Гібридний озимий олієнасіннєвий рапс і способи його одержання

Номер патенту: 88861

Опубліковано: 10.12.2009

Автори: де Бот Грета, де Бьокелер Марк

Формула / Реферат

1. Спосіб ідентифікації трансгенної рослини або її клітин чи тканин, що містять елітну подію MS-BN1, який відрізняється тим, що він включає встановлення, що геномна ДНК трансгенної рослини або її клітин чи тканин може використовуватись для підсилення фрагмента ДНК завдовжки від 260 до 300 bp, за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції з двома праймерами, що мають нуклеотидні послідовності SEQ ID No. 12 і SEQ ID No. 19 відповідно.

2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що він включає встановлення того, чи може геномна ДНК трансгенної рослини або її клітини чи тканини використовуватися для ампліфікації фрагмента ДНК завдовжки приблизно 280 bp за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції з двома праймерами, що мають нуклеотидні послідовності SEQ ID No. 12 і SEQ ID No. 19 відповідно.

3. Комплект для ідентифікації елітної події MS-BN1 у біологічних зразках, який відрізняється тим, що він містить принаймні один праймер або зонд, який розпізнає 5¢ фланкувальну послідовність події MS-BN1 в межах послідовності SEQ ID No. 13 або 3¢ фланкувальну послідовність події MS-BN1 в межах послідовності SEQ ID No. 18.

4. Комплект за п. 3, який відрізняється тим, що праймер або зонд, який розпізнає 5¢ фланкувальну послідовність події MS-BN1, містить послідовність SEQ ID No. 19.

5. Комплект за п. 3 або 4, який відрізняється тим, що додатково містить другий праймер або зонд, який розпізнає послідовність події MS-BN1 сторонньої ДНК в межах послідовності SEQ ID No. 1.

6. Комплект за п. 5, який відрізняється тим, що другий праймер або зонд розпізнає послідовність події MS-BN1 сторонньої ДНК в межах послідовності SEQ ID No. 13 або в межах послідовності SEQ ID No. 18.

7. Комплект за п. 5, який відрізняється тим, що другий праймер містить послідовність SEQ ID No. 12.

8. Комплект для ідентифікації трансгенної рослини, її клітин або тканин, що містять елітну подію MS-BN1, який відрізняється тим, що він містить принаймні два PCR-зонди, один із яких розпізнає послідовність події MS-BN1 сторонньої ДНК в межах послідовності SEQ ID No. 1, а інший розпізнає 5¢ фланкувальну послідовність події MS-BN1 в межах послідовності SEQ ID No. 13 або 3¢ фланкувальну послідовність події MS-BN1 в межах послідовності SEQ ID No. 18 для застосування у протоколі PCR-ідентифікації.

9. Комплект за п. 8, який відрізняється тим, що зонд, який розпізнає послідовність події MS-BN1 сторонньої ДНК, розпізнає послідовність події MS-BN1 сторонньої ДНК в межах послідовності SEQ ID No. 13 або в межах послідовності SEQ ID No. 18.

10. Комплект за п. 8, який відрізняється тим, що PCR-зонди містять нуклеотидні послідовності SEQ ID No. 12 і SEQ ID No. 19 відповідно.

11. Спосіб ідентифікації трансгенної рослини або її клітин чи тканин, що містять елітну подію RF-BN1, який відрізняється тим, що він включає встановлення, що геномна ДНК трансгенної рослини або її клітин чи тканин може використовуватись для підсилення фрагмента ДНК завдовжки від 195 до 235 bp, за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції з двома праймерами, що мають нуклеотидні послідовності SEQ ID No. 23 і SEQ ID No. 41 відповідно.

12. Спосіб за п. 11, який відрізняється тим, що він включає встановлення, що геномна ДНК трансгенної рослини або її клітин чи тканин може використовуватися для ампліфікації фрагмента ДНК завдовжки приблизно 215 bp за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції з двома праймерами, що мають нуклеотидні послідовності SEQ ID No. 23 і SEQ ID No. 41 відповідно.

13. Комплект для ідентифікації елітної події RF-BN1 у біологічних зразках, який відрізняється тим, що він містить принаймні один праймер або зонд, який розпізнає 5¢ фланкувальну послідовність події RF-BN1 в межах SEQ ID No. 24 або 3¢ фланкувальну послідовність події RF-BN1 в межах SEQ ID No. 30.

14. Комплект за п. 13, який відрізняється тим, що праймер або зонд, який розпізнає 5¢ фланкувальну послідовність події RF-BN1, містить послідовність SEQ ID No. 41.

15. Комплект за п. 13 або 14, який відрізняється тим, що додатково містить принаймні другий PCR-праймер або зонд, який розпізнає послідовність події RF-BN1 сторонньої ДНК в межах SEQ ID No. 2.

16. Комплект за п. 15, який відрізняється тим, що другий праймер або зонд розпізнає послідовність події RF-BN1сторонньої ДНК в межах SEQ ID No. 24 або в межах SEQ ID No. 30 .

17. Комплект за п. 15, який відрізняється тим, що другий праймер або зонд містить послідовність SEQ ID No. 23.

18. Комплект для ідентифікації трансгенної рослини, її клітин або тканин, що містять елітну подію RF-BN1, який відрізняється тим, що він містить принаймні два PCR-зонди, один із яких розпізнає послідовність події RF-BN1 сторонньої ДНК в межах послідовності SEQ ID No. 2, а інший розпізнає 5¢ фланкувальну послідовність події RF-BN1 в межах SEQ ID No. 24 або 3¢ фланкувальну послідовність події RF-BN1 в межах SEQ ID No. 30 для застосування у протоколі PCR-ідентифікації.

