Розчинний поліпептид, який зв’язує активін а, та композиція, що його містить

Реферат: Винахід стосується розчинного пептиду, який зв'язує активін А, та композиції, що його містить. UA 115859 C2 (12) UA 115859 C2 UA 115859 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Ця заявка заявляє пріоритет попередніх заявок США №№ 60/739,462, поданої 23 листопада 2005 p., 60/783,322, поданої 17 березня 2006 р., та 60/844,855, поданої 15 вересня 2006 p., які включено авторами шляхом посилання у повному обсязі. Рівень техніки Руйнування кісток, від остеопорозу до переломів, являють собою низку патологічних станів, від яких існує небагато ефективних фармацевтичних засобів. Натомість лікування зосереджується на фізичному та поведінковому втручанні, включаючи іммобілізацію, фізичні вправи та зміни в режимі харчування. Бажаним було б створення терапевтичних засобів, які сприяють ростові кісток і збільшують густину кісток, для лікування від різних порушень кісток. Ріст та мінералізація кісток залежать від активності двох типів клітин, остеокластів та остеобластів, хоча хондроцити та клітини судинної системи також беруть участь у важливих аспектах цих процесів. З точки зору розвитку формування кістки відбувається через два механізми, ендохондральне скостеніння та скостеніння у сполучній мембрані, причому перше відповідає за подовжнє формування кісток, а друге відповідає за формування топологічно плоских кісток, таких, як кістки черепа. Ендохондральне скостеніння потребує послідовного формування та розпаду хрящових структур у зонах росту, які служать як шаблони для формування остеобластів, остеокластів, судинної системи та наступної мінералізації. Під час скостеніння у сполучній мембрані кістка формується безпосередньо у сполучних тканинах. Обидва процеси вимагають інфільтрації остеобластів та наступного осадження матриксу. Переломи та інші руйнування структури кістки лікують за допомогою процесу, який, принаймні зовні, нагадує послідовність етапів розвитку остеогенезу, включаючи формування хрящової тканини та наступну мінералізацію. Процес зрощування переломів може відбуватися двома шляхами. Пряме або первинне зрощування перелому відбувається без формування кісткової мозолі. Непряме або вторинне зрощування перелому відбувається через кісткову мозолю як попередній етап. Первинне зрощування переломів включає переформування механічної цілісності у місці щільного розриву. За відповідних умов клітини, що забезпечують резорбцію кістки, які оточують місце розриву, демонструють тунелювальну резорбтивну реакцію і створюють шляхи для проникнення кровоносних судин з наступним зрощуванням. Вторинне зрощування кісток відбувається через процес запалення, формування м'якої кісткової мозолі, мінералізацію кісткової мозолі та перемоделювання кісткової мозолі. На етапі запалення у місці пошкодження в результаті розриву періостальних та ендостальних кровоносних судин утворюється гематома і виникає кровотеча. Площу заповнюють запальні клітини. На етапі формування м'якої кісткової мозолі клітини утворюють нові судини, фібробласти, внутрішньоклітинний матеріал та підтримувальні клітини, формуючи грануляційну тканину у просторі між фрагментами зламаної кістки. Клінічне зрощування у місці розриву забезпечується фіброзною або хрящовою тканиною (м'яка кісткова мозоля). Остеобласти формуються й опосередковують мінералізацію м'якої кісткової мозолі, яка згодом замінюється ламелярною кісткою й піддається нормальним процесам перемоделювання. Крім переломів та інших фізичних розривів кісткової структури, втрата вмісту мінералів кісток та кісткової маси може бути викликана різними умовами і може спричиняти значні медичні проблеми. Зміни у кістковій масі протягом життя суб'єкта відбуваються відносно прогнозовано. До віку приблизно 30 років кістки чоловіків та жінок ростуть до максимальної маси шляхом лінійного росту зон росту хрящів та радіального росту. Після приблизно 30 років (для трабекулярних кісток, наприклад, плоских кісток, таких, як хребці та тазу) та 40 років (для трубчастих кісток, наприклад, довгих кісток кінцівок) відбувається повільна втрата кісткової маси як у чоловіків, так і у жінок. У жінок також відбувається кінцева фаза суттєвої втрати кісткової маси, можливо, через постклімактеричний дефіцит естрогену. Під час цієї фази жінки можуть втрачати додаткові 10 % кісткової маси з трубчастих кісток і 25 % з трабекулярного відділу. Чи призводить прогресуюча втрата кісткової маси до патологічного стану, такого, як остеопороз, значною мірою залежить від початкової кісткової маси суб'єкта та від наявності загострюючих станів. Втрата кісткової маси іноді характеризується як дисбаланс у нормальному процесі перемоделювання кісток. Здорова кістка постійно зазнає перемоделювання. Перемоделювання розпочинається з резорбції кістки остеокластами. Резорбована кістка потім замінюється новою кістковою тканиною, яка характеризується утворенням колагену остеобластами та наступною кальцифікацією. У здорових суб'єктів швидкість резорбції та швидкість формування є збалансованими. Остеопороз є хронічним, прогресуючим станом, який характеризується зміщенням у бік резорбції, що в результаті призводить до загального зниження кісткової маси та мінералізації кісток. Перед остеопорозом у людини відбувається клінічна остеопенія (густина кісткових мінералів, яка є більшою за одне стандартне відхилення, але меншою за 2,5 1 UA 115859 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 стандартного відхилення нижче середнього показника для молодої дорослої кістки). У світі приблизно 75 мільйонів людей є підданими ризикові остеопорозу. Таким чином, способи контролювання балансу між активністю остеокластів та остеобластів можуть бути корисними для сприяння зрощуванню переломів та лікуванню інших пошкоджень кісток, а також для лікування таких порушень, як остеопороз, пов'язаних з втратою кісткової маси та мінералізації кісток. У разі остеопорозу як терапевтичні засоби успішно застосовують естроген, кальцитонін, остеокальцин з вітаміном K або високі дози дієтичного кальцію. До інших терапевтичних засобів від остеопорозу належать бісфосфонати, паратиреоїдний гормон, кальциміметики, статини, анаболічні стероїди, солі лантану та стронцію і фторид натрію. Однак ці терапевтичні засоби часто бувають пов'язані з небажаними побічними ефектами. Таким чином, задачею даного винаходу є забезпечення композицій та способів сприяння ростові кісток та їх мінералізації. Короткий опис винаходу Частково винахід демонструє, що молекули, які мають активність антагоніста активіну або ActRIIa ("антагоністи активіну" та "антагоністи ActRIIa"), можуть застосовуватися для підвищення густини кістки, сприяння ростові кісток та/або збільшення міцності кісток. Зокрема, винахід демонструє, що розчинна форма ActRIIa діє як інгібітор сигналу активіну-ActRIIa і сприяє підвищенню густини кістки, ростові кісток та міцності кісток in vivo. Хоча більшість фармацевтичних агентів, які сприяють ростові кісток або інгібують втрату кісткової маси, діють або як антикатаболічні агенти (також відомі під загальною назвою "катаболічні агенти") (наприклад, бісфосфонати), або як анаболічні агенти (наприклад, паратиреоїдний гормон, РТН, при належному дозуванні), розчинний білок ActRIIa демонструє подвійну активність, маючи як катаболічний, так і анаболічний вплив. Таким чином, згідно з винаходом, було визначено, що антагоністи шляху сигналу активіну-ActRIIa можуть застосовуватися для підвищення густини кістки та сприяння ростові кісток. Хоча розчинні ActRIIa можуть впливати на кістку через механізм, відмінний від антагонізму до активіну, винахід все одно демонструє, що потрібні терапевтичні агенти можуть бути вибрані на основі активності антагоніста активіну-ActRIIa. Таким чином, у деяких варіантах втілення винахід забезпечує способи застосування антагоністів активіну-ActRIIa, включаючи, наприклад, активінзв'язувальні поліпептиди ActRIIa, антитіла проти активіну, антитіла проти ActRIIa, спрямовані на активін або ActRIIa малі молекули та аптамери і нуклеїнові кислоти, які знижують експресію активіну та ActRIIa, для лікування від порушень, пов'язаних з низькою густиною кісток або міцністю кісток, таких, як остеопороз, або для сприяння ростові кісток у пацієнтів, які цього потребують, наприклад, у пацієнтів, які мають переломи кісток. Крім того, розчинний поліпептид ActRIIa сприяє ростові кісток, не викликаючи помітного збільшення м'язової маси. У деяких аспектах винахід забезпечує поліпептиди, які включають розчинний, активінзв'язувальний поліпептид ActRIIa, який зв'язується з активіном. Поліпептиди ActRIIa можуть бути рецептовані як фармацевтична композиція, яка включає активінзв'язувальний поліпептид ActRIIa та фармацевтично прийнятний носій. В оптимальному варіанті активінзв'язувальний поліпептид ActRIIa зв'язується з активіном з показником K D, меншим, ніж 1 мікромоляр, а бо меншим, ніж 100, 10 або 1 наномоляр. Необов'язково активінзв'язувальний поліпептид ActRIIa селективно зв'язується з активіном на відміну від GDF11 та/або GDF8, в оптимальному варіанті - з показником KD, який є принаймні у 10 разів, 20 разів або 50 разів нижчим для активіну, ніж для GDF11 та/або GDF8. Якщо не прив'язуватися до конкретного механізму дії, очікується, що ступінь селективності інгібування активіну порівняно з інгібуванням GDF11/GDF 8 зумовлюється вибірковим впливом на кістку без помітного впливу на м'язи. У багатьох варіантах втілення поліпептид ActRIIa вибирають таким чином, щоб він викликав менше, ніж 15 %, менше, ніж 10 %, або менше, ніж 5 % збільшення м'язової маси у дозах, які дозволяють досягати потрібного впливу на кістку. В оптимальному варіанті композиція має очищення принаймні 95 % відносно інших поліпептидних компонентів, яке визначають шляхом хроматографії з виключенням за розміром, у ще кращому варіанті композиція має очищення принаймні 98 %. активінзв'язувальний поліпептид ActRIIa для застосування в такій композиції може бути будь-яким з описаних авторами, таким, як поліпептид, який має амінокислотну послідовність, вибрану з-поміж SEQ ID NOs: 2, 3, 7 або 12, або має амінокислотну послідовність, яка є принаймні на 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % або 99 % Ідентичною амінокислотній послідовності, вибраній з-поміж SEQ ID NOs: 2, 3, 7, 12 або 13. Активінзв'язувальний поліпептид ActRIIa може включати функціональний фрагмент природного поліпептиду ActRIIa, такий, як той, що включає принаймні 10, 20 або 30 амінокислот 2 UA 115859 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовності, вибраної з-поміж SEQ ID NOs: 1-3, або послідовності SEQ ID NO: 2, яка не має Скінцевих 10-15 амінокислот ("хвоста"). Розчинний, активінзв'язувальний поліпептид ActRIIa може включати одну або кілька змін в амінокислотній послідовності (наприклад, у лігандзв'язувальному домені) відносно природного поліпептиду ActRIIa. Приклади змінених поліпептидів ActRIIa наведено у патенті WO 2006/012627, ст. 59-60, включеному авторами шляхом посилання. Зміни в амінокислотній послідовності, наприклад, можуть змінювати глікозилування поліпептиду, якщо він виробляється у клітинах ссавців, комах або інших еукаріотних клітинах, або змінювати протеолітичне розщеплення поліпептиду відносно природного поліпептиду ActRIIa. активінзв'язувальний поліпептид ActRIIa може бути злитим білком, який має, як один домен, поліпептид ActRIIa (наприклад, лігандзв'язувальну частину ActRIIa) та один або кілька додаткових доменів, які забезпечують потрібну властивість, таку, як поліпшена фармакокінетика, полегшене очищення, спрямування на конкретні тканини і т. ін. Наприклад, домен злитого білка може поліпшувати одну або кілька характеристик, до яких належать in vivo стійкість, in vivo період напіврозпаду, поглинання/введення, локалізація або розподіл у тканині, утворення білкових комплексів, мультимеризація злитого білка та/або очищення. активінзв'язувальний злитий білок ActRIIa може включати Fc домен імуноглобуліну (дикий або мутантний) альбуміну сироватки або іншу поліпептидну частину, яка забезпечує потрібні властивості, такі, як поліпшена фармакокінетика, поліпшена розчинність або поліпшена стійкість. В оптимальному варіанті втілення злиття ActRIIa-Fc включає відносно неструктурований лінкер, розташований між Fc доменом та позаклітинним ActRIIa доменом. Цей неструктурований лінкер може відповідати неструктурованій ділянці з приблизно 15 амінокислота на С-кінці позаклітинного домену ActRIIa ("хвості"), або може бути штучною послідовністю з 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислот або мати довжину від 5 до 15, 20, 30, 50 або більше амінокислот, які є відносно вільними від вторинної структури, або їх сумішшю. Лінкер може бути багатим на гліцинові та пролінові залишки і, наприклад, може містити одну послідовність треоніну/серину та гліцинів або повторювані послідовності треоніну/серину та гліцинів (наприклад, TG4 або SG4 синглети або повтори). Злитий білок може включати підпослідовність очищення, таку, як мітка епітопу, мітка FLAG, послідовність полігістидину та GST злиття. Необов'язково розчинний поліпептид ActRIIa включає один або кілька модифікованих амінокислотних залишків, вибраних з-поміж: глікозилованої амінокислоти, пегильованої амінокислоти, фарнезилованої амінокислоти, ацетилованої амінокислоти, біотинілованої амінокислоти, амінокислоти, кон'югованої з ліпідним компонентом, та амінокислоти, кон'югованої з органічним дериватизуючим агентом. Фармацевтична композиція також може включати одну або кілька додаткових сполук, таких, як сполука, яку застосовують для лікування від порушення кісток. В оптимальному варіанті фармацевтична композиція є практично вільною від пірогену. Як правило, перевагу віддають експресії білка ActRIIa у клітинній лінії ссавця, яка відповідно опосередковує природне глікозилування білка ActRIIa таким чином, щоб зменшити ймовірність несприятливої імунної реакції у пацієнта. Успішним було застосування клітинних ліній людини та СНО, і очікується, що інші звичайні системи експресії ссавців також будуть корисними. Як описано авторами, білки ActRIIa, позначені як ActRIIa-Fc (форма з мінімальним лінкером між ActRIIa-частиною та Fc-частиною) мають потрібні властивості, включаючи селективне зв'язування з активіном, на відміну від GDF8 та/або GDF11, високоафінне лігандне зв'язування та період напіврозпаду в сироватці, більший за два тижні у тваринних моделях. У деяких варіантах втілення винахід забезпечує поліпептиди ActRIIa-Fc і фармацевтичні композиції, які включають такі поліпептиди та фармацевтично прийнятний наповнювач. У деяких аспектах винахід забезпечує нуклеїнові кислоти, які кодують розчинний активінзв'язувальний поліпептид ActRIIa. Виділений полінуклеотид може включати кодуючу послідовність для розчинного активінзв'язувального поліпептиду ActRIIa, як описано вище. Наприклад, виділена нуклеїнова кислота може включати послідовність, яка кодує позаклітинний домен (наприклад, лігандзв'язувальний домен) ActRIIa, та послідовність, яка має кодувати частину або весь трансмембранний домен та/або цитоплазматичний домен ActRIIa, крім стопкодону, розташованого у межах трансмембранного домену або цитоплазматичного домену, або розташованого між позаклітинним доменом та трансмембранним доменом або цитоплазматичним доменом. Наприклад, виділений полінуклеотид може включати полінуклеотидну послідовність ActRIIa повної довжини, таку, як SEQ ID NO: 4 або 5, або частково зрізаний варіант, вищезгаданий виділений полінуклеотид також включає кодон термінації транскрипції, розташований принаймні за шістсот нуклеотидів до 3'-кінця або в іншій позиції, таким чином, щоб трансляція полінуклеотиду викликала необов'язкове злиття 3 UA 115859 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 позаклітинного домену зі зрізаною частиною ActRIIa повної довжини. Оптимальною нуклеїновокислотною послідовністю є SEQ ID NO: 14. Описані авторами нуклеїнові кислоти можуть бути функціонально зв'язані з промотором для експресії, і винахід забезпечує клітини, трансформовані такими рекомбінантними полінуклеотидами. В оптимальному варіанті клітина є клітиною ссавця, такою, як клітина СНО. У деяких аспектах винахід забезпечує способи одержання розчинного, активінзв'язувального поліпептиду ActRIIa. Такий спосіб може включати експресію будь-якої