих з білкомнуклеїнову кислоту, гібрид ДНК/РНК, комплекс переносником, включати гідрофобний кінець у ДНК-білок або комплекс РНК-білок. віддаленні від кон'югованого кінця пептиду таким Додатковий аспект винаходу стосується імучином, щоб вільний некон'югований кінець пептиду нологічної композиції, яка при введенні індивідуузалишався зв'язаним з поверхнею білкаму, переважно людині, здатній мати індуковану переносника. Тим самим представляючи пептид в імунологічну відповідь, індукує імунологічний відконформації, яка найбільш близько нагадує конповідь у цього індивідуума на полінуклеотид і/або формацію пептиду, що знаходиться в оточенні поліпептид білка Е, що кодується ним, де ця комцілісної природної молекули. Наприклад, пептиди позиція містить рекомбінантний полінуклеотид можуть бути змінені для придбання N-кінцевого білка Ε і/або поліпептид, що кодується ним, і/або цистеїну і С-кінцевого гідрофобного амідованого містить ДНК і/або РНК, яка кодує і експресує антихвоста. Альтернативно, додавання або заміну Dген вказаного полінуклеотиду білка Е, поліпептиду, стереоізомерной форми однієї або декількох аміщо кодується ним, або іншого поліпептиду за винокислот (інвертовані послідовності) можна провенаходом. Імунологічна відповідь може бути викости для створення сприятливого похідного, наприристана терапевтично або профілактично і може клад, для посилення стабільності пептиду. набувати форми антитільного імунітету і/або кліМімотопи також можуть бути ретропослідовностятинного імунітету, наприклад, клітинного імунітету, ми природних пептидних послідовностей, які мазумовленого CTL або CD4+ Т-клітинами. ють зворотну орієнтацію послідовності. Мімотопи Поліпептиди білка Ε або їх фрагменти можуть також можуть бути по характеру ретробути злиті з ко-білком або хімічною частиною, яка інвертованими. Ретро, інвертовані і ретросама може або не може продукувати антитіла, але інвертовані пептиди описані в WO 95/24916 і WO яка здатна стабілізувати перший білок і продукува94/05311. ти злитий або модифікований білок, який буде Альтернативно, пептидні мімотопи можуть бумати антигенні і/або імуногенні властивості, і, пети ідентифіковані з використанням антитіл, які самі реважно, протективні властивості. Отже, злитий здатні зв'язуватися з поліпептидами за даним вирекомбінантний білок, переважно, додатково міснаходом, за допомогою таких методик, як технолотить антигенний ко-білок, такий як ліпопротеїн або гія фагового дисплея (ЕР 0552267 В1). У цій техбілок D Haemophilus influenzae (ЕР 594610), глутанології генерується величезне число пептидних тіон-S-трансферазу (GST) або бета-галактозидазу, послідовностей, які імітують структуру нативних або будь-який інший відносно великий ко-білок, пептидів і, отже, здатні зв'язуватися з антитілами який солюбілізує білок і полегшує його продукцію і до нативних пептидів, але самі не обов'язково моочищення. Крім того, ко-білок може діяти як ад'южуть мати значну гомологію послідовності з нативвант в значенні забезпечення генералізованої ним поліпептидом. стимуляції імунної системи організму, що одержує Вакцини цей білок. Ко-білок може бути приєднаний або до Інший аспект винаходу стосується способу інаміно-, або до карбокси-кінця першого білка. дукції імунологічної відповіді у індивідуума, зокреУ композиції вакцини за винаходом поліпептима у ссавця, переважно у людей, що включає інфіди і/або полінуклеотиди білка Ε або їх фрагмент, кування індивідуума полінуклеотидом і/або або мімотоп, або варіант можуть знаходитися у поліпептидом білка Е, або його фрагментом або векторі, наприклад, живих рекомбінантних вектоваріантом, прийнятним для продукції антитіла рах, описаних вище, наприклад, живих бактерійних і/або Т-клітинної імунної відповіді для захисту вкавекторах. заного індивідуума від інфекції, зокрема бактерійТакож підходять неживі вектори для поліпепної інфекції і, найбільш переважно, інфекції, витидів білка Е, наприклад, везикули зовнішньої кликаної атиповою Н. influenzae. Також мембрани бактерій або «пухирці». Пухирці зовнішпередбачаються способи, за допомогою яких така ньої мембрани утворюються із зовнішньої мемімунологічний відповідь сповільнює реплікацію брани двошарової мембрани грамнегативних бакбактерій. Ще один аспект винаходу стосується терій і були документально зафіксовані у багатьох способу індукції імунологічної відповіді у індивідуграмнегативних бактерій. (Zhou, L et al. 1998. ума, який включає введення цьому індивідууму FEMS Microbiol. Lett. 163:223-228) в тому числі С. нуклеотидного вектора, послідовності або рибозиtrachomatis і С. psittaci. Неповний перелік бактему для напряму експресії полінуклеотидів і/або рійних патогенів, які, як повідомляється, утворюполіпептидів білка Е, або їх фрагмента або варіанють пухирці, також включає: Bordetella pertussis, тів для експресії полінуклеотидів і/або поліпептиBorrelia burgdorferi, Brucella melitensis, Brucella дів білка Е, або їх фрагмента або варіанта in vivo ovis, Esherichia coli, Haemophilus influenzae, для індукції імунологічний відповіді, в тому числі, Legionella pneumophila, Moraxella catarrhalis, наприклад, Т-клітин, що продукують цитокіну, або Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, цитотоксических Т-клітин, для захисту вказаного Pseudomonas aeruginosa і Yersinia enterocolitica. індивідуума, переважно людини, від захворюванПеревага пухирців полягає в тому, що білки ня, незалежно від того, чи розвинулося вже у індизовнішньої мембрани представлені в їх нативній відуума це захворювання, чи ні. Одним прикладом конформації і, отже, особливо підходять для ваквведення гена є введення шляхом запуску їх в цин. Пухирці також можна удосконалити для викобажані клітини у вигляді нанесення на частинки, ристання у вакцинах шляхом створення бактерії, або іншим шляхом. Такий нуклеотидний вектор таким чином, щоб модифікувати експресію однієї може містити ДНК, РНК, рибозим, модифіковану або декількох молекул на зовнішній мембрані. Таким чином, наприклад, експресія бажаного імуно 33 92782 34 генного білка на зовнішній мембрані, наприклад, діляють і модифікують таким чином, щоб вона місполіпептидів білка Е, може бути інтродукована або тила регуляторні елементи іншого гена, поєднання активована (наприклад, шляхом зміни промотора). регуляторних елементів різних генів, синтетичну Замість цього, або в доповнення до цього, експререгуляторну область, або будь-яку іншу регулятосія молекул зовнішньої мембрани, які або не релерну область, або для делеції вибраних частин ревантні (наприклад, непротективні антигени або гуляторних послідовностей дикого типу. Ці модиімунодомінантні, але варіабельні білки), або є шкіфіковані послідовності потім можуть бути повторно дливими (наприклад, токсичні молекули, такі як введені в бактерію за допомогою гомологічної реLPS, або потенційні індуктори аутоімунної реакції) комбінації в геном. Неповний перелік переважних може бути пригнічена. Ці підходи більш детально промоторів, які могли бути використані для актирозглядаються нижче. вації генної експресії, включає промотори роrА, Некодуючі фланкуючі області генів білка Ε місporB, lbpB, tbpB, p110, lst, hpuAB з N. meningitidis тять регуляторні елементи, важливі для експресії або N. gonorroheae; ompCD, сорВ, lbpB, ompE, цього гена. Ця регуляція має місце як на рівні траUspA1; UspA2; TbpB з Μ. Catarrhalis; p1, p2, p4, p5, нскрипції, так і на рівні трансляції. Послідовність p6, lpD, tbpB, D15, Hia, Hmw1, Hmw2 з Η. цих областей або вище, або нижче відкритої рамки influenzae. зчитування цього гена, може бути отримана шляВ одному прикладі, експресію гена можна мохом секвенування ДНК. Ця інформація про послідулювати шляхом заміни його промотора більш довність дає можливість визначити потенційні ресильним промотором (за допомогою виділення гуляторні мотиви, такі як різні промоторні послідовності гена перед сайтом ініціації транскелементи, термінаторні послідовності, індуциберипції, in vitro модифікації цієї послідовності і польні елементи послідовностей, репресори, елемевторного введення в геном шляхом гомологічної нти, відповідальні за фазову варіацію, послідоврекомбінації). Активовану регуляцію експресії моність Шайна-Дальгарно, області з потенційною жна отримати і у бактерій, а також і у везикулах вторинною структурою, залученою до регуляції, а зовнішньої мембрани, що скидаються з бактерій також інших типів регуляторних мотивів або послі(або що виробляються). довностей. Ця послідовність являє собою додатВ інших прикладах,описані підходи можуть ковий аспект винаходу. бути використані для отримання рекомбінантних Ця інформація про послідовність дозволяє бактерійних штамів з поліпшеними характеристимодулювати природну експресію генів білка Е. ками для застосувань у вакцинах. Це можуть бути, Активація генної експресії може здійснюватися але не тільки, атенуйовані штами, штами з підвишляхом зміни промотора, послідовності Шайнащеною експресією вибраних антигенів, штами з Дальгарно, потенційних репресорних або операнокаутом (або зниженою експресією) генів, що торних елементів або будь-яких інших, залучених перешкоджають імунній реакції, штами з модульодо цього процесу, елементів. Подібним чином, ваною експресією імунодомінатних білків, штами з пригнічення експресії може досягатися аналогічмодульованим шедингом везикул зовнішньої мемними типами модифікації. Альтернативно, шляхом брани. зміни послідовностей варіації фаз, експресія гена Таким чином, винахід також стосується модиможе бути поставлена під контроль варіації фаз, фікованої 3'-5'-області генів білка Е, яка містить або може бути не зв'язана з цією регуляцією. В гетерологічний регуляторний елемент, який змінює іншому підході, експресія гена може бути поставрівень експресії білків білка Е, розташованих на лена під контроль одного або декількох індуцибезовнішній мембрані. 