19. Комплект за п. 18, який відрізняється тим, що зонд, який розпізнає послідовність події RF-BN1 сторонньої ДНК, розпізнає послідовність події RF-BN1 сторонньої ДНК в межах SEQ ID No. 24 або в межах SEQ ID No. 30.

20. Комплект за п. 18, який відрізняється тим, що PCR-зонди містять нуклеотидні послідовності SEQ ID No. 23 і SEQ ID No. 41 відповідно.

21. Трансгенна рослина озимого олієнасіннєвого рапсу або її насіння, клітина чи тканина, що містить елітну подію RF-BN1, яка характеризуються тим, що геномна ДНК може використовуватись для підсилення фрагмента ДНК завдовжки від 195 до 235 bp, за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції з двома праймерами, що мають нуклеотидні послідовності SEQ ID No. 23 і SEQ ID No. 41 відповідно, де зазначена рослина є доступною з насіння, як його депонували в АТСС під номером доступу РТА-730.

22. Рослина, насіння, клітина чи тканина рослини за п. 21, яка характеризується тим, що геномна ДНК рослини, насіння, клітини чи тканини рослини може використовуватись для підсилення фрагмента ДНК завдовжки приблизно 215 bp, за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції з двома праймерами, що мають нуклеотидні послідовності SEQ ID No. 23 і SEQ ID No. 41 відповідно.

23. Рослина, насіння, клітина чи тканина рослини за п. 21, що додатково містить елітну подію MS-BN1, яка характеризується тим, що геномна ДНК рослини, насіння, клітини чи тканини рослини може використовуватись для підсилення фрагмента ДНК завдовжки від 260 до 300 bp, за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції з двома праймерами, що мають нуклеотидні послідовності SEQ ID No. 12 і SEQ ID No. 19 відповідно.

24. Рослина, насіння, клітина чи тканина рослини за п. 23, яка характеризується тим, що геномна ДНК рослини, насіння, клітини чи тканини рослини може використовуватись для підсилення фрагмента ДНК завдовжки 280 bp, за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції з двома праймерами, що мають нуклеотидні послідовності SEQ ID No. 12 і SEQ ID No. 19 відповідно.

25. Рослина, насіння, клітина чи тканина рослини за будь-яким з пп. 21-24, яка може бути одержана шляхом схрещування рослини з рослиною озимого олієнасіннєвого рапсу, отриманою з насіння, депонованого в АТСС під номером доступу РТА-730.

26. Рослина, насіння, клітина чи тканина рослини за будь-яким з пп. 21-25, яка є гібридною рослиною, гібридним насінням, гібридною клітиною рослини або гібридною тканиною рослини.

27. Трансгенна рослина озимого олієнасіннєвого рапсу або її насіння, клітина чи тканина, що містить елітну подію MS-BN1, яка характеризуються тим, що геномна ДНК вказаної рослини, насіння, клітини чи тканини рослини може використовуватись для підсилення фрагмента ДНК завдовжки від 260 до 300 bp, за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції з двома праймерами, що мають нуклеотидні послідовності SEQ ID No. 12 і SEQ ID No. 19 відповідно, де зазначена рослина є доступною з насіння, як його депонували в АТСС під номером доступу РТА-730.

28. Рослина, насіння, клітина чи тканина рослини за п. 27, яка характеризується тим, що геномна ДНК вказаної рослини, насіння, клітини чи тканини рослини може використовуватись для підсилення фрагмента ДНК завдовжки 280 bp, за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції з двома праймерами, що мають нуклеотидні послідовності SEQ ID No. 12 і SEQ ID No. 19 відповідно.

29. Спосіб продукування трансгенного гібридного насіння, що містить елітну подію MS-BN1 та трансгенний ген відновлення фертильності, де спосіб містить етапи:

а) ідентифікації трансгенної рослини озимого олієнасіннєвого рапсу з чоловічою стерильністю, що містить елітну подію MS-BN1, яка характеризуються тим, що геномна ДНК вказаної рослини може використовуватись для підсилення фрагмента ДНК завдовжки від 260 до 300 bp, за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції з двома праймерами, що мають нуклеотидні послідовності SEQ ID No. 12 і SEQ ID No. 19 відповідно, де зазначена рослина, насіння, клітина чи тканина рослини є доступною з насіння, як його депонували в АТСС під номером доступу РТА-730,

b) схрещування трансгенної рослини озимого олієнасіннєвого рапсу з чоловічою стерильністю за пунктом а) з трансгенною відновлюючою фертильність рослиною озимого олієнасіннєвого рапсу, що містить стабільно інтегрований в її геном ген відновлення фертильності, що містить ДНК, що кодує інгібітор рибонуклеази під керуванням промотору, який спрямовує експресію зазначеного ДНК принаймні в ті клітини, в котрих експресується ген чоловічої стерильності елітної події MS-BN1, та

с) збирання врожаю гібридного насіння від зазначеної рослини озимого олієнасіннєвого рапсу з чоловічою стерильністю.

30. Спосіб за п. 29, який відрізняється тим, що відновлююча фертильність рослина містить елітну подію RF-BN1 та характеризуються тим, що геномна ДНК вказаної рослини може використовуватись для підсилення фрагмента ДНК завдовжки приблизно 215 bp, за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції з двома праймерами, що мають нуклеотидні послідовності SEQ ID No. 23 і SEQ ID No. 41 відповідно, де зазначена відновлююча фертильність рослина є доступною з насіння, як його депонували в АТСС під номером доступу РТА-730.