з описаних авторами нуклеїнових кислот (наприклад, SEQ ID NO: 4, 5 або 14) у відповідній клітині, такій, як клітина яєчника китайського хом'яка (СНО). Такий спосіб може включати: а) культивування клітини в умовах, прийнятних для експресії розчинного поліпептиду ActRIIa, причому вищезгадана клітина трансформується експресійною конструкцією розчинного ActRIIa; та b) видобування експресованого таким чином розчинного поліпептиду ActRIIa. Розчинні поліпептиди ActRIIa можуть видобуватися як неочищені, частково очищені або високоочищені фракції. Очищення досягають через низку етапів очищення, включаючи, наприклад, один, два, три або більше з нижчезазначених у будь-якому порядку: хроматографія протеїну А, аніонообмінна хроматографія (наприклад, на Q-сефарозі), хроматографія гідрофобної взаємодії (наприклад, на фенілсефарозі), хроматографія з виключенням за розміром та катіонообмінна хроматографія. У деяких аспектах згідно зі способом може застосовуватись описаний авторами антагоніст активіну-ActRIIa, такий, як розчинний активінзв'язувальний поліпептид ActRIIa, для сприяння ростові кісток або збільшення густини кісток у суб'єкта. У деяких варіантах втілення винахід забезпечує способи лікування від порушення, пов'язаного з низькою густиною кісток, або для сприяння ростові кісток у пацієнтів, які цього потребують. Спосіб може включати введення суб'єктові, який цього потребує, ефективної кількості антагоніста активіну-ActRIIa. У деяких аспектах винахід забезпечує застосування антагоніста активіну-ActRIIa для приготування медикаменту для лікування від порушення або стану, як описано авторами. У деяких аспектах винахід забезпечує спосіб розпізнавання агента, який стимулює ріст або підвищує мінералізацію кістки. Спосіб включає: а) розпізнавання випробуваного агента, який зв'язується з активіном або лігандзв'язувальним доменом поліпептиду ActRIIa; і b) оцінку впливу агента на ріст або мінералізацію кістки. Короткий опис креслень Фігура 1 показує очищення ActRIIa-hFc, який експресується у клітинах СНО. Білок очищується як єдиний, чітко визначений пік. Фігура 2 показує зв'язування ActRIIa-hFc з активіном та GDF-11, згідно з вимірюванням за допомогою ВіаСоге™. Фігура 3 схематично показує аналіз гена-репортера А-204. Фігура показує репортерний вектор: pGL3(CAGA)12 (описаний у публікації Dennler et al, 1998, EMBO 17: 3091-3100.) Мотив СAGA12 є присутнім у реагуючих на TGF-бета генах (ген РАІ-1), тому цей вектор має загальне застосування для факторів, які сигналізують через Smad 2 та 3. Фігура 4 показує вплив ActRIIa-hFc (ромби) та ActRIIa-mFc (квадрати) на сигнал GDF-8 в аналізі гена-репортера А-204. Обидва білки демонстрували суттєве інгібування опосередкованого GDF-8 сигналу у пікомолярних концентраціях. Фігура 5 показує вплив трьох різних композицій ActRIIa-hFc на сигнал GDF-11 в аналізі генарепортера А-204. Фігура 6 показує приклади DEXA-зображень контрольних та лікованих ActRIIa-mFc мишей BALB/c до (верхні зображення) та після (нижні зображення) 12-тижневого періоду лікування. Світліше затінення вказує на збільшену густину кістки. Фігура 7 показує кількісне визначення впливу ActRIIa-mFc на густину кісткових мінералів у мишей BALB/c протягом 12-тижневого періоду. Групи включали контрольну (ромби) і такі, що отримували дозу 2 мг/кг ActRIIa-mFc (квадрати), дозу 6 мг/кг ActRIIa-mFc (трикутники) та дозу 10 мг/кг ActRIIa-mFc (кола). Фігура 8 показує кількісне визначення впливу ActRIIa-mFc на вміст кісткових мінералів у мишей BALB/c протягом 12-тижневого періоду. Групи включали контрольну (ромби) і такі, що отримували дозу 2 мг/кг ActRIIa-mFc (квадрати), дозу 6 мг/кг ActRIIa-mFc (трикутники) та дозу 10 мг/кг ActRIIa-mFc (кола). Фігура 9 показує кількісне визначення впливу ActRIIa-mFc на густину кісткових мінералів трабекулярної кістки у підданих оваріектомії (OVX) або псевдооперованих (SHAM) мишей C57BL6 після 6-тижневого періоду. Групи включали контрольну (PBS) або таку, що отримувала дозу 10 мг/кг ActRIIa-mFc (ActRIIa). 4 UA 115859 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фігура 10 показує кількісне визначення впливу ActRIIa-mFc на трабекулярну кістку у підданих оваріектомії (ОVX) мишей C57BL6 протягом 12-тижневого періоду. Групи включали контрольну (PBS; світлі стовпчики) або таку, що отримувала дозу 10 мг/кг ActRIIa-mFc (ActRIIa; темні стовпчики). Фігура 11 показує кількісне визначення впливу ActRIIa-mFc на трабекулярну кістку у псевдооперованих мишей C57BL6 після 6- або 12-тижневого періоду лікування. Групи включали контрольну (PBS; світлі стовпчики) або таку, що отримувала дозу 10 мг/кг ActRIIa-mFc (ActRIIa; темні стовпчики). Фігура 12 показує результати pQCT-аналізу густини кістки у підданих оваріектомії мишей протягом 12-тижневого лікування. Групи включали контрольну (PBS; світлі стовпчики) або 3 ActRIIa-mFc (темні стовпчики), вісь у: мг/см . Фігура 13 показує результати pQCT-аналізу густини кістки у псевдооперованих мишей протягом 12-тижневого лікування. Групи включали контрольну (PBS; світлі стовпчики) або таку, 3 що отримувала ActRIIa-mFc (темні стовпчики), вісь у; мг/см . Фігури 14А та 14В показують результати DEXA-аналізу всього організму після 12 тижнів лікування (А) та ex vivo аналізу стегон (В). Світлі ділянки означають зони високої густини кістки. Фігура 15 показує ex vivo pQCT-аналіз середньої третини стегнової кістки після дванадцяти тижнів лікування. Групи включали контрольну, яка отримувала індиферентний носій (PBS, темні стовпчики) та таку, що отримувала ActRIIa-mFc (світлі стовпчики). Чотири стовпчики зліва показують загальну густину кістки, а чотири стовпчики справа показують густину трубчастої кістки. Перша пара стовпчиків у кожній групі з чотирьох стовпчиків представляє дані підданих оваріектомії мишей, а друга пара стовпчиків представляє дані псевдооперованих мишей. Фігура 16 показує ex vivo pQCT аналіз та масу діафізарної кістки у середній третині стегнової кістки після дванадцяти тижнів лікування. Групи включали контрольну, яка отримувала індиферентний носій (PBS, темні стовпчики) або таку, що отримувала ActRIIa-mFc (світлі стовпчики). Чотири стовпчики зліва показують загальну кісткову масу, а чотири стовпчики справа показують масу трубчастої кістки. Перша пара стовпчиків у кожній групі з чотирьох стовпчиків представляє дані підданих оваріектомії мишей, а друга пара стовпчиків представляє дані псевдооперованих мишей. Фігура 17 показує ex vivo pQCT аналіз середньої третини стегнової кістки та товщину кортикального шару стегна. Групи включали контрольну (PBS, темні стовпчики) та таку, що отримувала ActRIIa-mFc (світлі стовпчики). Чотири стовпчики зліва показують окружність ендостального шару, а чотири стовпчики справа показують окружність періостального шару. Перша пара стовпчиків у кожній групі з чотирьох стовпчиків представляє дані підданих оваріектомії мишей, а друга пара стовпчиків представляє дані псевдооперованих мишей. Фігура 18 показує результати механічного випробування стегон після дванадцяти тижнів лікування. Групи включали контрольну (PBS,темні стовпчики) та таку, що отримувала ActRIIamFc (світлі стовпчики). Два стовпчики зліва представляють дані підданих оваріектомії мишей, а два останні стовпчики представляють дані псевдооперованих мишей. Фігура 19 показує вплив ActrIIa-mFc на об'єм трабекулярної кістки. Фігура 20 показує вплив ActrIIa-mFc на трабекулярну архітектуру у дистальному стегні. Фігура 21 показує вплив ActrIIa-mFc на трубчасту кістку. Фігура 22 показує вплив ActrIIa-mFc на механічну міцність кістки. Фігура 23 показує вплив різних доз ActRIIa-mFc на характеристики кістки при трьох різних дозах. Фігура 24 показує гістоморфометрію кістки, яка вказує, що ActRIIa-mFc має подвійну анаболічну та антирезорбтивну активність. Детальний опис винаходу 1. Загальний огляд Надродина трансформуючих факторів росту-бета (TGF-бета) включає різні фактори росту, які мають спільні елементи послідовності та структурні мотиви. Відомо, що ці білки справляють біологічний вплив на різні типи клітин як у хребетних, так і у безхребетних. Члени цієї надродини виконують важливі функції під час ембріонального розвитку у формуванні структури та деталізації тканини і можуть впливати на різні процеси диференціації, включаючи адипогенез, міогенез, хондрогенез, кардіогенез, кровотворення, нейрогенез та диференціацію епітеліальних клітин. Родина розділяється на дві загальні гілки: BMP/GDF та TGF-бета/активін/ВМР 10, члени яких мають різний, часто комплементарний вплив. Шляхом маніпулювання активності члена родини TGF-бета часто можна досягти суттєвих фізіологічних змін в організмі. Наприклад, породи великої рогатої худоби п'ємонтська та бельгійська блакитна мають мутацію з втратою функції у гені GDF8 (також називається міостатином), яка викликає помітне збільшення м'язової 5 UA 115859 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 маси. Grobet et al., Nat Genet. 1997, 17(l):71-4. Крім того, у людей неактивні алелі GDF8 є пов'язаними зі збільшеною м'язовою масою та, за свідченнями, виключною силою. Schuelke et al., N Engl J Med 2004, 350:2682-8. Активіни є димерними поліпептидними факторами росту, які належать до надродини TGFбета. Існують три основні форми активіну (А, В та АВ), які є гомо/гетеродимерами двох близько споріднених підгруп β (βАβА, βВβВ та βАβВ). Людський геном також кодує активін С та активін Е, які, головним чином, експресуються у печінці. У надродині TGF-бета активіни є унікальними і багатофункціональними факторами, які можуть стимулювати продукування гормону в клітинах яєчників та плаценти, підтримують виживання нейронних клітин, позитивно або негативно впливають на процес клітинного циклу, залежно від типу клітин, і викликають мезодермальну диференціацію принаймні в ембріонах земноводних (DePaolo et al., 1991, Рrос Soc Ер Biol Med. 198:500-512; Dyson et al., 1997, Curr Biol. 7:81-84; Woodruff, 1998, Biochem Pharmacol. 55:953963). Крім того, було виявлено, що еритроїдний фактор диференціації (EDF), виділений зі стимульованих людських моноцитарних лейкемічних клітин є ідентичним активінові A (Murata et al., 1988, PNAS, 85:2434). Вказувалося на те, що активін А діє як природний позитивний регулятор еритропоезу в кістковому мозку. У деяких тканинах сигнал активіну антагонізується пов'язаним з ним гетеродимером, інгібіном. Наприклад, під час вивільнення фолікулостимулюючого гормону (FSH) з гіпофізу активін сприяє секреції та синтезові FSH, тоді, як інгібін перешкоджає секреції та синтезові FSH. До інших білків, які можуть регулювати біологічну активність активіну та/або зв'язуватися з активіном належать фолістатин (FS), споріднений з фолістатином білок (FSRP), α2-макроглобулін, Cerberus та ендоглін. Сигнали TGF-β опосередковуються гетеродимерними комплексами рецепторів серин/треонінкінази типу І та типу II, які фосфорилюють і активізують розташовані далі Smad білки при лігандному стимулюванні (Massague, 2000, Nat. Rev. Моl. Cell Biol. 1:169-178). Ці рецептори типу І та типу II є трансмембранними білками, які складаються з лігандзв'язувального позаклітинного домену з багатою на цистеїн ділянкою, трансмембранного домену та цитоплазматичного домену з прогнозованою специфічністю серину/треоніну. Рецептори типу І є суттєвими для сигналу; а рецептори типу II є необхідними для зв'язування лігандів та для експресії рецепторів типу І. Рецептори активіну типу І та II утворюють стійкий комплекс після лігандного зв'язування, що в результаті забезпечує фосфорилювання рецепторів типу І рецепторами типу II. Два споріднені рецептори типу II, ActRIIa та ActRIIb, були визначені як рецептори типу II для активінів (Mathews and Vale, 1991, Cell 65:973-982; Attisano et al., 1992, Cell 68: 97-108). Крім активінів, ActRIIa та ActRIIb можуть біохімічно взаємодіяти з кількома іншими білками родини TGF-P, включаючи ВМР7, Nodal, GDF8 та GDF11 (Yamashita et al., 1995, J. Cell Biol. 130:217226; Lee and McPherron, 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. 98:9306-9311; Yeo and Whitman, 2001, Моl. Cell 7: 949-957; Oh et al., 2002, Genes Dev. 16:2749-54). ALK4 є первинним рецептором типу І для активінів, зокрема, для активіну А, і ALK-7 також може служити як рецептор для активінів, зокрема, для активіну В. Як було продемонстровано авторами, розчинний поліпептид ActRIIa (sActRIIa), який демонструє значну перевагу у зв'язуванні з активіном А на відміну від інших членів родини TGFбета, таких, як GDF8 або GDF11, є ефективним для сприяння ростові кісток та збільшення густини кістки in vivo. Якщо не прив'язуватися до будь-якого конкретного механізму, очікується, що вплив sActRIIa викликається, насамперед, впливом антагоніста активіну, при дуже сильному зв'язуванні активіну (пікомолярна константа дисоціації), яке демонструє конкретна послідовність sActRIIa, яка застосовується в цих дослідженнях. Незалежно від механізму, з представлених авторами даних стає зрозумілим, що ActRIIa-антагоністи активіну збільшують густина кісток у нормальних мишей та мишачих моделях остеопорозу. Слід зазначити, що кістка є динамічною тканиною, з ростом та усиханням і збільшенням або зменшенням густини, залежно від балансу чинників, які створюють кістку і стимулюють мінералізацію (головним чином, остеобластів) та чинників, які руйнують і демінералізують кістку (головним чином, остеокластів). Ріст кісток та мінералізація можуть збільшуватися через збільшення продукуючих чинників, через зменшення руйнівних чинників, або і те, й інше. Терміни "сприяння ростові кісток" та "підвищення мінералізації кісток" стосуються видимих фізичних змін у кістках і є нейтральними по відношенню до механізму, згідно з яким відбуваються зміни у кістках. Мишачі моделі остеопорозу та росту/густини кісток, які застосовували в описаних авторами дослідженнях, вважаються такими, що забезпечують високу прогнозованість для людини і, таким чином, цей винахід забезпечує способи застосування поліпептидів ActRIIa та інших антагоністів активіну-ActRIIa для сприяння ростові кісток та збільшення густини кісток у людей. До антагоністів активіну-ActRIIa належать, наприклад, активінзв'язувальні розчинні поліпептиди 6 UA 115859 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ActRIIa, антитіла, які зв'язуються з активіном (зокрема, субодиницями активіну А або В, які також називають βА або βВ) і розривають зв'язування ActRIIa, антитіла, які зв'язуються з ActRIIa і розривають зв'язування активіну, білки, які не є антитілами, вибрані з огляду на зв'язування з активіном або ActRIIa (див., наприклад, WO/2002/088171, WO/2006/055689, WO/2002/032925, WO/2005/037989, US 2003/0133939 та US 2005/0238646, в яких наведено приклади білків та способів їх побудови та відбору), рандомізовані пептиди, вибрані з огляду на зв'язування з активіном або ActRIIa, часто прикріплені до Fc домену. Два різні білки (або інші компоненти) з активністю зв'язування активіну або ActRIIa, зокрема, активінзв'язувальні речовини, які блокують місця зв'язування типу І (наприклад, розчинний рецептор активіну типу І) та типу II (наприклад, розчинний рецептор активіну типу II), відповідно, можуть бути зв'язані між собою для створення біфункціональної зв'язувальної молекули. Нуклеїновокислотні аптамери, малі молекули та інші агенти, які інгібують сигнальну вісь активін-ActRIIa. Різні білки мають активність антагоніста активіну-ActRIIa, включаючи інгібін (тобто, субодиницю інгібін альфа), хоча інгібін не антагонізує активін в усіх тканинах, фолістатин (наприклад, фолістатин-288 та фолістатин-315), Cerberus, FSRP, ендоглін, активін С, альфа(2)-макроглобулін та мутантний активін А М108А (заміна метіоніну на аланін у позиції 108). Зазвичай альтернативні форми активіну, зокрема, ті, що мають зміни в домені зв'язування рецептора типу І, можуть зв'язуватися з рецепторами типу II і не можуть утворити активний потрійний комплекс, таким чином, діючи як антагоністи. Крім того, нуклеїнові кислоти, такі, як антисмислові молекули, siPHK або рибозими, які інгібують активін А, В, С або Е або, зокрема, експресію ActRIIa, можуть застосовуватись як антагоністи активіну-ActRIIa. В оптимальному варіанті антагоніст активінуActRIIa, який має бути застосований, демонструє селективність інгібування опосередкованого активіном сигналу порівняно з іншими членами родини TGF-бета, зокрема, по відношенню до GDF8 та