3'-5'-область відповідно до льних елементів, що дозволяють здійснювати рецього аспекту винаходу включає послідовність, гульовану експресію. Приклади такої регуляції розташовану перед сайтом ініціації транскрипції включають, але не тільки, індукцію температурним генів білка Е. 3'-5'-область починається безпосезсувом, додавання субстрат-індуктора на зразок редньо вище за гени білка Е, і продовжується звивибраних вуглеводів або їх похідних, мікроелеменчайно до положення приблизно не більше за 1000 тів, вітамінів, кофакторів, іонів металу і т.п. п.н. вище за ген від стартового кодону ATG. У разі Такі модифікації, як описано вище, можуть бурозташування гена в поліцистонній послідовності ти введені декількома різними способами. Моди(оперон) 3'-5'-область може починатися безпосефікацію послідовностей, залучених до генної ексредньо перед геном, що представляє інтерес, або пресії можна здійснювати in vivo шляхом перед першим геном в опероні. Переважно, мовипадкового мутагенезу з подальшою селекцією дифікована ділянка, розташована в напрямку 3-5', бажаного фенотипу. Інший підхід полягає у видівідповідно до цього аспекту винаходу містить геленні області, що представляє інтерес, і модифітерологічний промотор в положенні між 500 і 700 кації цієї області за допомогою випадкового мутап.н. вище за ATG. генезу, або сайт-направленим мутагенезом Застосування описаних 3'-5'-областей для акзаміни, вставковим або делеційним мутагенезом. тивації експресії генів білка Е, спосіб здійснення Модифіковану область потім можна знову ввести в цього за допомогою гомологічної рекомбінації (набактерійний геном за допомогою гомологічної реприклад, як описано в WO 01/09350, включено тут комбінації, і можна оцінити вплив на генну експреяк посилання), вектор, що містить 3'-5'сію. В іншому підході, знання про послідовність в послідовність, що підходить для цієї мети і клітинаобласті, що представляє інтерес, може бути викохазяїн, змінена таким чином, складають додаткові ристане для заміни або делеції всіх природних аспекти цього винаходу. регуляторних послідовностей, або частини з них. У Таким чином, винахід стосується поліпептидів цьому випадку, намічену регуляторну область вибілка Е, в модифікованому бактерійному пухирці. 35 92782 36 Винахід додатково стосується модифікованих клікатегорії відповіді були названі відповідями ТH1тин-хазяїнів, здатних продукувати неживі мембратипу (клітинно-опосередкована відповідь), і імуннозв'язані пухирцеві вектори. Винахід додатково ними реакціями ТН2-типу (гуморальна відповідь). стосується нуклеотидних векторів, що містять гени Виражені імунні реакції ТH1-типу можуть бути білка Е, з модифікованою 3'-5'-областю, що місохарактеризовані виробленням антигентить гетерологічний регуляторний елемент. специфічних, обмежених гаплотипом, цитотоксичДодатково винахід стосується способів отриних Т-лімфоцитів, і реакціями природних клітинмання клітин-хазяїнів і бактерійних пухирців відпокілерів. У мишей реакції ТН1-типу часто характевідно до винаходу. ризуються виробленням антитіл IgG2a підтипу, Винахід також стосується композицій, зокрема, тоді як у людей це відповідає антитілам типу lgG1. композицій вакцини, і способів, що включають поІмунні реакції ТН2-типу характеризуються виробліпептиди і/або полінуклеотиди за винаходом і ленням широкого спектра ізотипів імуноглобулінів, імуностимулюючі ДНК послідовності, такі, які опищо включають у мишей lgG1, IgA, i IgM. сані у Sato, Y. et al. Science 273: 352 (1996). Можна припустити, що рушійною силою цих Винахід також стосується способів застосудвох типів імунних реакцій, є цитокіни. Високі рівні вання описаного полінуклеотиду або його окремих цитокінів TH1-типу направлені на підтримку індукфрагментів, який, як було показано, кодує неваріції клітинно-опосередкованих імунних реакцій на абельні області білків клітинної поверхні бактерій, заданий антиген, тоді як високі рівні цитокінів ТН2в полінуклеотидних конструкціях, що використовутипу направлені на підтримку індукції гуморальних ються в таких експериментах по генній імунізації імунних реакцій на цей антиген. на тваринних моделях інфекції, викликаної атипоВідмінність між імунними реакціями ТН1 і ТН2вою Н. influenzae. Такі експерименти будуть особтипу не є абсолютною. Насправді, у індивідуума ливо корисні для ідентифікації білкових епітопів, буде забезпечуватися імунна реакція, яку описуздатних викликати профілактичну або терапевтичють як переважно ТН1 або переважно ТН2. Однак, ну імунну відповідь. Вважається, що цей підхід часто зручно розглядати сімейства цитокінов у дозволить надалі отримати моноклональні антитівиразах, описаних в CD4 + Т-клітинних клонах ла особливої важливості, що походять з потрібномишей або щурів авторами Mosmann і Coffman го органу тварини, що з успіхом чинить опір або (Mosmann, T.R. and Coffman, R.L. (1989) TH1 and що звільняється від інфекції, для розробки профіTH2 cells: different patterns of lymphokine secretion лактичних засобів або терапевтичного лікування lead to different functional properties. Annual Review бактерійної інфекції, зокрема інфекції, викликаної of Immunology, 7, p. 145-173). Традиційно, реакції атиповою Н. influenzae, у ссавців, головним чином, ТН1-типу пов'язані з продукцією INF- і IL-2 цитокіу людей. нів Т-лімфоцитами. Інші цитокіни, часто безпосеВинахід також включає композицію вакцини, редньо пов'язані з індукцією імунних реакцій TH1яка містить імуногенний рекомбінантний поліпептипу, не продукуються Т-клітинами, наприклад, ILтид і/або полінуклеотид за винаходом разом з від12. Навпаки, реакції ТН2-типу пов'язані з секреціповідним носієм, таким як фармацевтично прийняєю IL-4, IL-5, IL-6 i IL-13. тний носій. Оскільки поліпептиди і полінуклеотиди Відомо, що певні вакцинні ад'юванти особливо можуть руйнуватися в шлунку, кожний з них перепідходять для стимуляції цитокінових реакцій або важно вводити парентерально, в тому числі, наТН1, або ТН2-типу. Традиційно, найкращі показниприклад, введенням, яке є підшкірним, внутрішки ТН1:ТН2 балансу імунної реакції після вакцинаньом'язовим, внутрішньовенним або ції або інфекції включають безпосереднє вимірювнутрішньошкірним. Композиції, що підходять для вання продукції ТН1 або ТН2 цитокінів Тпарентерального введення, включають водні і нелімфоцитами in vitro після повторної стимуляції водні стерильні ін'єкційні розчини, які можуть місантигеном, і/або вимірювання lgG1:IgG2a співвідтити антиоксиданти, буфери, бактеріостатичні ношення антиген-специфічних реакцій антитіл. сполуки і розчини, які зберігають ізотонічність Таким чином, ад'ювантом TH1-типу є ад'юскладу з рідиною організму, переважно з кров'ю, вант, який переважно стимулює виділені популяції індивідуума; і водні і неводні стерильні суспензії, Т-клітин до вироблення високих рівнів цитокінів які можуть містити суспендуючі агенти або загусTH1-типу при повторній стимуляції антигеном in ники. Композиції можуть бути представлені в конvitro, і сприяє розвитку як CD8+ цитотоксичних Ттейнерах з однократною дозою або множинними лімфоцитарних, так і антиген-специфічних імуногдозами, наприклад, в герметично закритих ампулобулінових реакцій, пов'язаних з ізотипом TH1лах і флаконах, і можуть зберігатися в ліофілізотипу. ваному вигляді, вимагаючи тільки додавання стеАд'юванти, здатні переважно стимулювати рильного рідкого носія безпосередньо перед ТН1-клітинну відповідь, описані в міжнародній пазастосуванням. тентній заявці № WO 94/00153 і WO 95/17209. Композиція вакцини за винаходом також може 3-Дез-О-ацильований монофосфорилліпід A включати ад'ювантні системи для посилення іму(3D-MPL) являє собою один з таких ад'ювантів. Він ногенності композиції. Бажано, щоб ад'ювантна відомий з GB 2220211 (Ribi). Хімічно цей ад'ювант система індукувала переважно ТН1-тип відповіді. являє собою суміш 3-дез-О-ацильованого моноІмунну відповідь орієнтовно можна розділити фосфорилліпіду А з 4, 5 або 6 ацильованими ланна дві різні категорії, гуморальні або клітинноцюгами, і виробляється компанією Ribi опосередковані імунні реакції (що традиційно хаImmunochem, Montana. Переважна форма 3-дезрактеризуються антитільним і клітинноО-ацильованого монофосфорилліпіду А описана в ефекторними механізмами захисту, відповідно). Ці 37 92782 38 європейському патенті 0689454 В1 (SmithKline му носії. Водним носієм, наприклад, може бути Beecham Biologicals SA). фосфатно-буферний сольовий розчин. Переважно, частинки 3D-MPL є досить дрібОсобливо сильна ад'ювантна композиція, що ними для того, щоб їх можна було стерильно промістить QS21, 3D-MPL і токоферол в емульсії масфільтрувати через мембрану 0,22 мікрон (Євроло-в-воді, описана в WO 95/17210. пейський патент номер 0689454). Хоч