Текст

1. Спосіб ідентифікації трансгенної рослини або її клітин чи тканин, що містять елітну подію MS-BN1, який відрізняється тим, що він включає встановлення, що геномна ДНК трансгенної рослини або її клітин чи тканин може використовуватись для підсилення фрагмента ДНК завдовжки від 260 до 300 bp, за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції з двома праймерами, що мають нуклеотидні послідовності SEQ ID No. 12 і SEQ ID No. 19 відповідно. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що він включає встановлення того, чи може геномна ДНК трансгенної рослини або її клітини чи тканини використовуватися для ампліфікації фрагмента ДНК завдовжки приблизно 280 bp за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції з двома праймерами, що мають нуклеотидні послідовності SEQ ID No. 12 і SEQ ID No. 19 відповідно. 3. Комплект для ідентифікації елітної події MS-BN1 у біологічних зразках, який відрізняється тим, що він містить принаймні один праймер або зонд, який розпізнає 5¢ фланкувальну послідовність події MSBN1 в межах послідовності SEQ ID No. 13 або 3¢ фланкувальну послідовність події MS-BN1 в межах послідовності SEQ ID No. 18. 4. Комплект за п. 3, який відрізняється тим, що праймер або зонд, який розпізнає 5¢ фланкувальну послідовність події MS-BN1, містить послідовність SEQ ID No. 19. 2 (19) 1 3 88861 4 рослини, насіння, клітини чи тканини рослини мополімеразно-ланцюгової реакції з двома праймеже використовуватись для підсилення фрагмента рами, що мають нуклеотидні послідовності SEQ ID ДНК завдовжки від 260 до 300 bp, за допомогою No. 23 і SEQ ID No. 41 відповідно. полімеразно-ланцюгової реакції з двома прайме13. Комплект для ідентифікації елітної події RFрами, що мають нуклеотидні послідовності SEQ ID BN1 у біологічних зразках, який відрізняється No. 12 і SEQ ID No. 19 відповідно. тим, що він містить принаймні один праймер або 24. Рослина, насіння, клітина чи тканина рослини зонд, який розпізнає 5¢ фланкувальну послідовза п. 23, яка характеризується тим, що геномна ність події RF-BN1 в межах SEQ ID No. 24 або 3¢ ДНК рослини, насіння, клітини чи тканини рослини фланкувальну послідовність події RF-BN1 в межах може використовуватись для підсилення фрагменSEQ ID No. 30. та ДНК завдовжки 280 bp, за допомогою полімера14. Комплект за п. 13, який відрізняється тим, що зно-ланцюгової реакції з двома праймерами, що праймер або зонд, який розпізнає 5¢ фланкувальну мають нуклеотидні послідовності SEQ ID No. 12 і послідовність події RF-BN1, містить послідовність SEQ ID No. 19 відповідно. SEQ ID No. 41. 25. Рослина, насіння, клітина чи тканина рослини 15. Комплект за п. 13 або 14, який відрізняється за будь-яким з пп. 21-24, яка може бути одержана тим, що додатково містить принаймні другий PCRшляхом схрещування рослини з рослиною озимого праймер або зонд, який розпізнає послідовність олієнасіннєвого рапсу, отриманою з насіння, депоподії RF-BN1 сторонньої ДНК в межах SEQ ID No. нованого в АТСС під номером доступу РТА-730. 2. 26. Рослина, насіння, клітина чи тканина рослини 16. Комплект за п. 15, який відрізняється тим, що за будь-яким з пп. 21-25, яка є гібридною рослидругий праймер або зонд розпізнає послідовність ною, гібридним насінням, гібридною клітиною росподії RF-BN1сторонньої ДНК в межах SEQ ID No. лини або гібридною тканиною рослини. 24 або в межах SEQ ID No. 30 . 27. Трансгенна рослина озимого олієнасіннєвого 17. Комплект за п. 15, який відрізняється тим, що рапсу або її насіння, клітина чи тканина, що місдругий праймер або зонд містить послідовність тить елітну подію MS-BN1, яка характеризуються SEQ ID No. 23. тим, що геномна ДНК вказаної рослини, насіння, 18. Комплект для ідентифікації трансгенної росликлітини чи тканини рослини може використовувани, її клітин або тканин, що містять елітну подію тись для підсилення фрагмента ДНК завдовжки від RF-BN1, який відрізняється тим, що він містить 260 до 300 bp, за допомогою полімеразнопринаймні два PCR-зонди, один із яких розпізнає ланцюгової реакції з двома праймерами, що мапослідовність події RF-BN1 сторонньої ДНК в меють нуклеотидні послідовності SEQ ID No. 12 і жах послідовності SEQ ID No. 2, а інший розпізнає SEQ ID No. 19 відповідно, де зазначена рослина є 5¢ фланкувальну послідовність події RF-BN1 в медоступною з насіння, як його депонували в АТСС жах SEQ ID No. 24 або 3¢ фланкувальну послідовпід номером доступу РТА-730. ність події RF-BN1 в межах SEQ ID No. 30 для за28. Рослина, насіння, клітина чи тканина рослини стосування у протоколі PCR-ідентифікації. за п. 27, яка характеризується тим, що геномна 19. Комплект за п. 18, який відрізняється тим, що ДНК вказаної рослини, насіння, клітини чи тканини зонд, який розпізнає послідовність події RF-BN1 рослини може використовуватись для підсилення сторонньої ДНК, розпізнає послідовність події RFфрагмента ДНК завдовжки 280 bp, за допомогою BN1 сторонньої ДНК в межах