GDF11. Розчинні білки ActRIIb зв'язуються з активіном, однак білок дикого типу не має значної селективності зв'язування з активіном порівняно з GDF8/11, і попередні експерименти свідчать, що цей білок не забезпечує потрібного впливу на кістки, водночас також викликаючи значний ріст м'язів. Однак було виявлено змінені форми ActRIIb з іншими властивостями зв'язування (див., наприклад, патент WO 2006/012627, ст. 55-59, включений авторами шляхом посилання), і ці білки можуть забезпечувати потрібний вплив на кістку. Природний або змінений ActRIIb може набути додаткової специфічності до активіну через зв'язування з другим агентом селективного зв'язування активіну. Терміни, вжиті в цьому описі, в цілому мають їх загальноприйняті у даній галузі значення, у контексті цього винаходу і в конкретному контексті вживання кожного терміну. Деякі терміни обговорюються нижче або в інших частинах опису для забезпечення додаткових вказівок для спеціаліста-практика в описі композицій та способів згідно з винаходом та способах їх застосування. Обсяг або значення будь-якого застосування терміну стане зрозумілим з конкретного контексту, в якому вжито цей термін. "Близько" та "приблизно" в цілому означає прийнятний рівень похибки у виміряній кількості з врахуваннях типу та точності вимірювань. Зазвичай типовий рівень похибки становить не більше 20 відсотків (%), в оптимальному варіанті - не більше 10 %, у ще кращому варіанті - не більше 5 % від даного значення або діапазону значень. В альтернативному варіанті, зокрема у біологічних системах, терміни "близько" та "приблизно" можуть означати значення, які перебувають у межах порядку величини, в оптимальному варіанті - у межах 5-разового, у ще кращому варіанті - у межах 2-разового показника даного значення. Вказані авторами числові значення кількості є приблизними, якщо не вказується іншого, означаючи, що термін "близько" або "приблизно" може матися на увазі, коли він прямо не вказується. Способи згідно з винаходом можуть включати етапи порівняння між послідовностями, включаючи порівняння послідовності дикого типу з одним або кількома мутантами (варіантами послідовності). Такі порівняння зазвичай включають співставлення полімерних послідовностей, наприклад, з використанням програм та/або алгоритмів вирівнювання послідовностей, які є загальновідомими серед спеціалістів у даній галузі (наприклад, BLAST, FASTA та MEGALIGN). Спеціалістові у даній галузі стане зрозуміло, що при таких вирівнюваннях, коли мутація містить інсерцію або делецію залишку, у вирівняній послідовності вставляють "пробіл" (зазвичай представлений як тире або "А") у полімерній послідовності, яка не містить вставленого або делетованого залишку. "Гомологічний" в усіх граматичних формах та варіантах написання, стосується зв'язку між двома білками, які мають "спільне еволюційне походження", включаючи білки з надродин одного виду організму, а також гомологічні білки з іншого виду організму. Такі білки (та їхні кодуючі нуклеїнові кислоти) мають гомологію послідовності, яка відображається через 7 UA 115859 C2 5 10 15 20 25 30 подібність послідовності, чи то у відсотках ідентичності, чи то через присутність конкретних залишків або мотивів та консервативних позицій. Термін "подібність послідовності" в усіх його граматичних формах, стосується ступеня ідентичності або відповідності між нуклеїновокислотними або амінокислотними послідовностями, які можуть на мати спільного еволюційного походження. Однак у загальновживаному сенсі і в даній заявці термін "гомологічний", при додаванні прислівника "високо", може стосуватися подібності послідовності і може бути або не бути пов'язаним зі спільним еволюційним походженням. 2. Поліпептиди ActRIIa У деяких аспектах даний винахід стосується поліпептидів ActRIIa. Вжитий авторами термін "ActRIIa" стосується білків родини рецепторів активіну типу IIа (ActRIIa) з будь-якого виду та варіантів, отриманих з таких білків ActRIIa шляхом мутагенезу або іншої модифікації. Посилання на ActRIIa в цьому описі слід розглядати як посилання на будь-яку з ідентифікованих на даний час форм. Члени родини ActRIIa зазвичай є трансмембранними білками, які складаються з лігандзв'язувального позаклітинного домену з багатою на цистеїн ділянкою, трансмембранним доменом та цитоплазматичним доменом з прогнозованою активністю серин/треонінкінази. Термін "поліпептид ActRIIa" включає поліпептиди, які включають будь-який природний поліпептид члена родини ActRIIa, а також будь-які його варіанти (включаючи мутанти, фрагменти, злиття та пептидоміметичні форми), які зберігають корисну активність. Наприклад, до поліпептидів ActRIIa належать поліпептиди, які походять від послідовності будь-якого відомого ActRIIa, що має послідовність, принаймні приблизно на 80 % ідентичну послідовності поліпептиду ActRIIa, в оптимальному варіанті - ідентичну принаймні на 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 99 % або більше. Наприклад, поліпептид ActRIIa згідно з винаходом може зв'язуватися й інгібувати функцію білка ActRIIa та/або активіну. В оптимальному варіанті поліпептид ActRIIa сприяє ростові та мінералізації кісток. Прикладами поліпептидів ActRIIa є поліпептид-прекурсор людського ActRIIa (SEQ ID NO: 1) та розчинні людські поліпептиди ActRIIa (наприклад, SEQ ID NOs: 2, 3, 7 та 12). Послідовність білка-прекурсора людського ActRIIa є такою: Сигнальний пептид підкреслено однією лінією; позаклітинний домен виділено жирним шрифтом, і можливі N-зв'язані місця глікозилування підкреслено подвійною лінією. Послідовність розчинного (позаклітинного) обробленого поліпептиду людського ActRIIa є такою: 8 UA 115859 C2 С-кінцевий "хвіст" позаклітинного домену є підкресленим. Послідовність з делетованим "хвостом" (послідовність А15) є такою: 5 Нуклеїновокислотна послідовність, яка кодує білок-прекурсор людського ActRIIa є такою (нуклеотиди 164-1705 зі зразка у Genbank NM_001616): 10 9 UA 115859 C2 Нуклеїновокислотна послідовність, людського ActRIIa є такою: 5 10 15 20 25 30 35 40 яка кодує розчинний (позаклітинний) поліпептид У конкретному варіанті втілення винахід стосується розчинних поліпептидів ActRIIa. Як описано авторами, термін "розчинний поліпептид ActRIIa" в цілому стосується поліпептидів, які включають позаклітинний домен білка ActRIIa. Вжитий авторами термін "розчинний поліпептид ActRIIa" включає будь-який природний позаклітинний домен білка ActRIIa, а також будь-які його варіанти (включаючи мутанти, фрагменти та пептидоміметичні форми). активінзв'язувальний поліпептид ActRIIa є таким, що зберігає здатність до зв'язування з активіном, зокрема, активіном АА, АВ або ВВ. В оптимальному варіанті активінзв'язувальний поліпептид ActRIIa зв'язується з активіном АА з константою дисоціації 1 нМ або меншою. Амінокислотні послідовності білка-прекурсора людського ActRIIa представлено нижче. Позаклітинний домен білка ActRIIa зв'язується з активіном і зазвичай є розчинним і, таким чином, може називатися розчинним, активінзв'язувальним поліпептидом ActRIIa. Прикладами розчинних, активінзв'язувальних поліпептидів ActRIIa є розчинний поліпептид, показаний у SEQ ID NOs: 2, 3, 7, 12 та 13. SEQ ID NО:7 називається ActRIIa-hFc і далі описується у Прикладах. Інші приклади розчинних, активінзв'язувальних поліпептидів ActRIIa включають сигнальну послідовність, додаткову до позаклітинного домену білка ActRIIa, наприклад, лідерна послідовність бджолиного мелітину (SEQ ID NO: 8), лідерна послідовність тканинного активатора плазміногену (ТРА) (SEQ ID NО: 9) або лідерна послідовність природного ActRIIa (SEQ ID NO: 10). Поліпептид ActRIIa-hFc, показаний у SEQ ID NO: 13, використовує лідерну послідовність ТРА. Функціонально активні фрагменти поліпептидів ActRIIa отримують шляхом відбору поліпептидів, які рекомбінантно виробляються відповідним фрагментом нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид ActRIIa. Крім того, фрагменти можуть бути хімічно синтезовані з застосуванням способів, відомих спеціалістам у даній галузі, таких, як традиційний твердофазний синтез f-Moc або t-Boc за Мерифілдом. Фрагменти утворюють (рекомбінантно або шляхом хімічного синтезу) і випробують для розпізнавання пептидильних фрагментів, які можуть функціонувати як антагоністи (інгібітори) білка ActRIIa або сигналу, опосередкованого активіном. Функціонально активні варіанти поліпептидів ActRIIa одержують шляхом скринінгу бібліотек модифікованих поліпептидів, рекомбінантно утворених з відповідних мутагенізованих нуклеїнових кислот, які кодують поліпептид ActRIIa. Варіанти утворюють і випробують для виявлення тих, які можуть функціонувати як антагоністи (інгібітори) білка ActRIIa або сигналу, опосередкованого активіном. У деяких варіантах втілення функціональний варіант поліпептидів ActRIIa включає амінокислотну послідовність, яка є принаймні на 75 % ідентичною амінокислотній послідовності, вибраній з-поміж SEQ ID NOs: 2 або 3. У деяких випадках функціональний варіант має амінокислотну послідовність, принаймні на 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % або 100 % ідентичну амінокислотній послідовності, вибраній з-поміж SEQ ID NOs: 2 або 3. 10 UA 115859 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Функціональні варіанти одержують шляхом модифікації структури поліпептиду ActRIIa з такими цілями, як підвищення терапевтичної ефективності або стійкості (наприклад, терміну зберігання ex vivo та стійкості до протеолітичного розпаду in vivo), Такі модифіковані поліпептиди ActRIIa, якщо відбираються для збереження зв'язування активіну, вважаються функціональними еквівалентами природних поліпептидів ActRIIa. Модифіковані поліпептиди ActRIIa також можуть бути утворені, наприклад, шляхом заміщення, делеції або додавання амінокислот. Наприклад, існують підстави очікувати, що окрема заміна лейцину на ізолейцин або валін, аспартату на глутамат, треоніну на серин, або інша подібна заміна амінокислоти на споріднену за структурою амінокислоту (наприклад, консервативні мутації) не матимуть значного впливу на біологічну активність утвореної в результаті молекули. Консервативними замінами є ті, які відбуваються у межах родини амінокислот, які є спорідненими за їхніми боковими ланцюгами. Чи буде в результаті зміни в амінокислотній послідовності поліпептиду ActRIIa утворено функціональний гомолог, можна легко визначити шляхом оцінки здатності варіанта поліпептиду ActRIIa до викликання реакції у клітинах у спосіб, подібний до викликання поліпептидом ActRIIa дикого типу. У деяких варіантах втілення даний винахід передбачає конкретні мутації поліпептидів ActRIIa для зміни глікозилування поліпептиду. Такі мутації можуть бути вибрані таким чином, щоб ввести або видалити одне або кілька місць глікозилування, такі, як О-зв'язані або N-зв'язані місця глікозилування. активінзв'язані ділянки розпізнавання глікозилування зазвичай включають трипептидну послідовність, аспарагін-Х-треонін (або аспарагіни-Х-серин) (де "X" є будь-якою амінокислотою), яка специфічно розпізнається відповідними ферментами клітинного глікозилування. Зміну також здійснюють шляхом додавання або заміщення одним або кількома сериновими або треоніновими залишками у послідовності поліпептиду ActRIIa дикого типу (Озв'язані місця глікозилування). Різні амінокислотні заміщення або делеції в одній або обох першій або третій амінокислотних позиціях ділянки розпізнавання глікозилування (та/або делеція амінокислоти у другій позиції) в результаті ведуть до деглікозилування у модифікованій трипептидній послідовності. Іншим засобом збільшення кількості вуглеводних компонентів на поліпептиді ActRIIa є хімічне або ферментне з'єднання глікозидів з поліпептидом ActRIIa. Залежно від застосовуваного режиму з'єднання, цукор(кри) може(уть) приєднуватися до (а) аргініну та гістидину; (b) вільних карбоксильних груп; (с) вільних сульфгідрильних груп, такі, як групи цистеїну; (d) вільних гідроксильних груп, таких, як групи серину, треоніну або гідроксипроліну; (e) ароматичних залишків, таких, як залишки фенілаланіну, тирозину або триптофану; або (f) амідної групи глутаміну. Ці способи описуються у патенті WO 87/05330, опублікованому 11 вересня 1987 р., та публікації Aplin and Wriston (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306, які включаються авторами шляхом посилання. Видалення одного або кількох вуглеводних компонентів, присутніх на поліпептиді ActRIIa, може здійснюватися хімічно та/або ферментативно. Хімічне деглікозилування може включати, наприклад, піддавання поліпептиду ActRIIa дії сполуки трифторометансульфонової кислоти або рівноцінної сполуки. Ця обробка в результаті забезпечує розщеплення більшості або всіх цукрів, за винятком зв'язувального цукру (N-ацетилглюкозаміну або N-ацетилгалактозаміну), не займаючи амінокислотну послідовність. Хімічне деглікозилування докладніше описується у публікаціях Hakimuddin et al. (1987) Arch. Biochem. Biophys. 259:52 та Edge et al. (1981) Anal. Biochem. 118:131. Ферментного розщеплення вуглеводних компонентів на поліпептидах ActRIIa досягають шляхом застосування різних ендо- та екзоглікозидаз, як описано у публікації Thotakura et al. (1987) Meth. Enzymol. 138:350. Послідовність поліпептиду ActRIIa може регулюватися відповідним чином, залежно від типу застосовуваної експресійної системи, оскільки клітини ссавців, дріжджів, комах та рослин можуть мати різні моделі глікозилування, на які може впливати амінокислотна послідовність пептиду. Як правило, білки ActRIIa, які застосовують для людей, мають експресуватися у клітинній лінії ссавця, що забезпечує належне глікозилування, наприклад, клітинних лініях НЕК293 або СНО, хоча також можуть бути корисними інші експресійні клітинні лінії ссавців, клітинні лінії дріжджів з підданими інженерії ферментами глікозилування та клітини комах. Цей винахід також передбачає спосіб створення мутантів, зокрема, наборів комбінаторних мутантів поліпептиду ActRIIa, а також зрізаних мутантів; пули комбінаторних мутантів є особливо корисними для розпізнавання функціональних варіантів послідовностей. Метою відбору таких комбінаторних бібліотек може бути створення, наприклад, варіантів поліпептиду ActRIIa, які можуть діяти як агоністи або антагоністи, або, в альтернативному варіанті, які демонструють зовсім нову активність. Різні аналізи для відбору представлено нижче, і такі аналізи можуть застосовуватися для оцінки варіантів. Наприклад, варіант поліпептиду ActRIIa може бути відібраний на здатність до зв'язування з лігандом ActRIIa для запобігання 11 UA 115859 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зв'язуванню ліганду ActRIIa з поліпептидом ActRIIa або для перешкоджання сигналові, викликаного лігандом ActRIIa. Активність поліпептиду ActRIIa або його варіантів також може випробуватися шляхом аналізу на основі клітин або in vivo. Наприклад, оцінюють вплив варіанта поліпептиду ActRIIa на експресію генів, які беруть участь в утворенні кісток або руйнуванні кісток. Таку оцінку у разі необхідності здійснюють у присутності одного або кількох рекомбінантних лігандних білків ActRIIa (наприклад, активіну), і клітини можуть бути трансфіковані таким чином, щоб створювати поліпептид ActRIIa та/або його варіанти та, необов'язково, ліганд ActRIIa. Подібним чином поліпептид ActRIIa вводять в організм миші або іншої тварини і оцінюють одну або кілька властивостей кістки, такі, як густина або об'єм. Також може оцінюватися швидкість зрощування переломів кісток. Двоенергетична рентгенівська абсорбціометрія (DEXA) є загальноприйнятим неінвазивним способом кількісної оцінки густини кістки у тварини. Для людей застосовують центральні системи DEXA з метою оцінки густини кістки у хребті та тазі. Вони найкращим чином прогнозують загальну густину кісток. Периферійні системи DEXA застосовують для оцінки густини кісток у периферійних кістках, включаючи, наприклад, кістки рук, зап'ястків, щиколоток та ступні. Традиційні системи рентгенівської візуалізації, включаючи САТ-сканування, застосовують для оцінки росту кісток та зрощування переломів. Також оцінюють механічну міцність кістки. Можуть бути створені комбінаторно отримані варіанти, які мають вибіркову або в цілому підвищену ефективність відносно природного поліпептиду ActRIIa. Подібним чином мутагенез може створювати варіанти, які мають внутрішньоклітинний період напіврозпаду, різко відмінний від показника