винахід був описаний з посиланням на пе3D-MPL буде знаходитися в діапазоні 10 мкг вні поліпептиди і полінуклеотиди білка Е, повинно 100 мкг, переважно 25-50 мкг на дозу, де антиген бути зрозумілим, що він також розповсюджується звичайно буде присутній в діапазоні 2-50 мкг на на фрагменти природних поліпептидів і полінукледозу. отидів, і аналогічні поліпептиди і полінуклеотиди з Інший переважний ад'ювант містить QS21, додатками, делеціями або замінами, які по суті не Hplc-очищену нетоксичну фракцію, отриману з впливають на імуногенні властивості рекомбінанткори Quillaja Saponaria Molina. Необов'язково цей них поліпептидів або полінуклеотидів. Переважні ад'ювант можна змішати з 3-дез-О-ацильованим фрагменти/пептиди описані в Придатні епітопи. монофосфорилліпідом A (3D-MPL), необов'язково Даний винахід також стосується полівалентної разом з носієм. композиції вакцини, що містить композицію вакциСпосіб отримання QS21 описаний в патенті ни по винаходу в поєднанні з іншими антигенами, США № 5057540. зокрема антигенами, придатними для лікування Нереактогенні ад'ювантні композиції, що міссереднього отиту. Така полівалентна композиція тять QS21, були описані раніше (WO 96/33739). вакцини може включати ТН1-індукуючий ад'ювант, Було показано, що такі композиції, що містять як описана вище в цій заявці. QS21 і холестерин, є ад'ювантами, що успішно У переважному варіанті здійснення, поліпепстимулюють ТН1 при складанні в композицію ратиди, фрагменти і імуногени по винаходу складазом з антигеном. ють в композицію з одним або декількома з настуДодаткові ад'юванти, які є селективними стипних груп антигенів: а) одним або декількома муляторами ТН1-клітинної відповіді, включають капсульними полісахаридами пневмокока (або в імуномодулюючі олігонуклеотиди, наприклад, нечистому вигляді, або кон'югованим з білкомметильовані послідовності CpG, описані в WO переносником); b) одним або декількома антиге96/02555. нами, які можуть захищати хазяїна від інфекції М. Комбінації різних ТН1-стимулюючих ад'юванcatarrhalis; с) одним або декількома білковими антів, наприклад, згаданих вище, також розглядатигенами, які можуть захищати хазяїна від інфекції ються як такі, що забезпечують ад'ювант, який є Streptococcus pneumoniae; d) одним або декількоселективним стимулятором ТН1-клітинної відповіма додатковими білковими антигенами атипової ді. Наприклад, QS21 може бути складений в комHaemophilus influenzae; e) одним або декількома позицію разом з 3D-MPL. Співвідношення антигенами, які можуть захищати хазяїна від RSV; QS21:3D- MPL звичайно буде порядку від 1:10 до і f) одним або декількома антигенами, які можуть 10:1; переважно від 1:5 до 5:1 і, часто, в основнозахищати хазяїна від віруса грипу. Переважними є му 1:1. Переважним діапазоном для оптимального комбінації з групами а) і b); b) і с); b), d) і а) і/або с); синергізму є діапазон від 2,5:1 до 1:1 3Db), d), e), f) і а) і/або с). Такі вакцини можуть бути MPL:QS21. переважно використані як універсальні вакцини Переважно носій також присутній в композиції проти середнього отиту. вакцини за винаходом. Носій може являти собою Антигени полісахаридної капсули пневмокока емульсію масло-в-воді або сіль алюмінію, наприпереважно вибирають з серотипів 1, 2, 3, 4, 5, 6В, клад, фосфат алюмінію або гідроксид алюмінію. 7F, 8, 9N, 9V, 10А, 11А, 12F, 14, 15В, 17F, 18С, Переважна емульсія масло-в-воді містить ма19А, 19F, 20, 22F, 23F і 33F (найбільш переважно з сло, що метаболізується, таке як сквален, альфасеротипів 1, 3, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19F і 23F). токоферол і Твін 80. В особливо переважному асПереважними білковими антигенами пневмопекті антиген в композиції вакцини за винаходом кока є ті антигени, які представлені на зовнішній об'єднують з QS21 і 3D-MPL в таку емульсію. Доповерхні пневмокока (здатні розпізнаватися імундатково, емульсія масло-в-воді може містити спан ною системою хазяїна протягом щонайменше час85 і/або лецитин і/або трикаприлін. тини життєвого циклу пневмокока), або білки, які Звичайно для введення людям QS21 і 3D-MPL секретуються або вивільняються пневмококком. буде присутнім у вакцині в діапазоні 1 мкг - 200 Найбільш переважно, білок являє собою токсин, мкг, наприклад, 10-100 мкг, переважно 10 мкг - 50 адгезин, 2-компонентний трансдуктор сигналу, або мкг на дозу. Звичайно масло у воді буде містити ліпопротеїн Streptococcus pneumoniae, або їх фравід 2 до 10% сквалену, від 2 до 10% альфа токогменти. Особливо переважні білки включають, але феролу і від 0,3 до 3% Твіна 80. Переважно, співне тільки, пневмолізин (переважно детоксикований відношення сквален:альфа-токоферол дорівнює хімічною обробкою або мутацією) [Mitchell et al. або менше 1, оскільки таке співвідношення забезNucleic Acids Res. 1990 Jul 11; 18(13): 4010 печує більш стабільну емульсію. Спан 85 також «Comparison of pneumolysin genes and proteins може бути присутнім на рівні 1%. У деяких випадfrom Streptococcus pneumoniae types 1 and 2», ках може бути корисним, щоб вакцини за даним Mitchell et al. Biochim Biophys Acta 1989 Jan 23; винаходом додатково містили стабілізатор. 1007(1): 67-72 «Expression of the pneumolysin gene Нетоксичні емульсії масло-в-воді переважно in Escherichia coli: rapid purification and biological містять нетоксичне масло, наприклад, сквалан або properties», WO 96/05859 (A. Cyanamid), WO сквален, емульгатор, наприклад, Твін 80, у водно90/06951 (Paton et al), WO 99/03884 (NAVA)]; PspA 39 92782 40 і його трансмембранні делеційні варіанти (WO і/або поліпептиди білка Ε для введення в клітину 92/14488; WO 99/53940; US 5804193 - Briles et al.); або в багатоклітинний організм. PspC і його трансмембранні делеційні варіанти Винахід також стосується композицій, що міс(WO 99/53940; WO 97/09994 - Briles et al.); PsaA і тять полінуклеотид і/або поліпептиди, що розгляйого трансмембранні делеційні варіанти (Berry & даються тут, або їх агоністи або антагоністи. ПоліPaton, Infect Immun 1996 Dec; 64(12):5255-62 пептиди і полінуклеотиди за винаходом можуть «Sequence heterogeneity of PsaA, a 37-kilodalton бути використані в комбінації з нестерильним або putative adhesin essential for virulence of стерильним носієм або носіями для використання Streptococcus pneumoniae»); хлорин-зв'язувальні з клітинами, тканинами або організмами, наприбілки пневмокока і їх трансмембранні делеційні клад, фармацевтичним носієм, що підходить для варіанти; СbрА і його тансмембранні делеційні введення індивідууму. Такі композиції містять, наваріанти (WO 97/41151; WO 99/51266); гліцеральприклад, допоміжні засоби або терапевтично ефедегід-3-фосфатдегідрогеназа (Infect. Immun. 1996 ктивну кількість поліпептиду і/або полінуклеотиду 64:3544); HSP70 (WO 96/40928); РсрА (Sanchezза винаходом і фармацевтично прийнятний носій Beato et al. FEMS Microbiol Lett 1998, 164:207-14); або ексципієнт. Такі носії можуть включати, але не М-подібний білок, патентна заявка SB ЕР 0837130; тільки, сольовий розчин, буферний сольовий розі адгезии 18627 (патентна заявка SmithKline чин, декстрозу, воду, гліцерин, етанол і їх комбінаBeecham ЕР 0834568). Додаткові переважні білкові ції. Композиція повинна відповідати способу ввеантигенні пневмокока являють собою антигени, дення. Винахід додатково стосується діагностично описані в WO 98/18931, переважно вибрані в WO і фармацевтичним упаковкам і наборам, що міс98/18930 і PCT/US99/30390. тять один або декілька контейнерів, наповнених Переважними білковими антигенами Moraxella одним або декількома інгредієнтами згаданих виcatarrhalis, які можуть бути включені в комбіновану ще композицій за винаходом. вакцину (головним чином для профілактики сереПоліпептиди, полінуклеотиди і інші сполуки за днього отиту) є: ОМР106 [WO 97/41731 (Antex) і винаходом можуть бути використані окремо або WO 96/34960 (PMC)]; OMP21; LbpA і/або LbpB [WO спільно з іншими сполуками, наприклад, терапев98/55606 (PMC)]; TbpA і/або TbpB [WO 97/13785 і тичними сполуками. WO 97/32980 (PMC)]; CopB [Helminen ME, et al. Фармацевтичні композиції можна вводити (1993) Infect. Immun. 