SEQ ID No. 24 або в полімеразно-ланцюгової реакції з двома праймемежах SEQ ID No. 30. рами, що мають нуклеотидні послідовності SEQ ID 20. Комплект за п. 18, який відрізняється тим, що No. 12 і SEQ ID No. 19 відповідно. PCR-зонди містять нуклеотидні послідовності SEQ 29. Спосіб продукування трансгенного гібридного ID No. 23 і SEQ ID No. 41 відповідно. насіння, що містить елітну подію MS-BN1 та транс21. Трансгенна рослина озимого олієнасіннєвого генний ген відновлення фертильності, де спосіб рапсу або її насіння, клітина чи тканина, що місмістить етапи: тить елітну подію RF-BN1, яка характеризуються а) ідентифікації трансгенної рослини озимого олієтим, що геномна ДНК може використовуватись для насіннєвого рапсу з чоловічою стерильністю, що підсилення фрагмента ДНК завдовжки від 195 до містить елітну подію MS-BN1, яка характеризують235 bp, за допомогою полімеразно-ланцюгової ся тим, що геномна ДНК вказаної рослини може реакції з двома праймерами, що мають нуклеотивикористовуватись для підсилення фрагмента дні послідовності SEQ ID No. 23 і SEQ ID No. 41 ДНК завдовжки від 260 до 300 bp, за допомогою відповідно, де зазначена рослина є доступною з полімеразно-ланцюгової реакції з двома прайменасіння, як його депонували в АТСС під номером рами, що мають нуклеотидні послідовності SEQ ID доступу РТА-730. No. 12 і SEQ ID No. 19 відповідно, де зазначена 22. Рослина, насіння, клітина чи тканина рослини рослина, насіння, клітина чи тканина рослини є за п. 21, яка характеризується тим, що геномна доступною з насіння, як його депонували в АТСС ДНК рослини, насіння, клітини чи тканини рослини під номером доступу РТА-730, може використовуватись для підсилення фрагменb) схрещування трансгенної рослини озимого та ДНК завдовжки приблизно 215 bp, за допомоолієнасіннєвого рапсу з чоловічою стерильністю за гою полімеразно-ланцюгової реакції з двома пунктом а) з трансгенною відновлюючою фертильпраймерами, що мають нуклеотидні послідовності ність рослиною озимого олієнасіннєвого рапсу, що SEQ ID No. 23 і SEQ ID No. 41 відповідно. містить стабільно інтегрований в її геном ген від23. Рослина, насіння, клітина чи тканина рослини новлення фертильності, що містить ДНК, що кодує за п. 21, що додатково містить елітну подію MSінгібітор рибонуклеази під керуванням промотору, BN1, яка характеризується тим, що геномна ДНК 5 88861 6 який спрямовує експресію зазначеного ДНК прина ДНК вказаної рослини може використовуватись наймні в ті клітини, в котрих експресується ген для підсилення фрагмента ДНК завдовжки причоловічої стерильності елітної події MS-BN1, та близно 215 bp, за допомогою полімеразнос) збирання врожаю гібридного насіння від зазналанцюгової реакції з двома праймерами, що маченої рослини озимого олієнасіннєвого рапсу з ють нуклеотидні послідовності SEQ ID No. 23 і чоловічою стерильністю. SEQ ID No. 41 відповідно, де зазначена відновлю30. Спосіб за п. 29, який відрізняється тим, що юча фертильність рослина є доступною з насіння, відновлююча фертильність рослина містить елітну як його депонували в АТСС під номером доступу подію RF-BN1 та характеризується тим, що геномРТА-730. Даний винахід стосується рослин озимого олієнасіннєвого рапсу (WOSR) і, зокрема, пари рослин озимого олієнасіннєвого рапсу, яка є особливо придатною до продукування гібридного насіння. Конкретніше, одна рослина такої пари є рослиною з чоловічою стерильністю завдяки наявності в її геномі гена чоловічої стерильності, у той час як інша рослина такої пари несе в собі ген відновлення фертильності, здатний відвернути дію гена чоловічої стерильності. Пара рослин WOSR за даним винаходом поєднує в собі здатність утворювати гібридне насіння, що характеризується оптимальною повною агрономічною потужністю, генетичною стабільністю і здатністю адаптуватися до різного генетичного підґрунтя. Усі цитовані тут документи включені у даний опис шляхом посилання. Фенотипічна експресія трансгена в рослині визначається як структурою самого гена, так і місцем його знаходження в геномі рослини. Водночас наявність трансгена в різних місцях генома рослини буде впливати на весь фенотип рослини різним чином. Успішне з боку агрономічного або промислового виходу надання рослині економічно привабливої риси шляхом генетичної маніпуляції може стати довготривалим процесом, залежним від багатьох факторів. Фактична трансформація і регенерація генетично трансформованих рослин є лише першими стадіями процесу селекції, який включає у себе поширене визначення генетичних характеристик, розмноження й оцінку у польових випробуваннях. Олієнасіннєвий рапс (OSR: oilseed rаре) (Brassica napus, AACC, 2n=38) є природним гібридом, що утворився внаслідок міжвидової гібридизації капусти (Brassica Oleracea, СС, 2n=18) і ріпи (Brassica campestris, АЛ, 2n=20). Озимий олієнасіннєвий рапс сіють в останню декаду серпня і першу декаду вересня, а збирають у липні наступного року, враховуючи