відповідного поліпептиду ActRIIa дикого типу. Наприклад, змінений білок можна зробити більш стійким або менш стійким до протеолітичного розпаду або інших клітинних процесів, які в результаті ведуть до руйнування або інактивації природного поліпептиду ActRIIa. Такі варіанти та гени, які їх кодують, застосовують для зміни рівня поліпептиду ActRIIa шляхом модулювання періодів напіврозпаду поліпептидів ActRIIa. Наприклад, короткий період напіврозпаду може викликати більш короткочасний біологічний ефект і може забезпечувати більш жорсткий контроль рівня рекомбінантного поліпептиду ActRIIa в організмі пацієнта. У злитому білку Fc можуть здійснюватися мутації у лінкері (за наявності) та/або Fc-частині для зміни періоду напіврозпаду білка. Комбінаторну бібліотеку створюють через дегенеровану бібліотеку генів, які кодують бібліотеку поліпептидів, які можуть включати принаймні частину можливих послідовностей поліпептиду ActRIIa. Наприклад, суміш синтетичних олігонуклеотидів може бути ферментативно лігована у послідовності генів таким чином, щоб можливі нуклеотидні послідовності поліпептиду ActRIIa з дегенерованого набору могли експресуватися в окремих поліпептидах або, в альтернативному варіанті, як набір більших злитих білків (наприклад, для фагового дисплея). Існує багато способів створення бібліотеки потенційних гомологів з дегенерованої олігонуклеотидної послідовності. Хімічний синтез дегенерованої генної послідовності здійснюють в автоматичному синтезаторі ДНК і синтетичні гени після цього лігують у відповідний вектор для експресії. Синтез дегенерованих олігонуклеотидів є загальновідомим серед спеціалістів у даній галузі (див., наприклад, публікації Narang, SA (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al., (1981) Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier pp. 273-289; Itakura et al., (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science 198:1056; Ike et al., (1983) Nucleic Acid Res. 11:477). Такі способи застосовують для спрямованої еволюції інших білків (див., наприклад, публікації Scott et al., (1990) Science 249:386-390; Roberts et al., (1992) PNAS USA 89:2429-2433; Devlin et al., (1990) Science 249:404-406; Cwirla et al., (1990) PNAS USA 87:6378-6382; а також патенти США №№: 5,223,409, 5,198,346 та 5,096,815). В альтернативному варіанті для створення комбінаторної бібліотеки можуть застосовуватись інші форми мутагенезу. Наприклад, варіанти поліпептиду ActRIIa можуть бути утворені з виділені з бібліотеки шляхом відбору з застосуванням, наприклад, аланін-скануючого мутагенезу та інших подібних способів (Ruf et al., (1994) Biochemistry 33:1565-1572; Wang et al., (1994) J. Biol. Chem. 269:3095-3099; Balint et al., (1993) Gene 137:109-118; Grodberg et al., (1993) Eur. J. Biochem. 218:597-601; Nagashima et al., (1993) J. Biol. Chem. 268:2888-2892; Lowman et al., (1991) Biochemistry 30:10832-10838; та Cunningham et al., (1989) Science 244:1081-1085), шляхом лінкер-скануючого мутагенезу (Gustin et al., (1993) Virology 193:653-660; Brown et al., (1992) Моl. Cell Biol. 12:2644-2652; McKnight et al., (1982) Science 232:316); шляхом насичувального мутагенезу (Meyers et al., (1986) Science 232:613); шляхом PCR-мутагенезу (Leung et al., (1989) Method Cell Моl Biol 1:11-19); або шляхом випадкового мутагенезу, включаючи хімічний мутагенез, і т. ін. (Miller et al., (1992) A Short Course in Bacterial Genetics, 12 UA 115859 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY; та Greener et al., (1994) Strategies in Mol Biol 7:32-34). Лінкер-скануючий мутагенез, зокрема, у комбінаторних умовах, є привабливим способом розпізнавання зрізаних (біологічно активних) форм поліпептидів ActRIIa. Спеціалістам у даній галузі відомі різні способи скринінгу генних продуктів комбінаторних бібліотек, які одержують шляхом точкових мутацій та зрізання, тобто, фактично, скринінгу бібліотек кДНК генних продуктів, які мають певну властивість. Такі способи зазвичай можуть бути пристосовані для швидкого скринінгу бібліотек генів, створених шляхом комбінаторного мутагенезу поліпептидів ActRIIa. Найбільш поширені способи скринінгу великих бібліотек генів зазвичай включають клонування генної бібліотеки у репліковані вектори експресії, трансформацію відповідних клітин утвореною в результаті бібліотекою векторів та експресування комбінаторних генів в умовах, у яких виявлення потрібної активності забезпечує відносно легке виділення вектора, який кодує ген, продукт якого було виявлено. До аналізів, яким віддають перевагу, належать аналізи зв'язування активіну та аналізи опосередкованого активіном сигналу клітин. У деяких варіантах втілення поліпептиди ActRIIa згідно з винаходом також можуть включати посттрансляційні модифікації додатково до будь-яких, що є присутніми у поліпептидах ActRIIa у природі. До таких модифікацій, крім інших, належать ацетилування, карбоксилування, глікозилування, фосфорилування, ліпідування та ацилування. В результаті модифіковані поліпептиди ActRIIa можуть містити не амінокислотні елементи, такі, як поліетиленгліколі, ліпіди, полі- або моносахариди та фосфати. Вплив таких не амінокислотних елементів на функціональність поліпептиду ActRIIa може випробуватися, як описано авторами для інших варіантів поліпептиду ActRIIa. Коли поліпептид ActRIIa утворюється у клітинах шляхом розщеплення виникаючої форми поліпептиду ActRIIa, посттрансляційна обробка також може бути важливою для правильного складання та/або функціонування білка. Різні клітини (такі, як СНО, HeLa, MDCK, 293, WI38, NIH-3T3 або НЕК293) мають свою клітинну структуру та характерні механізми для такої посттрансляційної активності і можуть бути вибрані для забезпечення правильної модифікації та обробки поліпептидів ActRIIa. У деяких аспектах функціональні варіанти або модифіковані форми поліпептидів ActRIIa включають злиті білки, які мають принаймні частину поліпептидів ActRIIa та один або кілька злитих доменів. Прикладами загальновідомих таких злитих доменів є, крім інших, полігістидин, Glu-Glu, глутатіон-Б-трансфераза (GST), тіоредоксин, протеїн А, протеїн G, постійну ділянку важкого ланцюга імуноглобуліну (Fc), білок зв'язування мальтози (МВР) або альбумін людської сироватки. Злитий домен може бути вибраний таким чином, щоб забезпечувати потрібну властивість. Наприклад, деякі злиті домени є особливо корисними для виділення злитих білків шляхом афінної хроматографії. Для афінного очищення застосовують відповідні матриці для афінної хроматографії, такі, як кон'юговані з глутатіоном, амілазою та нікелем або кобальтом смоли. Багато з цих матриць існують у формі "набору", наприклад, система для очищення Pharmacia GST та система QIAexpress™ (Qiagen), які застосовують у моделях злиття (НІS 6). Як інший приклад, злитий домен може бути вибраний таким чином, щоб забезпечувати виявлення поліпептидів ActRIIa. Прикладами таких доменів виявлення є різні флуоресцентні білки (наприклад, GFP), а також "мітки епітопу", які зазвичай є короткими пептидними послідовностями, для яких існує специфічне антитіло. До загальновідомих міток епітопів, для яких існують легко доступні специфічні моноклональні антитіла, належать FLAG, гемаглютинін вірусу грипу (НА) та мітки с-myc. У деяких випадках злиті домени мають місце розщеплення протеазою, наприклад, для фактора Ха або тромбіну, яке дозволяє відповідній протеазі частково гідролізувати злиті білки і, таким чином, вивільнювати рекомбінантні білки. Вивільнені білки після цього можуть бути відокремлені від злитого домену шляхом наступного хроматографічного відокремлення. У деяких оптимальних варіантах втілення поліпептид ActRIIa є злитим з доменом, який стабілізує поліпептид ActRIIa in vivo ("стабілізуючий" домен). Під "стабілізацією" слід розуміти буд-який захід, який збільшує період напіврозпаду всироватці, незалежно від того, чи відбувається це через зменшення руйнування, зменшення виведення нирками або інший фармакокінетичний вплив. Відомо, що злиття з Fc частиною імуноглобуліну забезпечують потрібні фармакокінетичні властивості у різних білках. Подібним чином злиття з альбуміном людської сироватки також можуть забезпечувати потрібні властивості. До інших типів злитих доменів, які можуть бути вибрані, належать мультимеризуючі (наприклад, димеризуючі, тетрамеризуючі) домени та функціональні домени (які забезпечують додаткову біологічну функцію, таку, як стимулювання росту кісток або росту м'язів, якщо потрібно). Як конкретний приклад, у даному винаході пропонується злитий білок, який включає розчинний позаклітинний домен ActRIIa, злитий з Fc доменом (наприклад, SEQ ID NO: 6). 13 UA 115859 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Необов'язково Fc домен має одну або кілька мутацій у залишках, таких, як Asp-265, лізин 322 та Asn-434. У деяких випадках мутантний Fc домен, який має один або кілька з цих мутацій (наприклад, мутацію Asp-265) має знижену здатність до зв'язування з рецептором Fcγ порівняно з Fc доменом дикого типу. В інших випадках мутантний Fc домен, який має одну або кілька з цих мутацій (наприклад, мутацію Asn-434) має підвищену здатність до зв'язування з пов'язаним з МНС класу І Fc-рецептором (FcRN) порівняно з Fc доменом дикого типу. Слід розуміти, що різні елементи злитих білків можуть розташовуватися будь-яким чином, якщо це відповідає потрібній функціональності. Наприклад, поліпептид ActRIIa може бути розташований у С-кінцевій позиції до гетерологічного домену, або, в альтернативному варіанті, гетерологічний домен може бути розташований у С-кінцевій позиції до поліпептиду ActRIIa. Домен поліпептиду ActRIIa та гетерологічний домен не обов'язково мають прилягати до злитого білка, і додаткові домени або амінокислотні послідовності можуть бути включені у С- або Nкінцевій позиції до будь-якого домену або між доменами. У деяких варіантах втілення поліпептиди ActRIIa згідно з даним винаходом містять одну або кілька модифікацій, які є здатними стабілізувати поліпептиди ActRIIa. Наприклад, такі модифікації підвищують in vitro період напіврозпаду поліпептидів ActRIIa, збільшують період напіврозпаду поліпептидів ActRIIa в системі кровообігу або знижують протеолітичний розпад поліпептидів ActRIIa. До таких стабілізуючих модифікацій належать, крім інших, злиті білки (включаючи, наприклад, злиті білки, які включають поліпептид ActRIIa та стабілізуючий домен), модифікації місця глікозилування (включаючи, наприклад, додавання місця глікозилування до поліпептиду ActRIIa) та модифікації вуглеводного компонента (включаючи, наприклад, видалення вуглеводних компонентів з поліпептиду ActRIIa). У разі злитих білків поліпептид ActRIIa зливається зі стабілізуючим доменом, таким, як молекула IgG (наприклад, Fc доменом). Вжитий авторами термін "стабілізуючий домен" не лише стосується злитого домену (наприклад, Fc), як у разі злитих білків, але також включає небілкові модифікації, такі, як вуглеводний компонент, або небілковий полімер, такий, як поліетиленгліколь. У деяких варіантах втілення даний винахід забезпечує виділені та/або очищені форми поліпептидів ActRIIa, які є відокремленими або іншим чином є вільними від інших білків. Поліпептиди ActRIIa зазвичай утворюють шляхом експресії з рекомбінантних нуклеїнових кислот. 3. Нуклеїнові кислоти, які кодують поліпептиди ActRIIa У деяких аспектах винахід забезпечує виділені та/або рекомбінантні нуклеїнові кислоти, які кодують будь-які з поліпептидів ActRIIa (наприклад, розчинні поліпептиди ActRIIa), включаючи описані авторами фрагменти, функціональні варіанти та злиті білки. Наприклад, SEQ ID NO: 4 кодує природний поліпептид-прекурсор людського ActRIIa, a SEQ ID NO: 5 кодує оброблений позаклітинний домен ActRIIa. Дані нуклеїнові кислоти можуть бути одноланцюговими або дволанцюговими. Такі нуклеїнові кислоти можуть бути молекулами ДНК або РНК. Ці нуклеїнові кислоти можуть застосовуватися, наприклад, у способах одержання поліпептидів ActRIIa або як безпосередні терапевтичні агенти (наприклад, у генній терапії). У деяких аспектах слід розуміти, що до нуклеїнових кислот, які кодують поліпептиди ActRIIa, також належать нуклеїнові кислоти, які є варіантами SEQ ID NO: 4 або 5. До варіантів нуклеотидних послідовностей належать послідовності, які відрізняються заміщеннями, додаваннями або делеціями одного або кількох нуклеотидів, такі, як алельні варіанти. У деяких варіантах втілення винахід забезпечує виділені або рекомбінантні нуклеїновокислотні послідовності, які є принаймні на 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % або 100 % ідентичними SEQ ID NO: 4 або 5. Спеціалістові у даній галузі стане зрозуміло, що нуклеїновокислотні послідовності, комплементарні SEQ ID NO: 4 або 5, та варіанти SEQ ID NO: 4 або 5 також охоплюються обсягом цього винаходу. В інших варіантах втілення нуклеїновокислотні послідовності згідно з винаходом можуть бути виділеними, рекомбінантними та/або злитими з гетерологічною нуклеотидною послідовністю або у бібліотеці ДНК. В інших варіантах втілення нуклеїнові кислоти згідно з винаходом також включають нуклеотидні послідовності, які гібридизуються за дуже жорстких умов з нуклеотидною 14 UA 115859 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовністю, позначеною як SEQ ID NO: 4 або 5, комплементарною послідовністю SEQ ID NO: 4 або 5, або їх фрагменти. Як обговорювалося вище, спеціалістові у даній галузі легко стане зрозуміло, що відповідні жорсткі умови, які сприяють гібридизації ДНК, можуть бути різними. Спеціалістові у даній галузі легко стане зрозуміло, що відповідні жорсткі умови, які сприяють гібридизації ДНК, можуть бути різними. Наприклад, можна здійснювати гібридизацію при 6,0 х хлориду натрію/цитрату натрію (SSC) при приблизно 45 °C з наступним промиванням 2,0 х SSC при 50 °C. Наприклад, концентрація на етапі промивання може бути вибрана з-поміж умов від низької жорсткості приблизно 2,0 х SSC при 50 °C до високої жорсткості приблизно 0,2 х SSC при 50 °C. Крім того, температура на етапі промивання може бути збільшена від умов низької жорсткості при кімнатній температурі, приблизно 22 °C, до умов високої жорсткості при приблизно 65 °C. Температура та концентрація солей можуть змінюватися, або можуть підтримуватися на постійному рівні при варіюванні інших змінних. В одному варіанті втілення винахід забезпечує нуклеїнові кислоти, які гібридизуються за умов низької жорсткості 6 х SSC при кімнатній температурі з наступним промиванням at 2 х SSC при кімнатній температурі. Виділені нуклеїнові кислоти, які відрізняються від нуклеїнових кислот, представлених у SEQ ID NOs: 4 або 5, через дегенерацію у генетичному коді також охоплюються обсягом винаходу. Наприклад, багато амінокислот позначаються більш, ніж одним триплетом. Кодони, які визначають одну амінокислоту, або синоніми (наприклад, CAU та САС є синонімами гістидину) в результаті можуть вести до "мовчазних" мутацій, які не впливають на амінокислотну послідовність білка. Однак, за припущеннями поліморфізму послідовності ДНК, які призводять до змін в амінокислотних послідовностях даних білків, мають існувати у клітинах ссавців. Спеціалістові у даній галузі стане зрозуміло, що ці зміни в одному або кількох нуклеотидах (до приблизно 3-5 % нуклеотидів) нуклеїнових кислот, які кодують конкретний білок, можуть існувати серед особин даного виду через природну алельну варіацію. Будь-які і всі подібні варіації нуклеотидів та утворені в результаті амінокислотні поліморфізми охоплюються обсягом цього винаходу. У деяких варіантах втілення рекомбінантні нуклеїнові кислоти згідно з винаходом можуть бути функціонально зв'язаними з одним або кількома регуляторними нуклеотидними послідовностями в експресійній конструкції. Регуляторні нуклеотидні послідовності зазвичай мають бути прийнятними для клітини-хазяїна, яку використовують для експресії. Спеціалістам відомо багато типів прийнятних експресійних векторів та відповідних регуляторних послідовностей для різних клітин-хазяїв. Зазвичай вищезгадані одна або кілька регуляторних нуклеотидних послідовностей можуть включати, крім інших, промоторні послідовності, лідерні або сигнальні послідовності, місця зв'язування рибосом, транскрипційні стартові та термінуючі послідовності, трансляційні стартові або термінуючі послідовності та послідовності енхансерів або активаторів. Винахід охоплює конститутивні або індуцибельні промотори, відомі