61:2003-2010]; UspAl і/або будь-яким ефективним, зручним способом, в тому UspA2 [WO 93/03761 (University of Texas)]; OmpCD; числі, наприклад, введенням місцевим, пероральHasR (РСТУЕР99/03824); PilQ (PCT/EP99/03823); ним, анальним, вагінальним, внутрішньовенним, OMP85 (PCT/EP00/01468); liро06 (GB 9917977.2); внутрішньоочеревинним, внутрішньом'язовим, lipo10 (GB 9918208.1); lipo11 (GB 9918302.2); lipo18 підшкірним, інтраназальним або внутрішньошкір(GB 9918038.2); P6 (PCT/EP99/03038); D15 ним шляхом, серед іншого. (PCT/EP99/03822); OmplA1 (PCT/EP99/06781); Ніу3 При лікуванні, або як профілактика, активний (РСТ/ЕР99/03257); і OmpE. агент можна вводити індивідууму у вигляді ін'єкПереважні додаткові білкові антигени атипової ційної композиції, наприклад, у вигляді стерильної Haemophilus influenzae, які можуть бути включені в водної дисперсії, переважно ізотонічної. комбіновану вакцину (головним чином для профіУ додатковому аспекті даний винахід стосулактики середнього отиту) включають: білок фімбється фармацевтичних композицій, що містять рин (US 5766608 - Ohio State Research Foundation) терапевтично ефективну кількість поліпептиду і злиті конструкції, що містять пептиди, на його і/або полінуклеотиду, наприклад, розчинну форму основі [наприклад, LB1(f) пептидні злиті конструкполіпептиду і/або полінуклеотиду за даним винації; US 5843464 (OSU) або WO 99/64067]; ОМР26 ходом, пептидного агоніста або антагоніста або [WO 97/01638 (Cortecs)]; P6 [EP 281673 (State дрібномолекулярної сполуки в поєднанні з фармаUniversity of New York)]; білок D (EP 594610); TbpA цевтично прийнятним носієм або ексципієнтом. і/або TbpB; Hia; Hsf; Hin47; Hif; Hmw1; Hmw2; Такі носії включають, але не тільки, сольовий розHmw3; Hmw4; Hap; D15 (WO 94/12641); P2; P5 чин, забуферений сольовий розчин, декстрозу, (WO 94/26304); NlpC2 (BASB205) [WO 02/30971]; воду, гліцерин, етанол і їх комбінації. Винахід доSlp (BASB203) [WO 02/30960]; і iОМР1681 датково стосується фармацевтичних упаковок і (BASB210) [WO 02/34772]. наборів, що містять один або декілька контейнерів, Переважні антигени вірусу грипу включають заповнених одним або декількома інгредієнтами вірус цілком, живий або інактивований вірус, роззгаданих вище композицій за винаходом. Поліпепщеплений вірус грипу, вирощений в яйцях або тиди, полінуклеотиди і інші сполуки за винаходом клітинах MDCK, або клітини Vero або цілі віросоми можуть бути використані окремо або спільно з інгрипу (описані авторами R. Gluck, Vaccine, 1992, шими сполуками, наприклад, терапевтичними 10, 915-920) або їх очищені або рекомбінантні білсполуками. ки, такі як НА, NP, NA, або М-білки, або їх поєдКомпозиції будуть адаптовані до шляху ввенання. дення, наприклад, системного або перорального Переважні антигени RSV (респіраторношляху. Переважні форми системного введення синцитіального вірусу) включають F-глікопротеїн, включають ін'єкцію, звичайно за допомогою внутG-глікопротеїн, HN-білок або їх похідні. рішньовенної ін'єкції. Можуть бути використані інші Композиції, набори і введення ін'єкційні шляхи введення, наприклад, підшкірний, У додатковому аспекті винахід стосується внутрішньом'язовий або внутрішньоочеревинний. композицій, що містять полінуклеотиди білка Ε Альтернативні засоби системного введення включають введення через слизову і через шкіру, вико 41 92782 42 ристовуючи речовини, що проникають, наприклад, ліз ідентичності і подібності, аналіз структури ДНК, солі жовчних кислот або фусидові кислоти або інші РНК і білка, збирання послідовності, кладистичний детергенти. Крім того, якщо поліпептид або інші аналіз, аналіз мотивів послідовності, визначення сполуки за даним винаходом можуть бути складені відкритої рамки зчитування, звернення до нуклеов ентеральну або інкапсульовану композицію, татидних основ, аналіз використання кодонів, вирівкож може бути можливим пероральне введення. нювання нуклеотидних основ, і покроковий аналіз Введення цих сполук також може бути місцевим хроматографічного піка. і/або локалізованим, в формі мазей, паст, гелів, Автоматизований спосіб надається для пророзчинів, порошків і подібного. ведення ідентифікації гомології. Цей спосіб вклюДля введення ссавцям, і, зокрема, людям, очічає стадії: надання першої полінуклеотидної поскується, що рівень щоденної дози активної речолідовності, що містить послідовність вини складе від 0,01 мг/кг до 10 мг/кг, звичайно полінуклеотиду за винаходом на машинозчитуваблизько 1 мг/кг. Лікуючий лікар в будь-якому випальному носії; і порівняння вказаної першої полінудку визначить конкретну дозу, яка буде найбільш клеотидної послідовності щонайменше з однією відповідати для індивідуума, і вона буде залежати іншою полінуклеотидною або поліпептидною посвід віку, маси тіла і реакцій конкретного індивідуулідовністю для ідентифікації гомології. ма. Вказані вище дози ілюструють випадок в сереАвтоматизований спосіб також передбачений дньому. Звичайно, можуть існувати індивідуальні для проведення ідентифікації гомології, вказаний приклади, які заслуговують більш високих або спосіб включає стадії: надання послідовності пербільш низьких інтервалів доз, і вони знаходяться в шого поліпептиду, що містить послідовність поліоб'ємі цього винаходу. пептиду за винаходом на машинозчитувальному Необхідний інтервал доз залежить від вибору носії; і порівняння вказаної першої поліпептидної пептиду, шляху введення, характеру композиції, послідовності щонайменше з однією іншою полінухарактеру стану пацієнта, і рішення лікуючого ліклеотидною або поліпептидною послідовністю для каря. Відповідні дози, однак, знаходяться в діапаідентифікації гомології. зоні 0,1-100 мкг/кг маси тіла пацієнта. Всі публікації і посилання, включаючи, але не Зручно, коли композиція вакцини знаходиться тільки, патенти і патентні заявки, що цитуються в в ін'єкційній формі. Можуть бути використані звицьому описі, включені тут як посилання в повному чайні ад'юванти для посилення імунної відповіді. об'ємі, як якби кожна окрема публікація або посиВідповідна однократна доза для вакцинації станолання була особливо і окремо вказана як включевить 0,5-5 мікрограм антигену на кг, і таку дозу на тут як посилання в повному об'ємі. Будь-яка переважно вводять 1-3 рази і з інтервалом 1-3 патентна заявка, по якій за цією заявкою вимагатижні. З вказаним інтервалом дози не буде споється пріоритет, також включена тут як посилання стерігатися несприятливих токсикологічних ефекв повному об'ємі, описаним вище чином для публітів сполук за винаходом, які могли б перервати їх кацій і посилань. введення відповідним індивідуумам. Визначення Однак, очікується широка різноманітність не«Ідентичність» як відомо в рівні техніки, являє обхідних доз, беручи до уваги різноманітність доссобою схожість між двома або декількома поліпептупних сполук і різну ефективність різних шляхів тидними послідовностями або двома або декільвведення. Наприклад, можна було б чекати, що кома полінуклеотидними послідовностями, в задля перорального введення будуть потрібні більш лежності від конкретного випадку, визначену високі дози, ніж для введення шляхом внутрішньошляхом порівняння послідовностей. У рівні техніки венної ін'єкції. Коливання цих рівнів доз можуть «ідентичність» також означає ступінь спорідненосбути скоректовані за допомогою стандартних емті послідовностей між поліпептидними або полінупіричних методик оптимізації, які широко поширені клеотидними послідовностями, в залежності від в цій галузі. конкретного випадку, визначену комплементарнісБази даних послідовностей, послідовності на тю ланцюгів таких послідовностей. «Ідентичність» матеріальному носії і алгоритми можна легко обчислити за допомогою відомих Полінуклеотидні і поліпептидні послідовності способів, в тому числі, але не тільки, описаними в утворюють цінний інформаційний ресурс, за допо{Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., могою якого визначають їх 2- і 3-мірні структури, а Oxford University Press, New York, 1988; також ідентифікують додаткові послідовності анаBiocomputing: Informatics and Genome Projects, логічної гомології. Ці підходи в найбільшій мірі поSmith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; легшують зберігання послідовності на машинозчиComputer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, тувальному носії і подальше використання A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New збережених даних у відомій програмі для макроJersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular молекулярної структури або для пошуку в базі даBiology, von Heine, G., Academic Press, 1987; і них послідовностей, використовуючи добре відомі Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and інструменти пошуку, такі як програмний пакет Devereux, J., eds., Μ Stockton Press, New York, GCG. 1991; і Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Винахід також стосується способів аналізу хаMath, 48: 1073 (1988). Способи для визначення рактеру послідовностей або ланцюжків, зокрема ідентичності розроблені для надання найбільшого генетичних послідовностей або кодованих білкозбігу послідовностей, що тестуються. Крім того, вих послідовностей. Переважні способи аналізу способи для визначення ідентичності систематипослідовностей включають, наприклад, способи зовані в загальнодоступних комп'ютерних програаналізу гомології послідовностей, наприклад, анамах. Комп'ютерні програми для визначення іден 43 92782 44 тичності між двома послідовностями включають, цього результату з вказаного загального числа але не тільки, програму GAP в програмному пакеті нуклеотидів в SEQ ID NO: 11, або: GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(1): 587 (1984)), BLASTP, BLASTN (Altschul, S.F. nn xn-(xn у), et al., J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990), і FASTA (Pearson and Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85; де nn являє собою число нуклеотидних змін, xn 2444-2448 (1988). Сімейство програм BLAST загаявляє собою загальну кількість нуклеотидів в SEQ льнодоступне на NCBI і з інших джерел (BLAST ID NO: 11, у становить 0,50 для 50%, 0,60 для Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, 60%, 0,70 для 70%, 0,80 для 80%, 0,85 для 85%, MD 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 4030,90 для 90%, 0,95 для 95%, 0,97 для 97% або 410 (1990). Для визначення ідентичності також 1,00 для 100%, і являє собою символ оператора може бути використаний добре відомий алгоритм множення, і де будь-яке не ціле число результату Сміта Ватермана. xn і у округляють в меншу сторону до найбільш Параметри для порівняння поліпептидної посблизького цілого числа до віднімання його з xn. лідовності включають наступне: Зміни полінуклеотидних послідовностей, що кодуАлгоритм: Needleman і Wunsch, J. Mol Biol. 48: ють поліпептиди SEQ ID NO:1-10 можуть створю443-453 (1970) вати нонсенс, місенс мутації або мутації зі зсувом Матриця порівняння: BLOSSUM62 від Henikoff рамки зчитування в цій кодуючій послідовності і, and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915тим самим, змінювати поліпептид, що кодується 10919 (1992) полінуклеотидом після таких змін. Штраф за розрив: 8 Як приклад, полінуклеотидна послідовність за Штраф за довжину розриву: 2 даним винаходом може бути ідентична еталонним Програма, що використовується з цими парапослідовностям SEQ ID NO: 11, тобто вона може метрами, є загальнодоступною як програма «gap» бути 100% ідентичною, або вона може містити від Genetics Computer Group, Madison WL Вищезазміни нуклеїнової кислоти аж до певного цілого значені параметри являють собою параметри за числа, в порівнянні з еталонною послідовністю, умовчанням для порівнянь пептидів (нарівні з відтак, що процент ідентичності складає менше за сутністю штрафу за кінцеві розриви). 