потрібний помірний період яровизації. Скороспілі сорти рапсу сіють наприкінці березня -початку квітня, а збирають із середини серпня аж до вересня. Основні сорти OSR, які вирощуються сьогодні, є низько- і високоерукокислотними різновидами. Двічі низькокислотні різновиди (00) мають низькі кількісні рівні (як правило, менше 1%) ерукових кислот (важко перетравлюваних людиною) і низькі рівні глюкозинолатів (які утворюють важко перетравний борошняний побічний продукт для тварин). Використовувані сьогодні різновиди (00) включають в число вироблюваних з них продуктів олію для споживання людиною і високобіл кове борошно в корм тваринам. Промисловістю з цих культур використовують сировину для фармацевтичних і гідравлічних олій. Різновиди високоерукокислотного рапсу (HEAR: High erucic acid rape) вирощуються спеціально для використання ерукової кислоти, що в них міститься - у середньому 50-60% олії. Сорти HEAR вирощують, головним чином, для одержання ерукаміду - добавки, що знижує тертя і знаходить застосування у поліетановому виробництві. Невелика частина цієї сировини використовується для вироблення бегенілового спирту, який додається у воскоподібну сиру мінеральну олію для поліпшення її текучості. Олієнасіннєвий рапс є двостатевою рослиною і, як правило, на 60-70% самозапилюваним. Одержання гібридів і введення генетичних варіацій як основи для селекції традиційно залежало від адаптації такого природного феномену, як самонесумісність і цитоплазматична чоловіча стерильність. Штучні способи регулювання запилювання, такі як ручна емаскуляція або застосування гаметоцидів, не знайшли широкого застосування у схрещуванні OSR через їхню обмежену практичність і високу вартість відповідно. Для продукування рослин з чоловічою або жіночою стерильністю були розроблені трансгенні способи, які являють собою привабливу альтернативу традиційним способам. В ЕР 0344029 описана система одержання ядерної чоловічої стерильності, за допомогою якої рослини трансформуються геном чоловічої стерильності, який містить, наприклад, ДНК, що кодує барназу під контролем специфічного промотору тапетуму РТА29, котрий при введенні його в рослину забезпечує селективну деструкцію клітин тапетуму. Трансформація тютюну і олієнасіннєвого рапсу таким химерним геном давала рослини з повністю відвернутим утворенням пилку [Mariani et al. 1990, Nature 347: 737-741]. Для відновлення фертильності в потомстві рослини з чоловічою стерильністю була розроблена система, за допомогою якої рослина з чоловічою стерильністю схрещувалася з трансгенною рослиною, яка несла ген відновлення фертильності, котрий після експресії був здатний інгібувати або відвертати активність гена чоловічої стерильності [Патенти США №№5,689,041 і 5,792,929]. Такий ген відновлення фертильності розміщується під керуванням промотору, який спрямовує експресію принаймні в ті клітини, в котрих експресується ген чоловічої стерильності. В роботі [Mariani et al., 1992, Nature 357:384-387] було показано, що сте 7 88861 8 рильність, кодована геном рТА29:барнази, може в ііі) однієї групи із двох фрагментів НраІ, один з олієнасіннєвому рапсі бути відновлена химерним яких має довжину в межах від 1986 до 2140 bр, у геном рТА29:барстар (pTA29:barstar). В роботі [De кращому варіанті приблизно 1990 bр, і один має Block and De Brouwer, 1993, Planta 189:218-225] довжину в межах від 2140 до 2450 bр, у кращому описаний цитохімічний і гістохімічний аналіз інших варіанті приблизно 2229 bр; виведених рослин Brassica napus, які містять хиiv) однієї групи із трьох фрагментів Afllll, один з мерний ген рТА29:барнази один або разом з яких має довжину в межах від 514 до 805 bр, у рТА29:барстар. кращому варіанті приблизно 522 bр, один має доБула успішно здійснена трансформація виду вжину в межах від 2140 до 2450 bр, у кращому Brassica за допомогою цілого ряду способів, вклюваріанті приблизно 2250 bр, і один має довжину в чаючи агробактеріальне інфікування, як описано, межах від 2450 до 2838 bр, у кращому варіанті наприклад, в [ЕР 0,116,718 і ЕР 0,270,882], бомбаприблизно 2477 bр; рдування мікрочастками [Chen et al., 1994, Theor. v) однієї групи із двох фрагментів Ndel, обидва Appl. Genet. 88:187-192] і пряме поглинання ДНК завдовжки в межах від 5077 до 14057 bр, а у кра[De Block et al. 1989, Plant Physiol. 