спеціалістам у даній галузі. Промотори можуть бути або природними промоторами, або гібридними промоторами, в яких поєднуються елементи кількох промоторів. Експресійна конструкція може бути присутньою в клітині на епісомі, такій, як плазміда, або ж експресійна конструкція може бути вставлена у хромосому. В оптимальному варіанті втілення експресійний вектор містить селектований ген-маркер, який дозволяє відбирати трансформовані клітинихазяї. Селектовані гени-маркери є загальновідомими серед спеціалістів у даній галузі і можуть бути різними для різних клітин-хазяїв. У деяких аспектах винаходу дана нуклеїнова кислота забезпечується в експресійному векторі, який включає нуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид ActRIIa і є функціонально зв'язаним з принаймні однією регуляторною послідовністю. Регуляторні послідовності є визнаними серед спеціалістів і вибираються таким чином, щоб спрямовувати експресію поліпептиду ActRIIa. Відповідним чином, термін "регуляторна послідовність" включає промотори, енхансери та інші елементи контролю експресії. Приклади регуляторних послідовностей описуються у публікації Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, СА (1990). Наприклад, будь-яка з різних послідовностей контролю експресії, яка контролює експресію послідовності ДНК, коли функціонально зв'язується з нею, може використовуватись у цих векторах для експресії послідовностей ДНК, які кодують поліпептид ActRIIa. До таких корисних послідовностей контролю експресії належать, наприклад, ранні та пізні промотори SV40, tet-промотор, безпосередній ранній промотор аденовірусу або цитомегаловірусу, RSV промотори, lас-система, trp-система, ТАС або TRC система, Т7 промотор, експресія якого спрямовується Т7 RNA полімеразою, головний оператор та промоторні ділянки фага лямбда, контрольні ділянки для вірусного білка fd, промотор для 3фосфогліцераткінази або інші гліколітичні ферменти, промотори кислотної фосфатази, наприклад, Pho5, промотори α-факторів спарювання дріжджів, промотор поліедрону 15 UA 115859 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 бакуловірусної системи та інші послідовності, про які відомо, що вони контролюють експресію генів прокаріотних або еукаріотних клітин або їх вірусів, та їх різні комбінації. Слід розуміти, що будова експресійного вектора може залежати від таких чинників, як вибір клітини-хазяїна, яка піддається перетворенню, та/або тип білка, який має бути експресований. Крім того, також слід враховувати кількість копій вектора, здатність до контролювання цієї кількості копій та експресія будь-якого іншого білка, який кодується вектором, таким, як антибіотичні маркери. Рекомбінантна нуклеїнова кислота згідно з винаходом може бути утворена шляхом лігування клонованого гена або його частини у вектор, придатний для експресії в прокаріотних клітинах, еукаріотних клітинах (дріжджів, птахів, комах або ссавців), або і тих, і інших. Носіями експресії для створення рекомбінантного поліпептиду ActRIIa є плазміди та інші вектори. Наприклад, до прийнятних векторів належать плазміди таких типів: похідні від pBR322 плазміди, похідні від pEMBL плазміди, похідні від рЕХ плазміди, похідні від рВТас плазміди та похідні від pUC плазміди для експресії у прокаріотних клітинах, таких, як Е. coli. Деякі експресійні вектори ссавців містять прокаріотні послідовності для сприяння поширенню вектора у бактеріях, та одну або кілька еукаріотних транскрипційних одиниць, які експресуються в еукаріотних клітинах. Похідні від pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo та pHyg вектори є прикладами експресійних векторів ссавців, придатних для трансфекції еукаріотних клітин. Деякі з цих векторів модифікують послідовностями з бактеріальних плазмід, таких, як pBR322, для сприяння реплікації та вибору резистентності до медикаменту в прокаріотних та еукаріотних клітинах. В альтернативному варіанті похідні вірусів, таких, як вірус папіломи великої рогатої худоби (BPV-1) або вірус Епштейна-Барр (похідні від pHEBo, pREP та р205) можуть застосовуватися для короткочасної експресії білків в еукаріотних клітинах. Приклади інших вірусних (включаючи ретровірусні) експресійних систем можна знайти нижче в описі систем забезпечення генної терапії. Різні способи, які застосовують в одержанні плазмід та трансформації організмів-хазяїнів, є загальновідомими серед спеціалістів у даній галузі. Інші прийнятні експресійні системи для прокаріотних та еукаріотних клітин, а також загальні рекомбінантні процедури описуються у публікації Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3rd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001). У деяких випадках може бути бажаною експресія рекомбінантних поліпептидів шляхом застосування бакуловірусної експресійної системи. Прикладами таких бакуловірусних експресійних систем є похідні від pVL вектори (такі, як pVL1392, pVL1393 та pVL941), похідні від pAcUW вектори (такі, як pAcUWl) та похідні від pBlueBac вектори (такі, як pBlueBac III, що містить β-gal). В оптимальному варіанті втілення для утворення потрібних поліпептидів ActRIIa у клітинах СНО призначається вектор, такий, як вектор Pcmv-Script (Stratagene, La Jolla, Calif.), вектори pcDNA4 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) та вектори pCI-neo (Promega, Madison, Wise). Як стане зрозуміло, потрібні послідовності генів застосовують для викликання експресії потрібних поліпептидів ActRIIa у клітинах, які поширюються у культурі, наприклад, для утворення білків, включаючи злиті білки або варіанти білків, для очищення. Цей винахід також стосується клітини-хазяїна, трансфікованої рекомбінантним геном, який включає кодуючу послідовність (наприклад, SEQ ID NO: 4 або 5) для одного або кількох потрібних поліпептидів ActRIIa. Клітина-хазяїн може бути будь-якою прокаріотною або еукаріотною клітиною. Наприклад, поліпептид ActRIIa згідно з винаходом може експресуватися в бактеріальних клітинах, таких, як Е. coli, клітинах комах (наприклад, з застосуванням бакуловірусної експресійної системи), клітинах дріжджів або ссавців. Інші прийнятні клітинихазяї є відомими спеціалістам у даній галузі. Відповідно, даний винахід також стосується способів створення потрібних поліпептидів ActRIIa. Наприклад, клітина-хазяїн, трансфікована експресійним вектором, який кодує поліпептид ActRIIa, може бути культивована за відповідних умов, які дозволяють відбуватись експресії поліпептиду ActRIIa. Поліпептид ActRIIa може бути секретований і виділений з суміші клітин та середовища, яка містить поліпептид ActRIIa. В альтернативному варіанті поліпептид ActRIIa може утримуватись у цитоплазмі або у мембранній фракції, і клітини збирають, піддають лізісові й білок відокремлюють. Культура клітин включає клітини-хазяї, середовища та інші побічні продукти. Придатні середовища для клітинної культури є загальновідомими серед спеціалістів у даній галузі. Потрібні поліпептиди ActRIIa можуть бути відокремлені від середовища культури клітин, клітин-хазяїв або і того, й іншого, з застосуванням відомих спеціалістам способів очищення білків, включаючи іонообмінну хроматографію, гельфільтрацію, ультрафільтрацію, електрофорез, імуноафінне очищення антитілами, специфічними до конкретних епітопів поліпептидів ActRIIa, та афінне очищення агентом, який зв'язується з доменом, злитим з поліпептидом ActRIIa (наприклад, колонку протеїну А 16 UA 115859 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 застосовують для очищення злиття ActRIIa-Fc). В оптимальному варіанті втілення поліпептид ActRIIa є злитим білком, який містить домен, який сприяє його очищенню. В оптимальному варіанті втілення очищення досягають за допомогою серії етапів колонкової хроматографії, включаючи, наприклад, три або більше з нижчезазначених етапів у будь-якому порядку: хроматографію білка А, хроматографію на Q-сефарозі, хроматографію на фенілсефарозі, хроматографію з виключенням за розміром та катіонообмінну хроматографію. Очищення може довершуватися вірусною фільтрацією та зміною буфера. Як було продемонстровано авторами, білок ActRHa-hFc очищали до ступеня очищення >98 %, як визначають шляхом хроматографії з виключенням за розміром і >95 %, як визначають шляхом SDS PAGE. Цей рівень очищення був достатнім для досягнення потрібного впливу на кістки у мишей та прийнятного профілю безпеки у мишей, щурів та відмінних від людини приматів. В іншому варіанті втілення, злитий ген, який кодує лідерну послідовність очищення, таку, як послідовність ділянки розщеплення полі-(Нis)/ентерокіназою на N-кінці потрібної частини рекомбінантного поліпептиду ActRIIa, може забезпечувати очищення експресованого злитого 2+ білка шляхом афінної хроматографії з застосуванням смола з іоном металу Ni . Лідерна послідовність очищення після цього може бути видалена шляхом обробки ентерокіназою для забезпечення очищеного поліпептиду ActRIIa (див., наприклад, публікації Hochuli et al., (1987) J. Chromatography 411:177; та Janknecht et al., PNAS USA 88:8972). Способи одержання злитих генів є загальновідомими. По суті, з'єднання різних фрагментів ДНК, які кодують різні поліпептидні послідовності, здійснюють згідно з традиційними способами з застосуванням blunt-ended або stagger-ended кінців для лігування, гідролізу рестрикційним ферментом для забезпечення потрібних кінців, заповнення когезивних кінців у відповідних випадках, обробки лужною фосфатазою для уникнення небажаного приєднання та ферментного лігування. В іншому варіанті втілення злитий ген може бути синтезований традиційними способами, включаючи застосування автоматичних синтезаторів ДНК. В альтернативному варіанті здійснюють PCR-ампліфікацію фрагментів генів, застосовуючи якірні праймери, які викликають комплементарні виступи між двома послідовними фрагментами генів, які згодом можуть бути випалені для створення химерної послідовності гена (див., наприклад, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992). 4. Альтернативні антагоністи активіну та ActRIIa Представлені авторами дані демонструють, що антагоністи сигналу активіну-ActRIIa можуть застосовуватися для сприяння ростові кісток та мінералізації кісток. Хоча розчинні поліпептиди ActRIIa, зокрема, ActRIIa-Fc, є оптимальними антагоністами, і хоча такі антагоністи можуть впливати на кістки через механізм, відмінний від антагонізму до активіну (наприклад, інгібування активіну може бути показником схильності агента до інгібування активності спектра молекул, включаючи, можливо, інші члени надродини TGF-бета, і таке колективне інгібування може забезпечувати потрібний вплив на кістку), інші типи антагоністів активіну-ActRIIa також можуть бути корисними, включаючи антитіла проти активіну (наприклад, А, В, С або Е), антитіла проти ActRIIa, антисмислові, RNAi або рибозимні нуклеїнові кислоти, які інгібують продукування ActRIIa, та інші інгібітори активіну або ActRIIa, зокрема, ті, які розривають зв'язування активінуActRIIa. Антитіло, яке специфічно реагує з поліпептидом ActRIIa (наприклад, розчинним поліпептидом ActRIIa) і яке конкурентно зв'язується з лігандом з поліпептидом ActRIIa або іншим чином інгібує опосередкований ActRIIa сигнал, може застосовуватись як антагоніст активності поліпептиду ActRIIa. Подібним чином антитіло, яке специфічно реагує з поліпептидом активіном А і розриває зв'язування ActRIIa, може застосовуватись як антагоніст. Шляхом застосування імуногенів, які походять від поліпептиду ActRIIa або поліпептиду активіну, за допомогою стандартних протоколів одержують протибілкові / протипептидні протисироватки або моноклональні антитіла (див., наприклад, Antibodies: A Laboratory Manual ed. by Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press: 1988)). Ссавець, такий, як миша, хом'як або кріль, може бути імунізований імуногенною формою поліпептиду ActRIIa, антигенним фрагментом, який здатен викликати реакцію на антитіло, або злитим білком. До способів забезпечення імуногенності для білка або пептиду, належать кон'югація з носіями або інші способи, загальновідомі серед спеціалістів у даній галузі. Імуногенну частину поліпептиду ActRIIa або активіну вводять у присутності ад'юванта. За процесом імунізації спостерігають через виявлення титрів антитіла у плазмі або сироватці. Для оцінки рівня антитіл застосовують стандартний аналіз ELISA або інші імуноаналізи з імуногеном як антигеном. Після імунізації тварини антигенною композицією поліпептиду ActRIIa одержують антисироватки і, у разі необхідності, поліклональні антитіла можуть бути відокремлені від сироватки. Для одержання моноклональних антитіл продукуючі антитіло клітини (лімфоцити) 17 UA 115859 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 беруть у імунізованої тварини і зливають шляхом стандартного злиття соматичних клітин з імморталізуючими клітинами, такими, як клітини мієломи, для утворення клітин гібридоми. Такі способи є загальновідомими серед спеціалістів у даній галузі, і до них належать, наприклад, гібридомна технологія (вперше розроблена Колером та Мільштейном, (1975) Nature, 256: 495497), гібридомна технологія з застосуванням людських В-клітин (Kozbar et al., (1983) Immunology Today, 4: 72) та EBV-гібридомна технологія для одержання людських моноклональних антитіл (Cole et al., (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp. 77-96). Клітини гібридоми відбирають імунохімічним способом на продукування антитіл, які специфічно реагують з поліпептидом ActRIIa, та моноклональними антитілами, виділеними з культури, яка включає такі клітини гібридоми. Вжитий авторами термін "антитіло" включає його фрагмент, які також специфічно реагують з даним поліпептидом. Антитіла фрагментують, застосовуючи традиційні способи, і фрагменти відпирають на придатність таким самим способом, як описано вище для цілих антитіл. Наприклад, F(ab)2 фрагменти можуть бути утворені шляхом обробки антитіла пепсином. Одержаний в результаті F(ab)2 фрагмент піддають обробці для відновлення дисульфідних містків з метою утворення Fab фрагментів. Антитіло згідно з даним винаходом також має включати біспецифічні, одноланцюгові, химерні, олюднені та повністю людські молекули, які мають афінність до поліпептиду ActRIIa або активіну, яка забезпечується принаймні однією ділянкою CDR антитіла. Антитіло також може включати мітку, яка приєднується до нього і може бути виявлена (наприклад, мітка може бути радіоізотопом, флуоресцентною сполукою, ферментом або кофактором ферменту). У деяких варіантах втілення антитіло є рекомбінантним антитілом, і цей термін охоплює будь-яке антитіло, утворене частково за допомогою технологій молекулярної біології, включаючи CDR-прищеплені або химерні антитіла, людські або інші антитіла, складені з вибраних з бібліотеки доменів антитіл, одноланцюгові антитіла та однодоменні антитіла (наприклад, людські VН білки або came lid VНН білки). У деяких варіантах втілення антитіло згідно з винаходом є моноклональним антитілом, і у деяких варіантах втілення винахід дозволяє застосовувати способи утворення нових антитіл. Наприклад, спосіб утворення моноклонального антитіла, яке специфічно зв'язується з поліпептидом ActRIIa або активіном, може включати введення миші кількості імуногенної композиції, яка включає антигенний поліпептид, ефективний для стимуляції імунної реакції, що піддається виявленню, отримання продукуючих антитіло клітин (наприклад, клітин селезінки) з миші та злиття продукуючих антитіло клітин з клітинами мієломи для отримання продукуючих антитіло гібридом та випробування продукуючих антитіло гібридом для розпізнавання гібридоми, яка виробляє моноклональне антитіло, яке специфічно зв'язується з антигеном. Після отримання гібридома може бути поширена у культурі клітин, необов'язково в умовах культивування, за яких похідні від гібридоми клітини виробляють моноклональне антитіло, яке специфічно зв'язується з антигеном. Моноклональне антитіло може бути очищене від культури клітин. Вираз "специфічно реагує з", який стосується антитіла, означає, у загальноприйнятому у галузі значенні, що антитіло має достатню селективність між потрібним антигеном (наприклад, поліпептидом ActRIIa) та іншими антигенами, які не мають відношення до призначення цього антитіла, принаймні виявляє присутність потрібного антигенна у конкретному типі біологічного зразка. Згідно з деякими способами застосування антитіла, наприклад, з