100%. Такі зміни вибрані з групи, що складається Параметри для порівняння полінуклеотидів щонайменше з однієї нуклеотидної делеції, заміни, включають наступне: включаючи транзицію і трансверсію, або вставки, і Алгоритм: Needleman і Wunsch, J. Mol Biol. 48: де вказані зміни можуть зустрічатися в 5'- або 3'443-453 (1970) кінцевих положеннях еталонної нуклеотидної посМатриця порівняння: відповідності=+10, невідлідовності або в будь-якому місці між цими кінцеповідності=0 вими положеннями, розсіяні або окремо серед Штраф за розрив: 50 нуклеотидів в еталонній послідовності, або в одній Штраф за довжину розриву: 3. або декількох суміжних групах в межах еталонної Доступний як: програма «gap» від Genetics послідовності. Число змін в нуклеїновій кислоті Computer Group, Madison WI. Це параметри за для заданого процента ідентичності визначається умовчанням для порівнянь нуклеїнових кислот. множенням загального числа нуклеїнових кислот в Переважні значення «ідентичності» для поліSEQ ID NO: 11 на ціле число, що визначає пронуклеотидів і поліпептидів, в залежності від конкцент ідентичності, розділене на 100, а потім відніретного випадку, представлені нижче в пунктах (1) манням цього результату з вказаного загального і (2). числа нуклеїнових кислот в SEQ ID NO: 11, або: (1) Полінуклеотидні варіанти здійснення додатково включають виділений полінуклеотид, що nn xn-(xn у), містить полінуклеотидну послідовність, що має щонайменше 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 або де nn являє собою число змін в нуклеїновій ки100% ідентичність з еталонною послідовністю SEQ слоті, хп являє собою загальне число нуклеїнових ID NO: 11, де вказана полінуклеотидна послідовкислот в SEQ ID NO: 11, у становить, наприклад, ність може бути ідентичною еталонній послідовно0,70 для 70%, 0,80 для 80%, 0,85 для 85% і т.д., сті SEQ ID NO: 11 або може включати нуклеотидні являє собою символ оператора множення, і будьзміни аж до певного цілого числа в порівнянні з яке не ціле число результату xn і у округляють в еталонною послідовністю, де вказані зміни вибрані меншу сторону до найбільш близького цілого чисз групи, що складається щонайменше з однієї нукла до віднімання його з xn. леотидної делеції, заміни, включаючи транзицію і (2) Поліпептидні варіанти здійснення додаткотрансверсію, або вставки, і де вказані зміни мово включають виділений поліпептид, що містить жуть зустрічатися в 5'- або 3'-кінцевих положеннях поліпептид, що має щонайменше 50, 60, 70, 80, 85, еталонної нуклеотидної послідовності або в будь90, 95, 97 або 100% ідентичність з поліпептидною якому місці між цими кінцевими положеннями, розеталонною послідовністю SEQ ID NO:1-10, де вкасіяні або окремо серед нуклеотидів в еталонній зана поліпептидна послідовність може бути іденпослідовності, або в одній або декількох суміжних тичною еталонній послідовності SEQ ID NO:1-10 групах в межах еталонної послідовності, і де вкаабо може містити амінокислотні зміни, аж до певзане число нуклеотидних змін визначається мноного числа, в порівнянні з еталонною послідовнісженням загальної кількості нуклеотидів в SEQ ID тю, де вказані зміни вибрані з групи, що складаNO: 11 на ціле число, що визначає процент іденється щонайменше з однієї амінокислотної тичності, розділений на 100, а потім відніманням делеції, заміни, включаючи консервативну і некон 45 92782 46 сервативну заміну, або вставки, і де вказані зміни «Виділений» означає перетворений «руками можуть зустрічатися в аміно- або карбоксикінцевих людини» з його природного стану, тобто якщо зуположеннях еталонної поліпептидної послідовносстрічається в природі, його змінили або видалили ті або в будь-якому місці між цими кінцевими поз вихідного оточення, або і те, й інше. Наприклад, ложеннями, розкидані або окремо серед амінокисприродний полінуклеотид або поліпептид живого лот в еталонній послідовності, або в одній або організму не є «виділеним», але той же полінукледекількох суміжних групах в межах еталонної посотид або поліпептид, відділений від співіснуючих з лідовності, і де вказане число амінокислотних змін ним речовин його природного оточення, є «видівизначається множенням загального числа аміноленим», як цей термін використовується в контекскислот в SEQ ID NO:1-10 на ціле число, що визнаті даного винаходу. Крім того, полінуклеотид або чає процент ідентичності, розділене на 100, а пополіпептид, який введений в організм шляхом тратім відніманням цього результату з вказаного нсформації, генетичного впливу або будь-яким загального числа амінокислот в SEQ ID NO:1-10, іншим рекомбінантним способом, є «виділеним», відповідно, або: навіть якщо він все-таки присутній у вказаному організмі, який може бути живим або неживим. «Полінуклеотид(и)» в основному стосується na xa-(xa у), будь-якого полірибонуклеотиду або полідезоксирибонуклеотиду, який може являти собою немоде na являє собою число амінокислотних змін, дифіковану РНК або ДНК або модифіковану РНК ха являє собою загальне число амінокислот в SEQ або ДНК, включаючи односпіральні і двоспіральні ID NO:1-10, у становить 0,50 для 50%, 0,60 для ділянки. 60%, 0,70 для 70%, 0,80 для 80%, 0,85 для 85%, «Варіант» стосується полінуклеотиду або по0,90 для 90%, 0,95 для 95%, 0,97 для 97% або ліпептиду, який відрізняється від еталонного полі1,00 для 100%, і являє собою символ оператора нуклеотиду або поліпептиду, але зберігає необхідмноження, і будь-яке не ціле число результату ха і ні властивості. Звичайний варіант полінуклеотиду у округляють в меншу сторону до найбільш близьвідрізняється по нуклеотидній послідовності від кого цілого числа до віднімання його з ха. іншого, еталонного поліпептиду. Зміни в нуклеотиЯк приклад поліпептидна послідовність за дадній послідовності варіанту можуть змінювати або ним винаходом може бути ідентична еталонній можуть не змінювати амінокислотну послідовність послідовності SEQ ID NO:1-10, тобто вона може поліпептиду, що кодується еталонним поліпептибути 100% ідентичною, або вона може містити дом. Нуклеотидні зміни можуть приводити до аміамінокислотні зміни, аж до певного числа, в порівнокислотних замін, додатків, делецій, злиття і усінянні з еталонною послідовністю, так, що процент кання в поліпептиді, що кодується еталонною ідентичності складає менше за 100% ідентичності. послідовністю, як розглянуто нижче. Звичайний Такі зміни вибрані з групи, що складається щонайваріант поліпептиду відрізняється за амінокислотменше з однієї амінокислотної делеції, заміни, ною послідовністю від іншого, еталонного поліпепвключаючи консервативну і неконсервативну замітиду. В основному, відмінності обмежені таким ну, або вставки, і де вказані зміни можуть зустрічачином, що послідовності еталонного поліпептиду і тися в аміно- або карбоксикінцевих положеннях варіанту загалом дуже схожі і, в багатьох обласеталонної поліпептидної послідовності або в будьтях, ідентичні. Варіант і еталонна послідовність якому місці між цими кінцевими положеннями, розможуть відрізнятися за амінокислотною послідовкидані або окремо серед амінокислот в еталонній ністю однією або декількома замінами, додатками, послідовності, або в одній або декількох суміжних делеціями в будь-якому поєднанні. Замінений або групах в межах еталонної послідовності. Число вставлений амінокислотний залишок може кодуваамінокислотних змін для заданого % ідентичності тися або може не кодуватися генетичним кодом. визначається множенням загального числа аміноВаріант полінуклеотиду або поліпептиду може кислот в SEQ ID NO:1-10 на ціле число, що визнабути природним, наприклад, алельним варіантом, чає процент ідентичності розділене на 100, а потім або може бути варіантом, який не відомий в привідніманням цього результату з вказаного загальроді. Неприродні варіанти полінуклеотидів і поліного числа амінокислот в SEQ ID NO:1-10, або: пептидів можуть бути отримані методиками мутагенезу або прямим синтезом. na xa-(xa у), «Захворювання» означає будь-яке захворювання, викликане або що належить до бактеріальде na являє собою число амінокислотних змін, ної інфекції, в тому числі, наприклад, середній ха являє собою загальне число амінокислот в SEQ отит у новонароджених і дітей, пневмонія у людей ID NO:1-10, у становить, наприклад, 0,70 для 70%, похилого віку, синусит, внутрішньолікарняні інфек0,80 для 80%, 0,85 для 85% і т.