914:694-701; щому варіанті один завдовжки приблизно 6500 bр, Poulsen 1996, Plant Breeding 115:209-225]. а один завдовжки приблизно 10kbp; причому кожПроте в жодному з вищеперелічених докуменний із фрагментів рестрикції є здатним гібридизутів не висловлюється думок і припущень, які б збіватися в стандартних умовах жорсткості з фраггалися з ідеєю, покладеною в основу даного винаментом 3942 bр, що містить послідовність РТА29ходу. барнази, одержувану шляхом перетравлення фраДаний винахід стосується пари рослин WOSR, гментом Hindlll описаної тут плазміди pTHW107, особливо підходящих для продукування гібридноі/або го насіння. Зокрема, винахід стосується першої b) зазначена геномна ДНК є здатною давати трансгенної рослини WOSR або її насіння, клітин принаймні дві, у кращому варіанті принаймні три, у чи тканин, які містять інтегровану в її геном касету ще кращому - чотири групи фрагментів рестрикції, експресії, що містить ген чоловічої стерильності, і вибрані серед: другої трансгенної рослини WOSR або її насіння, і) однієї групи з чотирьох фрагментів ВаmНІ, клітин чи тканин, які містять інтегровану в її геном серед яких один має довжину в межах від 805 до касету експресії, що містить ген відновлення фер1099 bр, у кращому варіанті приблизно 814 bр, тильності, і гібридного насіння, одержуваного один має довжину в межах від 1700 до 1986 bр, у схрещуванням першої і другої рослин, яке містить кращому варіанті приблизно 1849 bр, один має ген чоловічої стерильності і/або ген відновлення довжину в межах від 2450 до 2838 bр, у кращому фертильності, інтегровані в її геном. варіанті приблизно 2607 bр, і один має довжину в В одному з варіантів здійснення винаходу пемежах від 5077 до 14057 bр, у кращому варіанті рша рослина WOSR або її насіння, клітини чи ткаприблизно 6500 bр; нини містять касету експресії pTHW107. У кращоіі) однієї групи з чотирьох фрагментів EcoRI, му варіанті здійснення винаходу перша рослина один з яких має довжину в межах від 805 до 1159 WOSR або її насіння, клітини чи тканини містять bр, у кращому варіанті приблизно 1094 bр, один подію MS-BN1. має довжину в межах від 1986 до 2450 bр, у краВ іншому варіанті здійснення винаходу друга щому варіанті приблизно 2149 bр, і два мають дорослина WOSR або її насіння, клітини чи тканини вжину в межах від 5077 до 14057 bр, у кращому містять касету експресії pTHW1118. У кращому варіанті один має довжину приблизно 7000 bр, і варіанті здійснення винаходу рослина WOSR або один має довжину приблизно 10 kbp; її насіння, клітини чи тканини містять подію RFііі) однієї групи з двох фрагментів EcoRV, сеBN1. В особливо кращому варіанті здійснення виред яких обидва фрагменти мають довжину в менаходу перша рослина WOSR містить подію MSжах від 5077 до 14057 bр, у кращому варіанті один BN1, друга рослина WOSR містить подію RF-BN1, має довжину приблизно 5,4 kbp, і один має довжиа одержане з них гібридне насіння містить як MSну приблизно 8 kbp; BN1, так і RF-BN1 або тільки RF-BN1. iv) однієї групи з трьох фрагментів Hindlll, сеДаний винахід стосується трансгенного насінред яких один має довжину в межах від 1700 до ня WOSR або рослини, яка може бути вирощеною 2140 bр, у кращому варіанті приблизно 1969 bр, і з такого насіння, геномна ДНК якого характеризудва мають довжину в межах від 2450 до 2838 bр, у ється однією або обома такими рисами: кращому варіанті один має довжину приблизно а) вищезазначена геномна ДНК є здатною да2565 bр і один має довжину приблизно 2635 bр; вати принаймні дві, у кращому варіанті принаймні де кожний з цих фрагментів рестрикції здатний три, у ще більш кращому варіанті принаймні чотигібридизуватися в стандартних умовах жорсткості ри і у найкращому - принаймні п'ять груп фрагменз фрагментом 2182 bр, що містить послідовність тів рестрикції, вибраних серед: РТА29-барстар, одержувану шляхом перетравлюі) однієї групи із двох фрагментів EcoRI, серед вання фрагментом НраІ описаної тут плазміди яких один має довжину від 2140 до 2450 bр, у pTHW118. кращому варіанті приблизно 2266 bр, і один має Даний винахід стосується насіння рослини довжину більше 14 kbp; WOSR або рослини, що може бути вирощена з іі) однієї групи із двох фрагментів EcoRV, сетакого насіння, а також стосується її клітин чи ткаред яких один має довжину в межах від 1159 до нин, геномна ДНК яких має одну чи обидві такі 1700 bр, у кращому варіанті приблизно 1,4 kbp, і риси: один має довжину більше 14 kbp; 9 88861 10 a) ця геномна ДНК є здатною давати принайммежах від 2450 до 2838 bр, у кращому варіанті ні дві, у кращому варіанті принаймні три, наприприблизно 2477 bр; клад, принаймні чотири, у ще кращому варіанті v) однієї групи із двох фрагментів Ndel, обидва п'ять груп фрагментів рестрикції, вибраних із пезавдовжки в межах від 5077 до 14057 bр, а у крареліку, зазначеного вище в п. а), куди входять грущому варіанті один завдовжки приблизно 6500 bр, пи фрагментів рестрикції, описані вище в пп. а) і), і один завдовжки приблизно 10kbp; іі), ііі), iv) і v), і, таким чином, вибір може включати де кожний із цих фрагментів рестрикції здатбудь-яку комбінацію із і), іі), ііі), iv) і v), наведених ний гібридизуватися в стандартних умовах жорствище в п. а); і/або кості з фрагментом 3942 bр, що містить послідовb) геномна ДНК є здатною давати принаймні ність РТА29-барнази, отримувану шляхом дві, у кращому варіанті принаймні три, у ще краперетравлювання фрагментом Hindlll описаної тут щому варіанті принаймні чотири групи фрагментів плазміди pTHW107, і/або рестрикції, вибраних із