терапевтичними цілями, може бути бажаним більш високий ступінь специфічності зв'язування. Моноклональні антитіла зазвичай мають більшу схильність (порівняно з поліклональними антитілами) до ефективного розрізнення між потрібними антигенами та перехресно реагуючими поліпептидами. Одна з характеристик, яка впливає на специфічність антитіла: взаємодія з антигеном є афінністю антитіла до антигена. Хоча потрібна специфічність може бути досягнута при різних рівнях афінності, перевагу зазвичай віддають антитілам, які мають афінність -6 -7 -8 -9 (константу дисоціації) приблизно 10 , 10 , 10 , 10 або меншу. Якщо врахувати надзвичайно тісне зв'язування між активіном та ActRIIa, слід очікувати, що нейтралізуюче антитіло проти -10 активіну або ActRIIa зазвичай матиме константу дисоціації 10 або меншу. Крім того, способи, які застосовують для відбору антитіл з метою розпізнавання потрібного антитіла, можуть впливати на властивості одержаного антитіла. Наприклад, якщо антитіло має застосовуватися для зв'язування антигена у розчині, може бути бажаним випробування зв'язування розчину. Існують різні інші способи випробування взаємодії між антитілами та антигенами для розпізнавання особливо потрібних антитіл. До таких способів належать аналізи ELISA, аналізи зв'язування на основі поверхневого плазмонного резонансу (наприклад, аналіз зв'язування Biacore™, Biacore AB, Uppsala, Sweden), сендвіч-аналізи (наприклад, система 18 UA 115859 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 парамагнітних кульок від IGEN International, Inc., Gaithersburg, Maryland), вестерн-блотинг, аналізи імунопреципітації та імуногістохімія. Прикладами категорій нуклеїновокислотних сполук, які є антагоністами активіну або ActRIIa, є антисмислові нуклеїнові кислоти, послідовності RNAi (РНК-інтерференції) та каталітичні нуклеїновокислотні послідовності. Нуклеїновокислотна сполука може бути одно- або дволанцюговою. Дволанцюгова сполука також може включати ділянки нависання або некомплементарності, в яких один або інший з ланцюгів є одинарним. Одноланцюгова сполука може включати ділянки самокомплементарності, що означає, що сполука утворює так звану "шпильку" або "stem-loop" структуру, з ділянкою подвійної спіральної структури. Нуклеїновокислотна сполука може включати нуклеотидну послідовність, яка є комплементарною ділянці, яка складається не більше, ніж з 1000, не більше, ніж з 500, не більше, ніж з 250, не більше, ніж з 100 або не більше, ніж з 50, 35, 30, 25, 22, 20 або 18 нуклеотидів нуклеїновокислотної послідовності ActRIIa або нуклеїновокислотної послідовності активіну βА або активіну βВ повної довжини. Ділянка компліментарності в оптимальному варіанті має принаймні 8 нуклеотидів, необов'язково принаймні 10 або принаймні 15 нуклеотидів і, необов'язково, від 15 до 25 нуклеотидів. Ділянка компліментарності може бути частиною інтрона, кодуючої послідовності або некодуючої послідовності заданого транскрипту, наприклад, частиною кодуючої послідовності. Зазвичай нуклеїновокислотна сполука має довжину від приблизно 8 до приблизно 500 нуклеотидів або пар основ, необов'язково довжина може складати від приблизно 14 до приблизно 50 нуклеотидів. Нуклеїновою кислотою може бути ДНК (зокрема, якщо застосовується як антисмислова), РНК або гібрид РНК:ДНК. Будь-який ланцюг може включати суміш ДНК та РНК, а також модифіковані форми, які не можуть бути напевно класифіковані як ДНК або РНК. Подібним чином, дволанцюгова сполука може являти собою ДНК:ДНК, ДНК:РНК або РНК:РНК, і будь-який ланцюг також може включати суміш ДНК та РНК, а також модифіковані форми, які не можуть бути напевно класифіковані як ДНК або РНК. Нуклеїновокислотна сполука може включати будь-яку з різних модифікацій, включаючи одну з модифікацій основного ланцюга (цукрово-фосфатну частину у природній нуклеїновій кислоті, включаючи міжнуклеотидні зв'язки) або основну частину (пуринову або піримідинову частину природної нуклеїнової кислоти). Антисмислова нуклеїновокислотна сполука в оптимальному варіанті має довжину від приблизно 15 до приблизно 30 нуклеотидів і часто містить одну або кілька модифікацій для поліпшення таких характеристик, як стійкість у сироватці, у клітині або у місці, до якого сполука може доставлятися, наприклад, у шлунку, якщо сполуки вводять перорально, та легенях, якщо сполуку вводять шляхом інгаляції. У разі послідовності RNAi ланцюг, комплементарний заданому транскриптові, зазвичай являє собою РНК або його модифікації. Іншим ланцюгом може бути РНК, ДНК або будь-який інший варіант. Подвійна частина дволанцюгової або одноланцюгової послідовності "шпильки" RNAi в оптимальному варіанті має довжину від 18 до 40 нуклеотидів, необов'язково, приблизно від 21 до 23 нуклеотидів, якщо вона служить як Dicer-субстрат. Каталітичні або ферментні нуклеїнові кислоти можуть бути ферментами рибозимів або ДНК і також можуть містити модифіковані форми. Нуклеїновокислотні сполуки можуть інгібувати експресію мішені приблизно на 50 %, 75 %, 90 % або більше при контакті з клітинами за фізіологічних умов і при концентрації, за якої несмисловий або смисловий контроль не має або майже не має впливу. Оптимальна концентрація для випробування впливу нуклеїновокислотних сполук становить 1,5 та 10 мікромолярів. Нуклеїновокислотні сполуки також можуть випробуватися на вплив, наприклад, на ріст та мінералізацію кісток. 5. Скринінгові аналізи У деяких аспектах даний винахід стосується застосування поліпептидів ActRIIa (наприклад, розчинних поліпептидів ActRIIa) та поліпептидів активіну для розпізнавання сполук (агентів), які є агоністами або антагоністами шляху сигналу активіну-ActRIIa. Сполуки, розпізнані шляхом такого відбору, піддають випробуванню на їхню здатність до модулювання росту або мінералізації кісток in vitro. Необов'язково ці сполуки також можуть випробуватися у тваринних моделях для оцінки їх здатності до модулювання росту тканини in vivo. Існує багато підходів до відбору терапевтичних агентів на модулювання росту тканин шляхом спрямування активіну та поліпептидів ActRIIa. У деяких варіантах втілення високопродуктивний відбір сполук здійснюють для розпізнавання агентів, які перешкоджають опосередкованому активіном або ActRIIa впливові на кістки. У деяких варіантах втілення здійснюють аналіз для відбору та розпізнавання сполук, які специфічно інгібують або зменшують зв'язування поліпептиду ActRIIa з активіном. В альтернативному варіанті аналіз застосовують для розпізнавання сполук, які посилюють зв'язування поліпептиду ActRIIa з 19 UA 115859 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 активіном. В іншому варіанті втілення сполуки розпізнають за їхньою здатністю до взаємодії з поліпептидом активіном або ActRIIa. Існує достатня кількість різних форматів аналізу, і в контексті даного винаходу навіть ті, які спеціально не було описано, також можуть розглядатися спеціалістами у даній галузі. Як описано авторами, випробувані сполуки (агенти) згідно з винаходом можуть бути утворені з застосуванням будь-якого комбінаторного хімічного способу. В альтернативному варіанті дані сполуки можуть бути природними біомолекулами, синтезованими in vivo або in vitro. Сполуки (агенти), які підлягають випробуванню на їх здатність діяти як модулятори росту тканини, можуть вироблятися, наприклад, бактеріями, дріжджами або іншими організмами (наприклад, природні продукти), вироблятися хімічним шляхом (наприклад, малі молекули, включаючи пептидоміметики) або рекомбінантним шляхом. До випробуваних сполук, які охоплюються даним винаходом, належать непептидильні органічні молекули, пептиди, поліпептиди, пептидоміметики, цукри, гормони та молекули нуклеїнових кислот. У конкретному варіанті втіленнявипробуваним агентом є мала органічна молекула, яка має молекулярну масу, меншу, ніж приблизно 2000 дальтонів. Випробувані сполуки згідно з винаходом можуть забезпечуватися як окремі, дискретні утворення, або можуть забезпечуватися у більш складних бібліотеках, наприклад, утворюватися за допомогою комбінаторної хімії. Ці бібліотеки можуть включати, наприклад, спирти, алкілгаліди, аміни, аміди, естери, альдегіди, етери та інші класи органічних сполук. Подача випробуваних сполук у випробувальну систему може відбуватися або у відокремленій формі, або у формі сумішей сполук, зокрема, на етапах первісного відбору. Сполуки необов'язково можуть бути дериватизовані іншими сполуками, які мають дериватизуючі групи, які сприяють відокремленню сполук. Не обмежувальними прикладами дериватизуючих груп є біотин, флуоресцеїн, дигоксигенін, зелений флуоресцентний білок, ізотопи, полігістидин, магнітні кульки, глутатіон-Б-трансфераза (GST), фотоактивовані крослінкери або будь-які їх комбінації. У багатьох програмах відбору медикаментів, у яких випробують бібліотеки сполук та природні екстракти, бажаними є високопродуктивні аналізи, які дозволяють досягати максимальної кількості сполук, досліджуваних за даний період часу. Аналізам, які здійснюють у безклітинних системах, таких, як ті, що можуть бути дериватизовані очищеними або напівочищеними білками, часто віддають перевагу як "первинним" тестам, оскільки вони можуть бути розроблені таким чином, щоб забезпечувалися швидкий розвиток та відносно легке виявлення змін у молекулярній мішені, яка опосередковується випробуваною сполукою. Крім того, вплив клітинної токсичності або біодоступності випробуваної сполуки може в цілому не враховуватися в in vitro системі, і аналіз натомість зосереджується, головним чином, на впливі медикаменту на молекулярну мішень, який може виявлятись у зміні афінності зв'язування між поліпептидом ActRIIa та активіном. Виключно для пояснення у наведеному для прикладу скринінговому аналізі згідно з даним винаходом потрібну сполуку приводять у контакт з виділеним і очищеним поліпептидом ActRIIa, який зазвичай може зв'язуватися з активіном. До суміші сполуки та поліпептиду ActRIIa потім додають композицію, яка містить ліганд ActRIIa. Виявлення та визначення кількості комплексів ActRIIa/активіну забезпечує засіб визначення ефективності сполуки при інгібуванні (або посиленні) утворення комплексу між поліпептидом ActRIIa та активіном. Ефективність сполуки може визначатися шляхом побудови кривої реакції на дозу на основі даних, отриманих з застосуванням різних концентрацій випробуваної сполуки. Крім того, також може здійснюватися контрольний аналіз для забезпечення основи для порівняння. Наприклад, у контрольному аналізі виділений і очищений активін додають до композиції, яка містить поліпептид ActRIIa, і утворення комплексу ActRIIa/активіну кількісно визначають за відсутності випробуваної сполуки. Слід розуміти, що, як правило, порядок, у якому домішують реагенти, може змінюватися, або вони можуть змішуватись одночасно. Крім того, замість очищених білків можуть застосовуватися клітинні екстракти та лізати для забезпечення придатної безклітинної системи для аналізу. Утворення комплексу між поліпептидом ActRIIa та активіном може виявлятися різними способами. Наприклад, модулювання утворення комплексів піддають кількісному аналізові з застосуванням, наприклад, білків з мітками, які піддаються виявленню, наприклад, радіоактивно міченого (наприклад, Р, S, С або Н), флуоресцентно міченого (наприклад, FITC) або ферментативно міченого поліпептиду ActRIIa або активіну, шляхом імуноаналізу або через виявлення за допомогою хроматографії. У деяких варіантах втілення даний винахід передбачає застосування аналізи з поляризацією флуоресценції та передачею енергії через флуоресцентний резонанс (FRET) для вимірювання, прямого або непрямого, ступеня взаємодії між поліпептидом ActRIIa та його зв'язувальним 20 UA 115859 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 білком. Крім того, інші режими виявлення, наприклад, на основі світловодів (Публікація РСТ WO 96/26432 та Патент США № 5,677,196), поверхневого плазмонного резонансу (SPR), детекторів поверхневих зарядів та датчиків поверхневих зусиль, також є сумісними з багатьма варіантами втілення винаходу. Крім того, даний винахід передбачає застосування аналізу "interaction trap", також відомого як "двогібридний аналіз", для розпізнавання агентів, які розривають або посилюють взаємодію між поліпептидом ActRIIa та його зв'язувальним білком. Див., наприклад, Патент США № 5,283,317; Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232; Madura et al. (1993) J Biol Chem 268:12046-12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14:920-924; та Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696). У конкретному варіанті втілення даний винахід передбачає застосування обернених двогібридних систем для розпізнавання сполук (наприклад, малих молекул або пептидів), які роз'єднують взаємодію між поліпептидом ActRIIa та його зв'язувальним білком. Див., наприклад, Vidal and Legrain, (1999) Nucleic Acids Res 27:919-29; Vidal and Legrain, (1999) Trends Biotechnol 17:374-81; та патенти США №№ 5,525,490; 5,955,280; та 5,965,368. У деяких варіантах втілення дані сполуки розпізнають за їхньою здатністю до взаємодії з ActRIIa або поліпептидом активіном згідно з винаходом. Взаємодія між сполукою та ActRIIa або поліпептидом активіном може бути ковалентною або нековалентною. Наприклад, така взаємодія може бути розпізнана на рівні білка з застосуванням in vitro біохімічних способів, включаючи фотозшивання, радіоактивно мічене лігандне зв'язування та афінну хроматографію (Jakoby WB et al., 1974, Methods in Enzymology 46: 1). У деяких випадках сполуки відбирають шляхом аналізу на основі механізму, такого, як аналіз для виявлення сполук, які зв'язуються з поліпептидом активіном або ActRIIa. Зв'язування може відбуватись у твердій фазі або рідкій фазі. В альтернативному варіанті ген, який кодує поліпептид активін або ActRIIa, може бути трансфікований з репортерною системою (наприклад, β-галактозидазою, люциферазою або зеленим флуоресцентним білком) у клітину і відібраний з бібліотеки, в оптимальному варіанті шляхом високопродуктивного скринінгу або з окремими представниками бібліотеки. Можуть застосовуватися й інші аналізи зв'язування на основі механізму, наприклад, аналізи зв'язування, які дозволяють виявляти зміни у вільній енергії. Аналізи зв'язування здійснюють з мішенню, прикріпленою до комірки, кульки або чипа, або захопленою іммобілізованим антитілом або розкладеною шляхом капілярного електрофорезу. Зв'язані сполуки зазвичай виявляють, застосовуючи колориметрію або флуоресценцію або поверхневий плазмонний резонанс. У деяких аспектах даний винахід забезпечує способи та агенти для модулювання (стимулювання або інгібування) формування кісток та збільшення кісткової маси. Таким чином, будь-яка розпізнана сполука може бути випробувана у цілих клітинах або тканинах, in vitro або in vivo, для підтвердження їх здатності до модулювання росту або мінералізації кісток. Для цього можуть застосовуватися будь-які способи, відомі спеціалістам у даній галузі. Наприклад, вплив поліпептидів ActRIIa або активіну або випробуваних сполук на ріст кісток або хрящів може визначатися шляхом вимірювання індукції Msx2 або диференціації osteoprogenitor-клітин в остеобласти в аналізах на основі клітин (див., наприклад, Daluiski et al., Nat Genet. 2001, 27(l):84-8; Hino et al., Front Biosci. 2004, 9:1520-9). Інший приклад аналізів на основі клітин включає аналіз остеогенної активності певних поліпептидів ActRIIa або активіну та випробуваних сполук у мезенхімальних попередниках та остеобластних клітинах. Наприклад, рекомбінантні аденовіруси, які експресують поліпептид активін або ActRIIa, можуть бути побудовані для інфікування плюрипотентних мезенхімальних клітин-попередників С3Н10Т1/2, преостеобластних клітин С2С12 та остеобластних клітин ТЕ-85. Остеогенну активність потім визначають шляхом вимірювання індукції лужної фосфатази, остеокальцину та мінералізації матриксу (див., наприклад, Cheng et al, J bone Joint Surg Am. 2003, 85-A(8): 1544-52). Даний винахід також передбачає in vivo аналізи для вимірювання росту кісток або хрящів. Наприклад, у публікації Namkung-Matthai et al., Bone, 28:80-86 (2001), описується щуряча модель остеопорозу, в якій досліджується зрощування кісток під час раннього періоду після перелому. У публікації Kubo et al., Steroid Biochemistry & Molecular Biology, 68:197-202 (1999), також описується щуряча модель остеопорозу, в якій досліджується зрощування кісток під час пізнього періоду після перелому. У публікації Andersson et al., J. Endocrinol. 