д., а являє собою ції і інвазивні захворювання, хронічний середній символ оператора множення, і будь-яке не ціле отит з втратою слуху, накопичення рідини в серечисло результату ха і у округляють в меншу стородньому вусі, пошкодження слухового нерва, уповіну до найбільш близького цілого числа до віднільнене вивчення мови, інфекція верхніх дихальних мання його з ха. шляхів і запалення середнього вуха. «Індивідуум(и)» в контексті даного винаходу з Експериментальна частина посиланням на організм, означає багатоклітинний Наведені нижче приклади виконуються з викоеукаріот, в тому числі, але не тільки, багатоклітинристанням стандартних методик, які добре відомі і ну тварину, ссавця, ovid і велику рогату худобу, є загальноприйнятими у фахівців в даній галузі, за мавпу, примата і людину. винятком того, що описано детально. Приклади є 47 92782 48 такими, що ілюструють, а не такими, що обмежуконцентрували на дискових мембранах ΥΜ100 ють винахід. (виключення молекулярної маси 10000; Amicon, Дане дослідження описує виділення, очищенBeverly, MA). ня, характеристику, клонування і експресію нового SDS-PAGE і виявлення білків на мембранах білка зовнішньої мембрани Н. influenzae, названо(Вестерн-блот) го білком Ε (рЕ), і нового зрізаного рекомбінантноSDS-PAGE проводили при постійному напруго рЕ(А), який був виявлений з використанням женні 150, використовуючи 10% Трис гелі з рухливим буфером (MES), буфером для зразка (LDS), і IgD( ) сироватки при мієломі людини. буфером для блотингу, а також засоби для блотиМатеріали і методи нгу від Novex (San Diego, CA). Зразки рівномірно Реактиви нагрівали при 100°С протягом 10 хв. Гелі забарвШтами МіnnА і ΝΤΗi3655 Н. Influenzae, тип b, лювали Кумасі діамантовим блакитним R-250 (13; були люб'язно надані Robert S. Munson Jr. Bio-Rad, Sundbyberg, Sweden). Електрофоретичне (Washington University School of Medicine (St. Louis, перенесення білкових смуг з гелю на мембрану Mo)). Штам ΝΤΗi772 атипової Н. influenzae був імунобілон-Р (Millipore, Bedford, MA) здійснювали виділений клінічно з культури носоглоткового мазпри 30 В протягом 2-3 год. Після перенесення ка в департаменті (2). Ряд різних видів мембрану імунобілон-Р блокували в PBS з 0,05% Haemophilus також був проаналізований і описаТвіном 20 (PBS-Tween), що містить 5% сухого моний в Таблиці 1. IgD( ) цільної сироватки IgDлока. Після декількох промивань в PBS-Tween, мієломи людини купували у The Binding Site мембрану інкубували з очищеним білком IgD(Birmingham, England). Для отримання специфічної мієломи (0,5 мкг/мл, IgD( ) мієломи людини; The анти-рЕ антисироватки, кроликів імунізували внутBindingsite) в PBS-Tween, що включає 2% сухого рішньом'язово 200 мкг рекомбінантного pE22-160 молока, протягом 1 год. при кімнатній температурі. [pE(A)] емульгованого в повному ад'юванті ФрейнHRP-кон'юговані козячі антитіла до IgD людини, да (Difco, Becton Dickinson, Heidelberg, Germany), розбавлені 1/1000 додавали після декількох проабо пептидом рЕ41-68, кон'югованим з гемоціанімивань в PBS-Tween. Після інкубації протягом 40 ном лімфи равлика (KLH), і ревакцинували на 18 і хв. при кімнатній температурі і декількох додатко36 день такою ж дозою білка в неповному ад'ювавих промивань в PBS-Tween, проводили виявленнті Фрейнда. Кров брали через 2-3 тижні. Отримані ня з використанням проявних реактивів ECL для в результаті поліклональні антитіла виділяли з Вестерн-блотингу (Amersham Pharmacia Biotech, допомогою афінної хроматографії, використовуюUppsala, Sweden). чи рЕ(А) або специфічний пептид рЕ (рЕ41-68), Двомірний електрофорез в SDSкон'югований з СnВг-сефарозою (11). Козячі антиполіакриламідному гелі 2-D PAGE) і Вестернтіла до IgD людини, кон'юговані з пероксидазою блотинг хрону (HRP), були з Biosource (Camarillo, CA). КроПісля іонобмінної хроматографії, Empigen лячі pAb до IgD людини були з Dakopatts (Gentofte, Denmark). екстракти Н. influenzae (MinnA) піддавали ізоелекМишачі поліклональні імуноглобуліни до IgD тричному фокусуванню (IEF), використовуючи сислюдини, кон'юговані з флуоресцеїнізотіоціанатом тему IPGphor IEF System (Amersham Pharmacia (FITC), кролячі поліклональні імуноглобуліни до Biotech) (5, 12). Для калібрування гелю використали стандарт (номер в каталозі 161-0320; Bio-Rad). легких ланцюгів ( і ) людини, кон'юговані з HRP, 2-D поліакриламідні гелі піддавали електроблотиFITC-кон'юговані антикролячі поліклональні імунонгу на фільтри Immobilon-PVDF (0,45 мм; Millipore, глобуліни свині купували у Dakopatts. Bedford, US) при 120 мА протягом ночі. Після наЕкстракція і очищення білка Ε сичення, стадії інкубації, блокування і промивання Η. influenzae тип b (MinnA) вирощували протяпроводили, як описано вище. гом ночі в бульйоні з серцево-мозковим екстракАналіз амінокислотної послідовності том (ВНІ) (Difco Laboratories, Detroit, Mich.), доповАвтоматизований аналіз амінокислотної посненим NAD і геміном (Sigma, St. Louis, MO), лідовності проводили з допомогою Applied кожного по 10 мкг/мл. Після двох промивань бакBiosystems (Foster City, CA) 470A газорідинного терії екстрагували в 0,05 Μ Трис-НСІ-буфері (рН твердофазного секвенатора. 8,8), що містить 0,5% Empigen (Calbiochem Конструювання геномної бібліотеки Η. Novabiochem, Bedford, MA). Бактерійну суспензію influenzae перемішували магнітною мішалкою протягом 2 Хромосомну ДНК отримували з штаму 772, вигод. при 37°С. Після центрифугування при 8000 g користовуючи модифікацію способу Berns і протягом 20 хв. при 4°С, супернатант фільтрували Thomas (2, 13). Коротко, геномну бібліотеку Н. з використанням стерильного фільтра (0,45 мкм; influenzae 772 конструювали з 40 мкг ДНК, яка буSterivex-HV, Millipore). Екстракт Η. influenzae в ла частково розщеплення Sau3A протягом 1 год. 0,5% Empigen наносили на колонку з QРозщеплену ДНК фракціонували на градієнті сасефарозою (Amersham Pharmacia Biotech), урівнохарози (14). Фракції, що містять фрагменти ДНК важеною 0,05 Μ Трис-НСІ (рН 8,8), що містить 6 Μ відповідних розмірів (від 2 до 7 т.н.п.), об'єднувасечовини. Колонку елюювали з використанням ли, і ДНК лігували в pUC18, розщеплену ВатНІ, з лінійного градієнта NaCl від 0 до 1 Μ в тому ж буподальшою трансформацією в Escherichia coli фері. Фракції, які були виявлені за допомогою JM83 шляхом електропорації, використовуючи lgD( ) мієломної сироватки, об'єднували, діалізуGene pulser (Bio-Rad, Richmond CA). Бактерії вмівали в мембранних трубках Spectraphor (виклющували на агар LB, доповнений ампіциліном і Xчення молекулярної маси 6-8000; Spectrum, Laguna hills, CA) проти 0,05 Μ Трис-НСІ, рН 8,8, і 49 92782 50 для сиквенсової реакції BigDye Terminator Cycle Gal (5-бром-4-хлор-3-індоліл- -DSequencing v. 2.0 Ready (Perkin-Elmer, Foster City, галактопіранозид). Ca). Імуноаналіз колоній, виділення і секвенування Для отримання рекомбінантних білків бактерії ДНК вирощували до середини фази логарифмічного Трансформанти Е. coli, культивовані протягом росту (OD600 від 0,6 до 0,8) з подальшою індукцією ночі на агарі LB, переносили на нітроцелюлозні з використанням 1 мл ізопропіл-1-тіо- -Dфільтри (Sartorius, Gottingen, Germany) шляхом покриття поверхонь агару сухими фільтрами. Чашгалактозиду (IPTG), що приводило до гіперекспреки залишали на 15 хв., і клітини лізували, піддаючи сії ре(А). Коли OD600 досягала 1,5-1,7, бактерії впливу насичених пар хлороформу протягом 20 збирали і виділяли тільця включення, використохв. Білок-зв'язувальні ділянки, що залишилися на вуючи стандартний протокол. Рекомбінантні білки фільтрах, блокували інкубуванням фільтрів в збаможуть бути додатково очищені з допомогою лансованому Трис сольовому розчині, що містить афінної хроматографії з використанням нікелієвих овальбумін (50 мМ Трис-гідрохлорид, 154 мМ колонок. Потім проводили аналіз очищених рекоNaCl, 1,5% овальбумін [рН 7,4]) протягом 30 хв. мбінантних білків в SDS-PAGE. Очищення ДНК Н. influenzae, умови ПЛР і секПісля блокування фільтри інкубували з IgD( ) лювенування дини протягом 30 хв. Поліклональні антитіла до Геномну ДНК з клінічних штамів Н.influenzae IgD людини, кон'юговані з HRP, додавали після виділяли з використанням набору DNeasy Tissue промивань, і фільтри інкубували протягом 30 хв. (Qiagen, Hilden, Germany). Taq ДНК-полімераза Всі інкубації проводили при кімнатній температурі. була виробництва Roche (Mannheim, Germany), а В кінці, фільтри проявляли, використовуючи 4умови проведення ПЛР відповідали рекомендовахлор-1-нафтол і Н2О2. Позитивні клони збирали, і ним фірмою-виробником. Для виділення гена рЕ ДНК плазміди pUC18, що містить геномну ДНК використовували пару праймерів 5'NTHi772, очищали. Отриману в результаті вставку gcatttattaggtcagtttattg-3' і 5'-gaaggattatttctgatgcag-3', ДНК NTHi772 секвенували, використовуючи фланякі випалюються з фланкуючими генами НІ0177 і куючі праймери М13+ і М13- і набір для сиквенсоНІ0179, відповідно. Послідовності отриманих прової реакції BigDye Terminator Cycle Sequencing ν. дуктів ПЛР (948 п.