наведеного вище переліку с) геномна ДНК може використовуватися для в п. b), в який входять групи фрагментів рестрикції, підсилення фрагмента ДНК завдовжки від 260 до описані вище в п. b) і), іі), ііі)і iv), внаслідок чого 300 bp, у кращому варіанті приблизно 280 bp, за вибір може включати будь-яку комбінацію серед допомогою полімеразно-ланцюгової реакції з двопп. і), іі), ііі) і iv), описаних вище в п. b). ма праймерами, що мають нуклеотидні послідовВинахід стосується також насіння WOSR або ності SEQ ID No. 12 і SEQ ID No. 19 відповідно. рослин, вирощених з такого насіння, геномна ДНК Даний винахід стосується насіння рослини яких характеризується однією або обома такими WOSR, переважно рослини з чоловічою стерильрисами: ністю або рослини, яка може вирощуватися із таc) геномна ДНК може використовуватися для кого насіння, а також стосується їхніх клітин чи підсилення фрагмента ДНК завдовжки від 260 до тканин, геномна ДНК яких характеризується тим, 300 bр, у кращому варіанті приблизно 280 bр, за що вона є здатною давати принаймні дві, у крадопомогою полімеразно-ланцюгової реакції з двощому варіанті принаймні три, у ще кращому варіама праймерами, що мають нуклеотидні послідовнті - п'ять груп фрагментів рестрикції, вибраних ності SEQ ID No. 12 і SEQ ID No. 19 відповідно, серед вищеописаних груп, які включають у себе і/або групи фрагментів рестрикції, описаних вище в пп. d) геномна ДНК може використовуватися для і), іі), ііі), iv) і v), внаслідок чого вибір може включапідсилення фрагмента ДНК завдовжки від 195 до ти у себе будь-яку комбінацію із наведених вище 235 bр, у кращому варіанті приблизно 215 bр, за пп. і), іі), ііі), iv) і v). допомогою полімеразно-ланцюгової реакції з двоДаний винахід стосується також насіння росма праймерами, які мають нуклеотидні послідовлини WOSR, або рослини, вирощеної з такого наності SEQ ID No. 23 і SEQ ID No. 41 відповідно. сіння, геномна ДНК яких характеризується однією Винахід стосується також насіння WOSR або або обома такими рисами: рослин, вирощених з такого насіння, геномна ДНК b) геномна ДНК є здатною давати принаймні яких характеризується однією з рис, описаних видві, у кращому варіанті принаймні три, у ще краще в пунктах а) і с), і/або рис, описаних вище в щому варіанті чотири фрагменти рестрикції або пунктах b) і d). групи фрагментів рестрикції, вибрані серед: Винахід стосується насіння рослини WOSR і) однієї групи з чотирьох фрагментів ВаmНІ, або рослини, яка може бути вирощена з такого де один фрагмент має довжину в межах від 805 до насіння, геномна ДНК яких характеризується одні1099 bp, у кращому варіанті приблизно 814 bp, єю або обома такими рисами: один має довжину в межах від 1700 до 1986 bp, у а) геномна ДНК є здатною давати принаймні кращому варіанті приблизно 1849 bp, один має дві, у кращому варіанті принаймні три, у більш довжину в межах від 2450 до 2838 bp, у кращому кращому варіанті принаймні чотири, і в найкращоваріанті приблизно 2607 bp, і один має довжину в му варіанті п'ять груп фрагментів рестрикції, вибмежах від 5077 до 14057 bp, у кращому варіанті раних серед: приблизно 6500 bp; і) однієї групи із двох фрагментів EcoRI, серед іі) однієї групи з чотирьох фрагментів EcoRI, яких один має довжину від 2140 до 2450 bр, у один з яких має довжину в межах від 805 до 1159 кращому варіанті приблизно 2266 bр, і один має bp, у кращому варіанті приблизно 1094 bp, один довжину більше 14 kbp; має довжину в межах від 1986 до 2450 bp, у краіі) однієї групи із двох фрагментів EcoRV, сещому варіанті приблизно 2149 bp, і два мають доред яких один має довжину в межах від 1159 до вжину в межах від 5077 до 14057 bp, у кращому 1700 bр, у кращому варіанті приблизно 1,4 kbp, і варіанті один має довжину приблизно 7000 bp, і один має довжину більше 14 kbp; один має довжину приблизно 10 kbp; ііі) однієї групи із двох фрагментів НраІ, один з ііі) однієї групи з двох фрагментів EcoRV, сеяких має довжину в межах від 1986 до 2140 bр, у ред яких обидва фрагменти мають довжину в мекращому варіанті приблизно 1990 bр, і один має жах від 5077 до 14057 bp, у кращому варіанті один довжину в межах від 2140 до 2450 bр, у кращому має довжину приблизно 5,4 kbp, і один має довживаріанті приблизно 2229 bр; ну приблизно 8 kbp; iv) однієї групи із трьох фрагментів Afllll, один з iv) однієї групи з трьох фрагментів Hindlll, сеяких має довжину в межах від 514 до 805 bр, у ред яких один має довжину в межах від 1700 до кращому варіанті приблизно 522 bр, один має до2140 bp, у кращому варіанті приблизно 1969 bp, і вжину в межах від 2140 до 2450 bр, у кращому два мають довжину в межах від 2450 до 2838 bp, у варіанті приблизно 2250 bр, і один має довжину в 11 88861 12 кращому варіанті один має довжину приблизно рильності за даним винаходом з рослиною WOSR, 2565 bp і один має довжину приблизно 2635 bp; що є відновлювачем фертильності, за даним виде кожний з цих фрагментів