170:529-537, описується мишача модель остеопорозу, в якій мишей піддають оваріектомії, через яку миші втрачають значну частину вмісту кісткових мінералів та густини кісткових мінералів, причому трабекулярна кістка втрачає приблизно 50 % густини кісткових мінералів. Густина кістки у підданих оваріектомії мишей може бути збільшена через введення таких факторів, як паратиреоїдний гормон. У деяких аспектах даний винахід дозволяє застосовувати аналізи зрощування переломів, які є відомими спеціалістам у даній галузі. До цих аналізів належать спосіб дослідження перелому, гістологічний аналіз та біомеханічний аналіз, які описуються, 21 UA 115859 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 наприклад, у Патенті США № 6,521,750, включений шляхом посилання у повному обсязі з описом експериментальних протоколів викликання, а також вимірювання ступеня переломів та процесу їх зрощування. 6. Приклади терапевтичного застосування У деяких варіантах втілення антагоністи активіну-ActRIIa (наприклад, поліпептиди ActRIIa) згідно з даним винаходом застосовують для лікування або профілактики хвороби або стану, пов'язаних з пошкодженням кісток, наприклад, через перелом, втрату або демінералізацію. У деяких варіантах втілення даний винахід забезпечує способи лікування або профілактики пошкодження кісток у суб'єкта, який цього потребує, через введення суб'єктові терапевтично ефективної кількості антагоніста активіну-ActRIIa, зокрема, поліпептиду ActRIIa. У деяких варіантах втілення даний винахід забезпечує способи сприяння ростові кісток або мінералізації кісток у суб'єкта, який цього потребує, через введення суб'єктові терапевтично ефективної кількості антагоніста активіну-ActRIIa, зокрема, поліпептиду ActRIIa. Ці способи в оптимальному варіанті є спрямованими на терапевтичне або профілактичне лікування тварин, у ще кращому варіанті - людей. У деяких варіантах втілення винахід забезпечує застосування антагоністів активіну-ActRIIa (зокрема, розчинних поліпептидів ActRIIa та нейтралізуючих антитіл, спрямованих на активін або ActRIIa) для лікування від порушень, пов'язаних з низькою густиною кісток або зниженою міцністю кісток. У контексті даного опису терапевтичний засіб, який "запобігає" порушенню або станові, стосується сполуки, яка, у статистичній вибірці, знижує кількість випадків порушення або стану у групі, яку піддавали лікуванню, порівняно з контрольною групою, яка не отримувала лікування, або затримує початок або знижує тяжкість одного або кількох симптомів порушення або стану порівняно з контрольною групою, яка не отримувала лікування. Вжитий авторами термін "лікування" включає профілактику вказаного стану або поліпшення або усунення стану після його виникнення. У будь-якому разі запобігання або лікування можуть бути виявлені через діагноз, поставлений лікарем, та бажаний результат ведення терапевтичного засобу. Винахід забезпечує способи викликання формування кісток та/або хрящів, запобігання втраті кісткової маси, підвищення мінералізації кісток або запобігання демінералізацїї кісток. Наприклад, дані антагоністи активіну-ActRIIa можуть застосовуватися для лікування остеопорозу та зрощування переломів кісток та виправлення дефектів хрящів у людей та тварин. Поліпептиди ActRIIa або активін можуть застосовуватися для пацієнтів, у яких було діагностовано субклінічну низьку густину кісток, як засіб захисту від розвитку остеопорозу. В одному конкретному варіанті втілення способи та композиції згідно з даним винаходом можуть мати медичне застосування для зрощування переломів кісток та виправлення дефектів хрящів у людей та тварин. Дані способи та композиції також можуть мати профілактичне застосування при закритих та відкритих переломах, а також для поліпшення фіксації штучних суглобів. Відновлення формування кісток, викликане остеогенним агентом, сприяє виправленню природжених, викликаних травмою або викликаних онкологічною резекцією черепно-лицьових дефектів, а також може застосовуватись у косметичній пластичній хірургії. У деяких випадках дані антагоністи активіну-ActRIIa можуть забезпечувати середовище, привабливе для клітин, які формують кістки, стимулювати ріст клітин, які формують кістки, або викликати диференціацію попередників клітин, які формують кістки. Антагоністи активіну-ActRIIa згідно з винаходом також можуть бути корисними для лікування остеопорозу. Способи та композиції згідно з винаходом можуть застосовуватися при станах, які характеризуються викликанням втрата кісткової маси, таких, як остеопороз (включаючи вторинний остеопороз), гіперпаратиреоїдизм, синдром Кушинга, хвороба Педжета, тиреотоксикоз, хронічна діарея або мальабсорбція, нирково-канальцевий ацидоз або нервова анорексія. Остеопороз може бути викликаний або пов'язаний з різними чинниками. У жінок, зокрема, жінок у постменопаузальний період, у суб'єктів зі зниженою масою тіла та суб'єктів з малорухомим способом життя існують чинники ризику остеопорозу (втрати густини кісткових мінералів, що призводить до ризику переломів). Лікування з застосуванням антагоніста ActRIIa може бути показане особам, які відповідають таким характеристикам: жінкам у постменопаузальний період, які не приймають естроген або не піддаються іншій гормонозамісній терапії; особам з особистою або спадковою історією перелому стегна або паління; жінкам у постменопаузальний період, які мають високий зріст (понад 5 футів 7 дюймів) або є худими (менше, ніж 125 фунтів); чоловікам з клінічними станами, пов'язаними з втратою кісткової маси; особам, які вживають медикаменти, які викликають втрату кісткової маси, включаючи кортикостероїди, такі, як Prednisone™, різні протиепілептичні медикаменти, такі, як Dilantin™, та деякі барбітурати, або високі дози медикаментів для відновлення щитовидної 22 UA 115859 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 залози; особам, які мають діабет 1 типу, хворобу печінки, хворобу нирок або спадкову історію остеопорозу; особам, які мають високий ступінь ремоделювання кісток (наприклад, надлишок колагену у зразках сечі); особам зі станами щитовидної залози, такими, як гіпертиреоїдизм; особам, які зазнавали перелому навіть після помірної травми; особам, у яких рентген виявив перелом хребця або інші ознаки остеопорозу. Як було зазначено вище, остеопороз також може виникати як стан, пов'язаний з іншим порушенням, або в результаті застосування певних медикаментів. Остеопороз, який виникає через ліки або інший медичний стан, називають вторинним остеопорозом. При стані, відомому як синдром Кушинга, надмірна кількість кортизолу, яка виробляється організмом, призводить до остеопорозу та переломів. Найбільш поширеними медикаментами, пов'язаними з вторинним остеопорозом, є кортикостероїди, клас медикаментів, які діють подібно до кортизолу, гормону, який природно виробляється наднирковими залозами. Хоча достатній рівень тиреоїдних гормонів (які виробляються щитовидною залозою) є необхідним для розвитку скелета, надлишок тиреоїдного гормону з часом може знижувати кісткову масу. Антациди, які містять алюміній, можуть призводити до втрати кісткової маси, якщо приймаються у високих дозах людьми з проблемами нирок, зокрема, тих, які піддаються діалізові. До інших медикаментів, які можуть викликати вторинний остеопороз, належать дифенін (Dilantin) та барбітурати, які застосовують для запобігання епілепсії; метотрексат (Rheumatrex, Immunex, Folex PFS), медикамент, який застосовують при деяких формах артриту, раку або імунних порушень; циклоспорин (Sandimmune, Neoral), медикамент, який застосовують для лікування деяких аутоімунних хвороб та для пригнічення імунної системи у пацієнтів з трансплантатами органів; агоністи гормону, що вивільнює лютеїнізуючий гормон (Lupron, Zoladex), які застосовують для лікування від раку передміхурової залози та ендометріозу; гепарин (Calciparine, Liquaemin) та медикамент, який перешкоджає коагуляції; і холестирамін (Questran) та колестипол (Colestid), які застосовують для лікування від підвищеного рівня холестерину. Загальновідомою є втрата кісткової маси в результаті протиракової терапії, яка називається викликаною протираковою терапією втратою кісткової маси (CTIBL). Кісткові метастази можуть утворювати порожнини у кістках, які можуть бути виправлені шляхом лікування антагоністами активіну-ActRIIa. В оптимальному варіанті втілення описані авторами антагоністи активіну-ActRIIa, зокрема, розчинного ActRIIa, можуть застосовуватися для онкологічних пацієнтів. Пацієнти, які мають певні пухлини (наприклад, передміхурової залози, молочної залози, множинну мієлому або будь-яку пухлину, яка викликає гіперпаратиреоїдизм), піддаються високому ризикові втрати кісткової маси через викликані пухлиною втрату кісткової маси, а також кісткові метастази та терапевтичні агенти. Такі пацієнти можуть отримувати лікування антагоністами активіну-ActRIIa навіть за відсутності ознак втрати кісткової маси або кісткових метастазів. Пацієнти також можуть спостерігатися на наявність ознак втрати кісткової маси або кісткових метастазів і можуть отримувати лікування антагоністами активіну-ActRIIa у разі, якщо показники свідчать про підвищений ризик. Зазвичай для оцінки змін у густині кісток застосовують DEXA-скани, а індикатори перемоделювання кісток застосовують для оцінки ймовірності кісткових метастазів. Можуть спостерігатися маркери сироватки. Кістково-специфічна лужна фосфатаза (BSAP) є ферментом, присутнім в остеобластах. Рівень BSAP у крові підвищується у пацієнтів з метастазами та іншими станами, які призводять до підвищеного перемоделювання кісток. Пептиди остеокальцин та проколаген також є пов'язаними з формуванням кісток та метастазами у кістки. Підвищення В SAP було виявлено у пацієнтів з метастазами у кістки, викликаними раком, та, меншою мірою, у метастазах у кістки через рак молочної залози. Рівень кісткового морфогенетичного білка-7 (ВМР-7) є високимпри раку передміхурової залози, який має кісткові метастази, але не у метастазах у кістки через рак міхура, шкіри, печінки або легенів. Карбокси-кінцевий телопептид типу І (ІСТР) є зшитим пептидом, який міститься у колагені, який утворюється під час резорбції кістки. Оскільки кістка постійно руйнується ц переформується, ІСТР міститься в усьому організмі. Однак у місці кісткового метастазу рівень є значно вищим, ніж у ділянці нормальної кістки. Високий рівень ІСТР міститься у кістковому метастазі через рак передміхурової залози, легенів та молочної залози. Ще один колагеновий зшитий пептид, Nкінцевий телопептид типу І (NTx), виробляється разом з ІСТР під час ремоделювання кісток. Кількість NTx збільшується у кістковому метастазі, викликаному різними типами раку, включаючи рак легенів, передміхурової залози та молочної залози. Крім того, рівень NTx збільшується з прогресуванням кісткового метастазу. Таким чином, цей маркер може застосовуватися як для виявлення метастазу, так і для вимірювання ступеня хвороби. До інших маркерів резорбції належать піридинолін та дезоксипіридинолін. Будь-яке збільшення маркерів резорбції або маркерів кісткових метастазів свідчить про необхідність терапії з застосуванням антагоніста активіну-ActRIIa для пацієнта. 23 UA 115859 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Антагоністи активіну-ActRIIa можуть вводитися разом з іншими фармацевтичними засобами. Спільне введення здійснюють шляхом введення єдиної спільної композиції, шляхом одночасного введення або шляхом введення в різний час. Антагоністи активіну-ActRIIa можуть бути особливо корисними, якщо вводяться з іншими кістково-активними агентами. Для пацієнта сприятливим може бути отримання антагоніста активіну-ActRIIa разом з прийманням кальцієвих додатків, вітаміну D, відповідними фізичними вправами та/або, у деяких випадках, іншим медикаментозним лікуванням. Прикладами інших медикаментів є бісфосфонати (алендронат, ібандронат та ризедронат), кальцитонін, естрогени, паратиреоїдний гормон та ралоксифен. Бісфосфонати (алендронат, ібандронат та ризедронат), кальцитонін, естрогени та ралоксифен впливають на цикл перемоделювання кісток і класифікуються як антирезорбтивні медикаменти. Перемоделювання кісток складається з двох окремих стадій: резорбція кістки та формування кістки. Антирезорбтивні медикаменти уповільнюють або зупиняють стадію резорбції кістки циклу перемоделювання кістки, але не уповільнюють стадію формування кістки цього циклу. В результаті нове формування відбувається з більшою швидкістю, ніж резорбція кістки, і густина кістки з часом може збільшуватися. Терипаратид, форма паратиреоїдного гормону, збільшує швидкість формування кісток у циклі перемоделювання кісток. Алендронат призначають як для профілактики (5 мг на день або 35 мг раз на тиждень), так і для лікування (10 мг на день або 70 мг раз на тиждень) постменопаузального остеопорозу. Алендронат зменшує втрату кісткової маси, збільшує густину кістки і знижує ризик переломів хребта, зап'ястків та стегон. Алендронат також призначають для лікування викликаного глюкокортикоїдами остеопорозу у чоловіків та жінок в результаті довготривалого приймання цих медикаментів (тобто, преднізону та кортизон) і для лікування остеопорозу у чоловіків. Алендронат плюс вітамін D призначають для лікування остеопорозу у жінок у постменопаузальний період (70 мг раз на тиждень плюс вітамін D) та для лікування з метою поліпшення кісткової маси у чоловіків з остеопорозом. Ібандронат призначають для профілактики та лікування постменопаузального остеопорозу. При прийманні однієї пігулки раз на місяць (150 мг) ібандронат повинен прийматися щомісяця в один день. Ібандронат зменшує втрату кісткової маси, збільшує густину кістки і знижує ризик переломів хребта. Ризедронат призначають для профілактики та лікування постменопаузального остеопорозу. При прийманні раз на день (доза 5 мг) або тиждень (доза 35 мг або 35 мг з кальцієм) ризедронат уповільнює втрату кісткової маси, збільшує густину кістки і знижує ризик переломів хребта та інших кісток. Ризедронат також призначають для приймання чоловіками та жінками для профілактики та/або лікування викликаного глюкокортикоїдами остеопорозу, який виникає в результаті довготермінового приймання цих медикаментів тобто, преднізону або кортизону). Кальцитонін є природним гормоном, який бере участь у регулюванні кальцію та метаболізмі кісток. У жінок більше, ніж через 5 років після менопаузи кальцитонін уповільнює втрату кісткової маси, збільшує густину кісток хребта і може послаблювати біль, пов'язаний з переломами кісток. Кальцитонін знижує ризик переломів хребта. Кальцитонін застосовують у формі ін'єкцій (50-100 IU на день) або назального аерозолю (200 IU на день). Естрогенова терапія (ЕТ)/гормональна терапія (НТ) призначається для профілактики остеопорозу. Було виявлено, що ЕТ зменшує втрату кісткової маси, збільшує густину кісток хребта та стегон і знижує ризик переломів стегон та хребта у жінок у постменопаузальний період. ЕТ найчастіше застосовують у формі пігулки або шкірного пластиру, який доставляє низьку дозу приблизно 0,3 мг на день або стандартну дозу приблизно 0,625 мг на день і є ефективним навіть якщо його застосування розпочинається після 70-річного віку. Якщо естроген приймається окремо, він може збільшувати у жінок ризик розвитку раку слизової оболонки матки (ендометріального раку). Для виключення цього ризику медики призначають гормон прогестин у комбінації з естрогеном (гормонозамісна терапія або НТ) для жінок, які мають інтактну матку. ЕТ/НТ послаблює симптоми менопаузи і демонструє сприятливий вплив на здоровий стан кісток. Побічними ефектами можуть бути вагінальна кровотеча, хворобливість молочної залози, порушення настрою та хвороба жовчного міхура. Ралоксифен, 60 мг на день, призначають для профілактики та лікування постменопаузального остеопорозу. Він належить до класу медикаментів, які називають селективними модуляторами естрогенових рецепторів (SERM), які було розроблено для забезпечення сприятливого впливу естрогенів без їх можливих недоліків. Ралоксифен збільшує кісткову масу і знижує ризик переломів хребта. На разі немає даних, які демонструють, що ралоксифен може знижувати ризик переломів стегна або інших не пов'язаних з хребтом кісток. Терипаратид, форму паратиреоїдного гормону, призначають для лікування остеопорозу у жінок у постменопаузальний період та чоловіків, які мають високий ризик переломів. Цей медикамент стимулює відновлення формування кісток і суттєво збільшує густину кісткових мінералів. У жінок у постменопаузальний період відзначалося зменшення переломів хребта, стегна, ступні, ребер та зап'ястка. У чоловіків відзначалося зменшення 24 UA 115859 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 переломів хребта, але для оцінки зменшення переломів в інших місцях кількість даних є недостатньою. Терипаратид вводиться пацієнтом самостійно у формі щоденної ін'єкції протягом періоду до 24 місяців. 