н.) визначали за допомогою кро2.0 Ready (Perkin-Elmer, Foster City, Ca). Отримана кової полімеразної ланцюгової реакції цільового вставкова послідовність (3,55 т.н.п.) відповідала гена з використанням вищезгаданих праймерів в ділянці, що містить ДНК, що кодує білки НІ0175, доповнення до праймерів 5'-cttgggttacttaccgcttg-3' і НІ0176, НІ0177 і, нарешті, НІ0178 (15). 5'-gtgttaaacttaacgtatg-3'. Капілярний електрофорез Клонування ДНК і експресія білка проводили на приладі Beckman CEQ 2000 з викоВсі конструкції були розроблені з використанристанням набору Dye-terminator cycle sequencing ням фрагментів, ампліфікованих в результаті ПЛР. (CEQ DTCS kit, Beckman Coulter, Stockholm, Як матрицю використовували pUC18, що містить Sweden). Обробку і вирівнювання отриманих посгеномну ДНК NTHi 772 (с НI0175 по НI0178). Taq лідовностей ДНК здійснювали з використанням ДНК-полімераза була виробництва Roche PHRED (CodonCode, Deadham, USA) і (Mannheim, Germany), умови проведення ПЛР відSEQUENCHER (MedProbe, Oslo, Norway). повідали рекомендованим фірмою-виробником. Отримання Η. influenzae з дефіцитом pE (NTHi Були клоновані відкриті рамки зчитування чотирьох передбачених білків з НІ0175 по НІ0178, але 3655 pe) сюди включена тільки методика, що описує процес Як матрицю використовували геномну ДНК, клонування HID (HI0178). рЕ22-160 [позначений виділену з NTHi 772. 5'- і 3'-кінці гена ре, що місрЕ(А)] позбавляли ендогенного сигнального пептять частини генів НІ0177 і НІ0179, були ампліфітиду, в тому числі амінокислотного залишку глутаковані як дві касети (815 н.п. і 836 н.п., відповідно) міну21, і ампліфікували за допомогою ПЛР з викоз використанням ДНК-полімерази DyNAzyme II ристанням праймерів 5'(Finnzymes, Espoo, Finland), вводячи сайти для ctcaggatccaaaggctgaacaaaatgatgtg-3' і 5'ферментів рестрикції Xhol і EcoRI, відповідно, ggtgcagattaagcttttttttatcaactg-3', що вводять сайти EcoRI і SpEI в доповнення до специфічних захопдля ферментів рестрикції ВатНІ і Hindlll. Для злитлюючих послідовностей в цих двох касетах (18). тя 6 залишків гістидину, що кодуються цим експреОтримані фрагменти ПЛР були розщеплені і клосуючим вектором, стоп-кодон рЕ22-160 був видозміновані в pBluescript SK (+/-). Касета гена стійкості нений. Отриману відкриту рамку зчитування гена до канаміцину (1282 н.п.) була отримана з pUC4K з рЕ розміром 417 н.п. лігували в рЕТ26(+) використанням сайта ферменту рестрикції EcoRI. (Novagen, Darmstadt, Germany). Щоб уникнути моПісля розщеплення, продукт ПЛР лігували в прожливої токсичності, отримані в результаті плазміди цесований фрагмент гена ре, що включає частини спочатку трансформували в хазяїні Е. coli DH5 . генів НІ0177 і НІ0179. Штами Н. influenzae Eagan і Потім плазміди, що кодують рЕ і рЕ(А), трансфорRM804 були трансформовані відповідно до методу мували в експресуючому хазяїні BL21(DE3). У доM-IV, описаного Heriott et al. (19). Отриманих мутаповнення до повнорозмірних рЕ і рЕ(А), були нтів перевіряли з допомогою ПЛР, і експресію рЕ отримані послідовності процесованих варіантів рЕ. аналізували з допомогою Вестерн-блотингу і проСхема подана на Фіг. 8. Для всіх конструкцій викоточною цитометрією. ристовували праймери, що містять в собі сайти Програмне забезпечення для молекулярної рестрикції для ВатНІ і Hindlll. Процедури для пробіології цесованих варіантів були описані вище. Всі консОтримані послідовності порівнювали з наявтрукції були секвеновані з використанням набору ним геномом Н. influenzae KW20 51 92782 52 (http://www.tigr.org) (15). Сигнальний пептид був Оскільки автори винаходу не могли виявити встановлений з допомогою SignalP VI. 1 World якого-небудь білка в 2-D аналізі після розділення, Wide Web Prediction Server Center for Biological була сконструйована ДНК бібліотека Н. influenzae, Sequence Analysis (http://www.cbs.dtu.dk/services/ з використанням атипової H. influenzae (NTHi), SignalP/) (16). Профіль гідрофобності рЕ аналізуштам 772. Геномну ДНК, що містить фрагменти в вали способом по Kyte і Doolittle (17). інтервалі від 2 до 7 т.п.н., лігували в pUC18 з поТварини, хірургічні процедури і щуряча модель дальшою трансформацією в Е. coli JM83. Транссереднього отиту форманти аналізували на зв'язування з IgD, викоВикористовували здорових самців щурів ристовуючи імуноаналіз колоній, що складається з Sprague-Dawley, масою 200-250 г. До операції у IgD( ) людини і поліклональних антитіл до IgD лювсіх тварин були відсутні інфекційні захворювання дини, кон'югованих з HRP. Було виявлено три посереднього вуха за даними отомікроскопії. При зитивні колонії з 20000 колоній, що тестуються, і їх втручаннях щурів анестезували метогекситалом піддавали другому раунду скринінгу з lgD( ). Авто(Brietalo, Elli Lilly and Company, Indianapolis, IN) ри винаходу секвенували один з позитивних клонів внутрішньовенно або хлоралгідратом і виявили 3,55 т.н. вставку, що містить ДНК, що (apoteksbolaget, Lund, Sweden) внутрішньоочерекодує чотири білки з НІ0175 по НІ0178 відповідно винно. Бактерії для експериментів з тваринами до фізичної карти Н. influenzae KW20 (15). Для вирощували, як описано вище. Після збору подальшого підтвердження специфічної взаємодії центрифугуванням, бактерії ресуспендували в з lgD( ), вибраний трансформант також аналізувасвіжому культуральному середовищі до концентли з допомогою проточної цитометрії. Як видно на рації 2 1010 колонієутворювальних одиниць (КУО) Фіг. 2В, Е. coli JM83, що містить геномну ДНК Н. як для NTHi 3655, так і для відповідного мутанта influenzae 772, що відповідає послідовності, що рЕ. До використання препарати тримали на льоду. кодує НІ0175 - НІ0178 була виявлена з допомогою Для індукції гострого середнього отиту (АОМ), сеIgD( ) в порівнянні з негативною контрольною Е. реднього вуха досягали вентральним серединним coli, трансформованою тільки пустим вектором розрізом на шиї, і приблизно 0,05 мл бактерійної (Фіг. 2А). суспензії вводили по краплях в порожнину середУ доповнення до аналізу клону Е. coli JM83, нього вуха. Отомікроскопію проводили на 3 і 5 чотири білки H. influenzae (НІ0175 - НІ0178) клонудень після операції. Середній отит з гнійним ексували в експресійний вектор рЕТ26(+) і продукувадатом, тобто непрозорим ексудатом і часто різко ли в Е. coli BL21DE3. Отримані в результаті рековираженим розширенням судин на 3 день, називамбінантні білки аналізували з використанням ли АОМ. IgD( ) на Вестерн-блотах, і було виявлено, що Результати НІ0178 є єдиним білком, який виявляється з допоЕкстракція і розділення білка Н. influenzae могою IgD( ) (дані не показані). (рЕ), виявленого за допомогою IgD( ) сироватки Мутацію атипової Н. influenzae (NTHi 3655) при мієломі проводили шляхом введення касети з геном резиРаніше вважалося, що атипова Н. influenzae стентності до канаміцину в ген, що кодує рЕ. (NTHi) не зв'язується з IgD (19), тоді як інкапсульоОтримані в результаті мутанти підтверджували з вана Н. influenzae міцно зв'язується з IgD. Автори допомогою ПЛР, і відсутність експресії рЕ перевівинаходу встановили, що IgD( ) сироватки при ряли аналізом білків зовнішньої мембрани в Весмієломі специфічно зв'язується також з NTHi. Хатерн-блотах, використовуючи специфічну анти-рЕ рактерний профіль NTHi772 за даними проточної антисироватку (дані не показані). Мутант NTHi цитометрії поданий на Фіг. 1. Сильний зсув і під3655 pe також тестували з допомогою проточної вищена флуоресценція були виявлені в присутноцитометрії, і явно знижена флуоресценція була сті мієломного білка lgD( ) в порівнянні з контровиявлена з цим мутантом в порівнянні з відповідлем без IgD. ною NTHi 3655 дикого типу при аналізуванні з кроДля ретельного аналізу білка зовнішньої мемлячою анти-рЕ моновалентною антисироваткою і брани Н. influenzae, який був виявлений з допомоFITC-кон'югованими козячими антикролячими втогою IgD( ) мієломи, фракцію зовнішньої мембрани ринними pAb (Фіг. 2C i D). солюбілізували в детергенті Empigen . На Фіг. 1В Білок Е був виявлений у всіх Н. influenzae, непоказано, що дуже сильна IgD-зв'язувальна активзважаючи на те, що інші підвиди були негативними ність була отримана на Вестерн-блотах для білка Для аналізу експресії рЕ клінічних ізолятів і із середньою молекулярною масою приблизно 16 типу штамів NTHi, автори винаходу розробили кДа. Однак, помітної смуги білка, що відповідає прямий аналіз зв'язування з допомогою проточної IgD-зв'язувальній активності, не могло бути виявцитометрії, що складається з сироваткового lgD( ) лено при фарбуванні SDS-PAGE Кумасі діамантоі FITC-кон'югованого вторинного антитіла, направвим блакитним. Після розділення на колонці з Qленого проти IgD людини. У вихідних експерименсефарозою, той же екстракт зовнішньої мембрани тах, бактерії, зібрані в різні моменти часу, аналізунаносили на 2-мірний гель-електрофорез і забарвали на експресію рЕ. Відмінностей відносно влювали сріблом (Фіг. 1С). Одночасно проводили експресії рЕ між фазою логарифмічного росту або відповідний Вестерн-блотинг, зондований IgD( ) стаціонарною фазою не спостерігалося, що вказує людини. Область, де знаходився рЕ, могла, отже, на те, що поверхневий рЕ NTHi не залежав від бути охоплена. Однак, видимого білка не спостеріфази росту. Бактерії в стаціонарній фазі, таким галося (Фіг. 1С). чином, були використані у всіх подальших аналіКлонуеання білка Е і отримання мутанта атизах. Була проаналізована середня інтенсивність пової Н. influenzae, позбавленого рЕ 53 92782 54 флуоресценції (mfi) на бактеріальну клітину, і всі ючого антитіла (Таблиця 1). У цих експериментах 22 штами NTHi були включені в це дослідження. не було виявлено відмінностей між гемофільними Інтенсивність флуоресценції варіювала між різништамами з високою і низькою експресією, тобто в ми штамами NTHi, проте рЕ був виявлений у біВестерн-блотах у всіх штамів демонструвалася льшості NTHi в цьому конкретному дослідженні з однакова інтенсивність рЕ і в тому ж положенні, що відповідає 16 кДа. Інкапсульована Н. influenzae використанням IgD( ) мієломної сироватки як де(тип з а по f) також експресувала рЕ по даним Вестектуюче антитіло (Фіг. 3). терн-блотів (Таблиця 1). Наприклад, експресію рЕ В інших експериментах специфічні кролячі ану чотирьох Н. influenzae капсула типу b (Hib) порівтитіла до рЕ використовували для виявлення понюють з NTHi на Фіг. 4. Н. aegypticus і Н. верхневого рЕ. Специфічна анти-рЕ антисироватhaemolyticus експресували рЕ (Таблиця 1), тоді як ка специфічно розпізнавала рЕ також у для інших споріднених гемофільних видів, які є інкапсульованих штамів Н. influenzae, Η. негативними в проточній цитометрії (Фіг. 3), в Весaegypticus, і Η. haemolyticus (дані не показані). терн-блот аналізах не було виявлено рЕ. СпециДля додаткового аналізу рівнів експресії рЕ, фічна анти-рЕ антисироватка специфічно розпіекстракти зовнішньої мембрани різних гемофільзнавала рЕ також у інкапсульованих штамів (дані них видів, оброблені Empigen , тестували в Весне показані). терн-блотингу з використанням IgD( ) як детекту 55 Рекомбінантно отриманий рЕ22-160 [рЕ(А)] виявляється з допомогою IgD( ) У первинних експериментах автори намагалися рекомбінантно отримати рЕ, але були отримані 92782 56 тільки незначні концентрації. Для максимального збільшення виходу білка був сконструйований зрізаний фрагмент рЕ, що складається з амінокислотних залишків з лізину 22 до лізину 160. N-кінцевий 57 92782 58 сигнальний пептид, що включає амінокислоту глулює між залишками ізолейцин 20 і глутамін 21 (38). тамін 21 був таким чином видалений і замінений Одночасно профіль гідрофобності HID (39) покалідерним пептидом на додаток до дев'яти залишзує, що рЕ має гідрофобний сигнальний пептид, ків, що походять з вектора рЕТ26(+) (Фіг. 5А). Зрітоді як залишок молекули головним чином є гідзаний рЕ22-160 був позначений рЕ(А) (Фіг. 5В). рофільним (Фіг. 7). Для підтвердження того, що рекомбінантний білДля ретельного визначення сайту розщепленковий продукт відповідав рЕ «дикого типу», рекомня сигнальної пептидази, рекомбінантний повнобінантно експресований рЕ(А) разом з рЕ, виділерозмірний рЕ піддавали руйнуванню по Едману. ним з NTHi 772, аналізували з допомогою SDSОднак, амінокінець поліпептидного ланцюга рЕ, PAGE і Вестерном-блоту, використовуючи як зонд ймовірно був заблокований. Можливим поясненням цього порушення могло бути те, що перша IgD( ). Як показано на Фіг. 5D, рекомбінантний амінокислота була піроглутамілом, як раніше опирЕ(А) значною мірою відповідав рЕ дикого типу по сано для сімейства білків М. catarrhalis UspA (11). даним SDS-PAGE. Крім того, рЕ(А), отриманий в Однак, спроби видалити цей передбачуваний заЕ. coli, можна було визначити аж до 0,01 мкг з долишок з допомогою піроглутаматамінопептидази помогою IgD( ) антисироватки (Фіг. 5Е). виявилися невдалими. На відміну від повнорозмірЕ(А) використовували для імунізації кроликів і рного рЕ1-160, N-кінцева послідовність для рЕ(А) після завершення схеми імунізації, як описано де(рЕ22-160), що не має ендогенного сигнального тально в розділі Матеріали і методи, анти-рЕ анпептиду Н. influenzae (Фіг. 5), була з успіхом охатисироватку очищали на колонці, що складається рактеризована за допомогою руйнування по Едз розрахованого імунодомінантного пептиду (аміману, і було виявлено, що вона містить передбанокислоти рЕ41-68). Отримані в результаті антитічувану векторну послідовність, тобто сигнальна ла виразно виявляли рЕ як на поверхні бактерій пептидаза в Е. coli розщеплювала в правильному (Фіг. 2С), так і на Вестерн-блотах (не показано). положенні (Фіг. 5А). ДНК послідовність гена білка є і відкрита рамБілок Ε секвенували в серії різних видів ка зчитування Haemophilus, в тому числі NTHi і інкапсульованій ДНК і амінокислотна послідовність рЕ1-160 з Н. influenzae (Таблиця 1). Цікаве те, що рЕ був штаму NTHi 772 наведена на Фіг. 6. Відкрита рамнадзвичайно консервативним. Тільки деякі амінока зчитування (ORF) складає в довжину 160 амінокислоти зазнали точкових мутацій, і вони мутували кислот, і передбачуваний сигнальний пептид має в більшості штамів, слідуючи певній системі (Фіг. 6 довжину 20 амінокислот. Комп'ютерний аналіз вкаі Таблиця 2). зує на те, що сигнальна пептидаза розпізнає амінокислотні залишки аланін 18 - лізин 22 і розщеп 59 92782 60 Різні фрагменти рЕ можуть легко продукуватися в Е. coli Вісім послідовностей кДНК, отриманих з повнорозмірного рЕ, клонували в рЕТ26b(+) і експресували в Е. coli. Отримані в результаті білки очищали на нікелевих колонках з афінністю до гістидинових міток (Фіг. 8). Рекомбінантні білки охоплювали повністю зрілий білковий продукт рЕ, і їх індивідуальні довжини і положення були показані на Фіг. 8А, і очищені продукти представлені на Фіг. 8В. рЕ є ключовим фактором вірулентності при гострому середньому отиті у щурів (AОМ) Для вивчення ролі рЕ як фактора вірулентності у NTHi, інфікували середнє вухо щурів 105-109 NTHi 3655 Аре або відповідним диким типом NTHi 3655 (Фіг. 9). Цікаве те, що 100-1000 разів більше NTHi 3655 Аре був потрібно для індукції аналогічного АОМ в порівнянні з бактеріями дикого типу. Отже, рЕ є ключовим фактором вірулентності для АОМ, індукованого NTHi. рЕ є високо імуногенним у певних популяцій Для вимірювання рівнів антитіл у дітей і донорів крові, рекомбінантний рЕ(А) очищали з Е. coli (Фіг. 5В) і використовували в ELISA. Результати ELISA-аналізів антитіл проти рЕ(А) показані на Фіг. 9. Діти молодше 6-місячного віку мали детектовані IgG і IgA проти рЕ(А). IgG антитіла демонстрували максимальні рівні у дітей у віці від 5 до 10 років. Навпаки, IgA антитіла збільшувалися поступово із збільшенням віку і найвищі значення визначалися у віковій групі від 70 до 80 років. Прийнятні епітопи В-клітинні епітопи білка головним чином розташовані на його поверхні. Для визначення Вклітинних епітопів поліпептидів білка Ε об'єднували два способи: визначення 2D-структури і визначення антигенного індексу. Визначення 2Dструктури здійснювали, використовуючи програму PSIPRED (від David Jones, Brunei Bioinformatics Group, Dept. Biological Sciences, Brunei University, Uxbridge UB8 3PH, UK). Антигенний індекс розраховували на основі способу, описаного Jameson і Wolf (CABIOS 4:181-186 [1988]). Параметрами, що використовуються в цій програмі, є антигенний індекс і мінімальна довжина для антигенного пептиду. Антигенний індекс 0,9 для мінімум 5 послідовних амінокислот використовували як порогову величину в цій програмі. Пептиди, що містять прийнятні потенційні В-клітинні епітопи, перераховані в таблиці 3. Вони можуть бути використані (переважно кон'юговані або рекомбінантно сполучені з більш великим білком) в композиції вакцини для профілактики інфекцій, викликаних ntHi, як і аналогічні пептиди, що містять консервативні мутації (переважно 70, 80, 85, 95, 99 або 100% ідентичні послідовностям таблиці 3) або зрізані форми, що містять 5 або більше (наприклад, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 20 або 25) амінокислот від них, або подовження, що містять, наприклад, 1, 2, 3, 5, 10 додаткових амінокислот на N-і/або С-кінцях пептиду з нативного оточення поліпептиду білка Ε (SEQ ID NO: 1 або її природні гомологи, як показано вище в Таблиці 2), які оберігають ефективний епітоп, який може викликати імунну відповідь у хазяїна на поліпептид білка Е. Висновки Поверхневий білок рЕ зовнішньої мембрани Haemophilus, що представляє собою ключовий фактор вірулентності для АОМ, індукованого NTHi, є високо імуногенним у певній популяції і, отже, є дуже прийнятним кандидатом для вакцини проти цілого ряду захворювань людини. Посилання 1. Ruan, Μ., Μ. Akkoyunlu, A. Grubb, and A. Forsgren. 1990. Protein D of Haemophilus influenzae. A novel bacterial surface protein with affinity for human IgD. J. Immunol. 145:3379. 2. Janson, H., L.-O. Heden, A. Grubb, M. Ruan, and A. Forsgren. 1991. Protein D, an immunoglobulin D binding protein of Haemophilius influenzae: cloning, nucleotide sequence, and expression in Escherichia coli. Infect. Immun. 59:119. 3. Janson, H., A. Melhus, A. Hermansson, and A. Forsgren. 1994. Protein D, the glycerophosphodiester phosphodiesterase from Haemophilus influenzae with affinity for human immunoglobulin D, influences virulence in a rat otitis model. Infect. Immun. 62:4848. 4. Janson, H., B. Carlen, A. Cervin, A. Forsgren, A. Bjork-Magnusdottir, S. Lindberg, and T. Runer. 1999. Effects on the ciliated epithelium of protein Dproducing and nonproducing nontypeable Haemophilus influenzae in nasopharyngeal tissue cultures. J. Infect. Dis. 180:737.