7. Фармацевтичні композиції. У деяких варіантах втілення антагоністи активіну-ActRIIa (наприклад, поліпептиди ActRIIa) згідно з даним винаходом рецептують з фармацевтично прийнятним носієм. Наприклад, поліпептид ActRIIa вводять окремо або як компонент фармацевтичної композиції (терапевтичної композиції). Дані сполуки можуть бути рецептовані для введення традиційним шляхом при застосуванні у медицині або ветеринарії. У деяких варіантах втілення терапевтичний спосіб згідно з винаходом включає введення композиції системно або локально, у формі імплантату або пристрою. При введенні терапевтична композиція для застосування згідно з цим винаходом, звичайно має перебувати у вільній від пірогену, фізіологічно прийнятній формі. Терапевтично корисні агенти, крім антагоністів ActRIIa, які також необов'язково можуть включатися до композиції, як описано вище, можуть вводитись одночасно або послідовно зі сполуками, які є предметом винаходу (наприклад, поліпептидами ActRIIa) у способах згідно з винаходом. Зазвичай антагоністи ActRIIa вводять парентерально. Фармацевтичні композиції, прийнятні для парентерального введення, можуть включати один або кілька поліпептидів ActRIIa у комбінації з одним або кількома фармацевтично прийнятними стерильними ізотонічними водними або неводними розчинами, дисперсіями, суспензіями або емульсіями, або стерильними порошками, які можуть бути відновлені до стерильних прийнятних для ін'єкцій розчинів або дисперсій безпосередньо перед застосуванням, які можуть містити антиоксиданти, буфери, бактеріостати, розчинені речовини, які забезпечують ізотонічність композиції з кров'ю реципієнта, для якого вони призначаються, або суспендуючі агенти або загусники. Прикладами прийнятних водних та неводних носіїв, які можуть застосовуватись у фармацевтичних композиціях згідно з винаходом, є вода, етанол, поліоли (такі, як гліцерин, пропіленгліколь, поліетиленгліколь і т. ін.) та їх відповідні суміші, рослинні олії, такі, як оливкова олія, та придатні для ін'єкцій органічні естери, такі, як етилолеат. Належну текучість підтримують, наприклад, шляхом застосування матеріалів покриття, таких, як лецитин, шляхом підтримання потрібного розміру частинок у разі дисперсій та шляхом застосування поверхнево-активних речовин. Крім того, композиція може бути інкапсульована або введена шляхом ін'єкції у формі для доставлення до заданого місця тканини (наприклад, кістки). У деяких варіантах втілення композиції згідно з даним винаходом можуть включати матрикс, здатний доставляти одну або кілька терапевтичних сполук (наприклад, поліпептиди ActRIIa) до заданого місця тканини (наприклад, кістки), що забезпечує структуру для розвитку тканини і необов'язково може бути резорбований в організм. Наприклад, може забезпечувати повільне вивільнення поліпептидів ActRIIa. Такі матрикси можуть утворюватися з матеріалів, які на даний час застосовують у медицині для інших імплантацій. Вибір матеріалу матриксу ґрунтується на біосумісності, здатності до біологічного розкладання, механічних властивостях, косметичному вигляді та властивостях взаємодії. Конкретне застосування певних композицій визначає належну композицію. Потенційні матрикси для композицій можуть піддаватися біологічному розкладенню і хімічно визначатися як сульфат кальцію, трикальційфосфат, гідроксіапатит, полімолочна кислота та поліангідриди. Іншими потенційними матеріалами є ті, що піддаються біологічному розкладенню і є добре визначеними біологічно, такі як колаген кісток або шкіри. Інші матрикси складаються з чистих білків або компонентів позаклітинного матриксу. Інші потенційні матрикси не піддаються біологічному розкладенню і не визначаються хімічно, такі, як спечений гідроксіапатит, біоскло, алюмінати або інші керамічні матеріали. Матрикси можуть складатися з комбінації будь-яких з вищезгаданих типів матеріалу, таких, як полімолочна кислота та гідроксіапатит або колаген та трикальційфосфат. Біокерамічні матеріали можуть бути змінені за складом, наприклад, кальційалюмінат-фосфат, та піддані обробці для зміни розміру пор, розміру частинок, форми частинок та здатності до біологічного розкладання. У деяких варіантах втілення способи згідно з винаходом можуть застосовуватися для введення перорально, наприклад, у формі різних капсул, пігулок, таблеток, пастилок (з застосуванням ароматизованої основи, зазвичай цукрози та гуміарабіку або трагаканту), порошків, гранул, або як розчин або суспензія у водній або неводній рідині, або як рідка емульсія "олія-у-воді" або "вода-в-олії", або як еліксир або сироп, або як пастилки (з застосуванням інертної основи, такої, як желатин та гліцерин, або цукроза та гуміарабік) та/або як розчини для промивання рота і т. ін., кожен з яких містить задану кількість агента як активного інгредієнта. Агент також може вводитись як велика пілюля, електуарій або паста. 25 UA 115859 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У твердих дозованих формах для перорального введення (капсули, таблетки, пігулки, драже, порошки, гранули і т. ін.) одну або кілька терапевтичних сполук згідно з даним винаходом змішують з одним або кількома фармацевтично прийнятними носіями, такими, як цитрат натрію або дикальційфосфат, та/або будь-якими з компонентів, до яких належать: (1) наповнювачі або розріджувачі, такі, як крохмалі, лактоза, цукроза, глюкоза, маніт, та/або кремнієва кислота; (2) зв'язувальні речовини, такі, як, наприклад, карбоксиметилцелюлоза, альгінати, желатин, полівінілпіролідон, цукроза та/або гуміарабік; (3) зволожувачі, такі, як гліцерин; (4) дезінтегратори, такі, як агар-агар, карбонат кальцію, кукурудзяний або тапіоковий крохмаль, альгінова кислота, деякі силікати та карбонат натрію; (5) уповільнювачі розчину, такі, як парафін; (6) прискорювачі абсорбції, такі, як четвертинні амонієві сполуки; (7) зволожувачі, такі, як, наприклад, цетиловий спирт та гліцеринмоностеарат; (8) абсорбенти, такі, як каолін та бентонітова глина; (9) мастила, такі, як тальк, стеарат кальцію, стеарат магнію, тверді поліетиленгліколі, лаурилсульфат натрію та їх суміші; та (10) барвники. У разі капсул таблеток та пігулок фармацевтичні композиції також можуть включати буферні агенти. Тверді композиції подібного типу також можуть застосовуватись як наповнювачі у м'яких та твердих заповнених желатинових капсулах з використанням таких наповнювачів, як лактоза або молочні цукри, а також високомолекулярні поліетиленгліколі і т. ін. До рідких дозованих форм для перорального введення належать фармацевтично прийнятні емульсії, мікроемульсії, розчини, суспензії, сиропи та еліксири. Крім активного інгредієнта, рідкі дозовані форми можуть містити інертні розріджувачі, які широко застосовують у галузі, такі, як вода або інші розчинники, солюбілізатори та емульгатори, такі, як етиловий спирт, ізопропіловий спирт, етилкарбонат, етилацетат, бензиловий спирт, бензилбензоат, пропіленгліколь, 1,3-бутиленгліколь, олії (зокрема, бавовняну олію, арахісову олію, кукурудзяну олію, олію зародків пшениці, оливкову олію, рицинову та кунжутну олії), гліцерин, тетрагідрофуриловий спирт, поліетиленгліколі та естери жирних кислот сорбіту та їх суміші. Крім інертних розріджувачів, композиції для перорального введення також можуть включати ад'юванти, такі, як зволожувачі, емульгатори та суспендуючі агенти, підсолоджувачі, ароматизатори, барвники, віддушки та консерванти. Суспензії, крім активних сполук, можуть містити суспендуючі агенти, такі, як етоксиловані ізостеарилові спирти, поліоксіетилен сорбіт та естери сорбіту, мікрокристалічна целюлоза, метагідроксид алюмінію, бентоніт, агар-агар та трагакант, та їх суміші. Композиції згідно з винаходом також можуть містити ад'юванти, такі як консерванти, зволожувачі, емульгатори та диспергатори. Запобігання дії мікроорганізмів може забезпечуватися шляхом включення різних протибактеріальних та протигрибкових агентів, наприклад, парабену, хлорбутанолу, фенолсорбінової кислоти і т. ін. Також може бути бажаним включення до композицій ізотонічних агентів, таких, як цукри, хлорид натрію і т. ін. Крім того, подовження абсорбції фармацевтичної форми для ін'єкцій може бути викликане шляхом включення агентів, які затримують абсорбцію, таких, як моностеарат алюмінію та желатин. Слід розуміти, що режим дозування має визначатися лікарем, який враховує різні чинники, які змінюють дію даних сполук згідно з винаходом (наприклад, поліпептидів ActRIIa). До різних чинників, крім інших, належать кісткова маса, яка має бути сформована, ступінь втрати густини кістки, місце пошкодження кістки, стан пошкодженої кістки, вік, стать та режим харчування пацієнта, тяжкість будь-якої хвороби, яка може сприяти втраті кісткової маси, час введення та інші клінічні чинники. Необов'язково, доза може змінюватися залежно від типу матриксу, який застосовують для відновлення вологовмісту, та типів сполук у композиції. Додавання інших відомих факторів росту до готової композиції також може впливати на дозування. За процесом спостерігають шляхом періодичної оцінки росту та/або відновлення кісток, наприклад, за допомогою рентгенографії (включаючи DEXA), гістоморфометричного визначення та тетрациклінового мічення. Експерименти з мишами продемонстрували, що вплив ActRIIa-Fc на кістки піддається виявленню, якщо дозу сполуки вводять з інтервалами і в кількості, які є достатніми для досягнення концентрації в сироватці 0,2 мкг/кг або більше, і рівень у сироватці 1 мкг/кг або 2 мкг/кг або більше є бажаним для досягнення суттєвого впливу на густину та міцність кістки. Хоча й не існує свідчень того, що вищі дози ActRIIa-Fc є небажаними через побічні ефекти, режими дозування можуть визначатися таким чином, щоб досягалася концентрація в сироватці від 0,2 до 15 мкг/кг, необов'язково від 1 до 5 мкг/кг. У людини рівень у сироватці 0,2 мкг/кг може досягатися при єдиній дозі 0,1 мг/кг або більше, і рівень у сироватці 1 мкг/кг може досягатися при єдиній дозі 0,3 мг/кг або більше. Період напіврозпаду молекули в сироватці, який спостерігається, становить приблизно від 20 до 30 днів, значно довший, ніж для більшості злитих Fc білків, і, таким чином, може досягатися довготривалий ефективний рівень у сироватці, 26 UA 115859 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 наприклад, шляхом введення дози 0,2-0,4 мг/кг щотижня або раз на два тижні, або можуть застосовуватися вищі дози з довшими інтервалами введення. Наприклад, дози 1-3 мг/кг можуть застосовуватися раз на місяць або раз на два місяці, І вплив на кістку може бути достатньо тривалим, коли дозування є необхідним лише кожні 3, 4, 5, 6, 9, 12 або більше місяців. У деяких варіантах втілення даний винахід також передбачає генну терапію для in vivo вироблення поліпептидів ActRIIa. Така терапія дозволяє досягати терапевтичного ефекту через введення полінуклеотидних послідовностей ActRIIa у клітини або тканини, які мають вищеперелічені порушення. Доставлення полінуклеотидних послідовностей ActRIIa досягають, застосовуючи рекомбінантний вектор експресії, такий, як химерний вірус або систему колоїдної дисперсії. Оптимальним для терапевтичного доставлення полінуклеотидних послідовностей ActRIIa є застосування спрямованих ліпосом. До різних вірусних векторів, які можуть застосовуватися для генної терапії згідно з даним винаходом, належать аденовірус, вірус герпесу, вакцина або, в оптимальному варіанті, РНКвірус, такий, як ретровірус. В оптимальному варіанті ретровірусний вектор походить від мишачого або пташиного ретровірусу. Прикладами ретровірусних векторів, у яких може бути вставлений єдиний сторонній ген, крім інших, є: вірус лейкемії мишей Moloney (MoMuLV), вірус саркоми мишей Harvey (HaMuSV), вірус пухлини молочної залози мишей (MuMTV) та вірус саркоми Рауса (RSV). Багато додаткових ретровірусних векторів можуть включати кілька генів. Усі ці вектори можуть переносити або включати ген для відібраного маркера таким чином, щоб перетворені клітини могли бути розпізнані й вироблені. Ретровірусні вектори можуть набувати специфічності до мішені через приєднання, наприклад, цукру, гліколіпіду або білка. Оптимальне спрямування здійснюють з використанням антитіла. Спеціалістам у даній галузі стане зрозуміло, що специфічні полінуклеотидні послідовності можуть бути вставлені у ретровірусний геном або приєднані до вірусної оболонки, що дозволяє спрямовувати специфічне доставлення ретровірусного вектора, який містить полінуклеотид ActRIIa. В оптимальному варіанті втілення вектор спрямовують на кістку або хрящ. В альтернативному варіанті клітини тканинної культури можуть бути безпосередньо трансфіковані плазмідами, які кодують ретровірусні структурні гени gag, pol та env, шляхом традиційної трансфекції з фосфатом кальцію. Ці клітини потім трансфікують векторною плазмідою, яка містить потрібні гени. Утворені в результаті клітини вивільнюють ретровірусний вектор у культуральне середовище. Іншою системою спрямованого доставлення полінуклеотидів ActRIIa є система колоїдної дисперсії. До систем колоїдної дисперсії належать макромолекулярні комплекси, нанокапсули, мікросфери, кульки та системи на основі ліпідів, включаючи емульсії "олія-у-воді", міцели, змішані міцели та ліпосоми. Оптимальною колоїдною системою згідно з цим винаходом є ліпосома. Ліпосоми є везикулами штучної мембрани, які застосовують як засоби доставлення in vitro та in vivo. РНК, ДНК та інтактні віріони можуть бути інкапсульовані у водний компонент і доставлені у клітини у біологічно активній формі (див., наприклад, Fraley, et al., Trends Biochem. Sci., 6:77, 1981). Способи ефективного перенесення генів з застосуванням ліпосомного носія є відомими спеціалістам у даній галузі, див., наприклад, Mannino, et al., Biotechniques, 6:682, 1988. Композиція ліпосоми зазвичай є комбінацією фосфоліпідів, як правило, у комбінації зі стероїдами, зокрема, холестерином. Також застосовують інші фосфоліпіди або інші ліпіди. Фізичні характеристики ліпосом залежать від рН, іонної сили та присутності двовалентних катіонів. Прикладами ліпідів, які застосовують для вироблення ліпосом, є сполуки фосфатидилу, такі, як фосфатидилгліцерин, фосфатидилхолін, фосфатидилсерин, фосфатидилетаноламін, сфінголіпіди, цереброзиди та гангліозиди. Типовими фосфоліпідами є фосфатидилхолін, виділений з курячих яєць, дипальмітоїлфосфатидилхолін та дистеароїлфосфатидилхолін. Спрямування ліпосом також може бути можливим на основі, наприклад, органної специфічності, клітинної специфічності та специфічності органел, які є відомими спеціалістам у даній галузі. Приклади Далі винахід описується в загальних рисах, і він стане легше зрозумілим за допомогою посилання на представлені нижче приклади, які включаються лише з метою пояснення деяких варіантів втілення даного винаходу, якими не обмежується обсяг винаходу. Приклад 1: Злиті білки ActRIIa-Fc. Авторами було побудовано розчинний злитий білок ActRIIa, який має позаклітинний домен людського ActRIIa, злитий з людським або мишачим Fc доменом з мінімальним лінкером між ними. Послідовності називаються ActRIIa-hFc та ActRIIa-mFc, відповідно. ActRIIa-hFc показано нижче як очищений з клітинні лінії СНО (SEQ ID NO: 7): 27 UA 115859 C2 5 10 Білки ActRIIa-hFc та ActRIIa-mFc експресувалися у клітинних лініях СНО. Розглядали три різні лідерні послідовності: (і) Бджолиний мелітин (HBML): MKFLVNVALVFMVVYISYIYA (SEQ ID NO: 8) (іі) Тканинний активатор плазміногену (ТРА): MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP (SEQ ID NO: 9) (ііі) Природна: MGAAAKLAFAVFLISCSSGA (SEQ ID NO: 10). У вибраній формі застосовується лідерна послідовність ТРА, і вона має таку необроблену амінокислотну послідовність: Цей поліпептид кодується такою нуклеїновокислотною послідовністю: 28