рестрикції здатний находом. гібридизуватися в стандартних умовах жорсткості Даний винахід стосується також рослини з фрагментом 2182 bp, що містить послідовність WOSR, її клітини, тканини або насіння, які містять РТА29-барстар, одержувану шляхом перетравлюрекомбінантну ДНК, що включає у себе принаймні вання фрагментом НраІ описаної тут плазміди один трансген, інтегрований в частину хромосомpTHW118; і/або ної ДНК, котра характеризується послідовністю d) геномна ДНК може використовуватися для SEQ ID No.22, і/або рекомбінантну ДНК, що вклюпідсилення фрагмента ДНК завдовжки від 195 до чає у себе принаймні один трансген, інтегрований 235 bр, у кращому варіанті приблизно 215 bр, за в частину хромосомної ДНК, котра характеризудопомогою полімеразно-ланцюгової реакції з двоється послідовністю SEQ ID No. 34. ма праймерами, які мають нуклеотидні послідовВинаходом також пропонується спосіб одерності SEQ ID No. 23 і SEQ ID No. 41 відповідно. жання трансгенної клітини рослини WOSR або Даний винахід стосується насіння рослини одержаної із неї рослини, який включає у себе WOSR, переважно рослини відновлення фертильінсерцію молекули рекомбінантної ДНК в частину ності або рослини, яка може бути вирощеною з хромосомної ДНК клітини WOSR, що характеризутакого насіння, а також стосується їхніх клітин чи ється послідовністю SEQ ID No. 22 і, в разі потретканин, геномна ДНК яких є здатною давати приби, регенерування рослини WOSR із трансформонаймні дві, у кращому варіанті принаймні три і в ваної клітини WOSR. найкращому - чотири групи фрагментів рестрикції, Винаходом пропонується також спосіб одервибраних серед описаних вище груп, що включажання трансгенної клітини рослини WOSR або ють у себе групи фрагментів рестрикції згідно з рослини, одержаної з неї, який включає в себе переліченими вище пп. b) і), іі), ііі) і iv), внаслідок інсерцію молекули рекомбінантної ДНК у частину чого вибір може включати будь-яку комбінацію хромосомної ДНК клітини WOSR, що характеризусеред цих пп. і), іі), ііі) і iv). ється послідовністю SEQ ID No. 34, і, в разі потреДаний винахід стосується трансгенних рослин би, регенерування рослини WOSR із трансформоWOSR, клітин, тканин або насіння, які у кращому ваної клітини WOSR. варіанті характеризуються обома рисами, описаДаний винахід стосується також способу іденними вище в пп. b) і/або d) відповідно. тифікації трансгенної рослини або її клітин чи ткаДаний винахід також стосується трансгенних, нин, що містять елітну подію MS-BN1 за даним переважно гібридних рослин WOSR з відновленою винаходом, який (спосіб) включає в себе встановфертильністю, їхніх клітин, тканин або насіння, лення однієї чи обох таких характеристик геномної одержуваних шляхом схрещування рослини чолоДНК трансгенної рослини або її клітин чи тканин: вічої стерильності з рослиною відновлення фертиа) геномна ДНК є здатною давати принаймні льності за даним винаходом, що характеризується дві, у кращому варіанті принаймні три, у більш відповідними рисами, описаними вище, внаслідок кращому варіанті принаймні чотири, і в найкращочого рослини з відновленою фертильністю, їхні му варіанті п'ять груп фрагментів рестрикції, вибклітини, тканини або насіння характеризуються як раних серед: молекулярними особливостями рослини WOSR і) однієї групи із двох фрагментів EcoRI, серед чоловічої стерильності, так і особливостями заяких один має довжину від 2140 до 2450 bр, у значеної вище рослини WOSR відновлення феркращому варіанті приблизно 2266 bр, і один має тильності. Винахід стосується також трансгенних, довжину більше 14 kbp; переважно, гібридних рослин WOSR, їхніх клітин, іі) однієї групи із двох фрагментів EcoRV, сетканин чи насіння, одержуваних шляхом схрещуред яких один має довжину в межах від 1159 до вання рослини чоловічої стерильності з рослиною 1700 bр, у кращому варіанті приблизно 1,4 kbp, і відновлення фертильності за даним винаходом, один має довжину більше 14 kbp; що характеризується молекулярними особливосііі) однієї групи із двох фрагментів НраІ, один з тями, згаданими вище, внаслідок чого гібридні яких має довжину в межах від 1986 до 2140 bр, у рослини, їхні клітини, тканини або насіння хараккращому варіанті приблизно 1990 bр, і один має теризуються молекулярними особливостями видовжину в межах від 2140 до 2450 bр, у кращому щезазначеної рослини WOSR відновлення фертиваріанті приблизно 2229 bр; льності. iv) однієї групи із трьох фрагментів Afllll, один з Даний винахід стосується також насіння, деяких має довжину в межах від 514 до 805 bр, у понованого в АТСС (Американській колекції типокращому варіанті приблизно 522 bр, один має дових культур) під номером доступу РТА-730, росливжину в межах від 2140 до 2450 bр, у кращому ни, що вирощується із цього насіння, а також варіанті приблизно 2250 bр, і один має довжину в клітин або тканин рослини, вирощеної з цього намежах від 2450 до 2838 bр, у кращому варіанті сіння. Винахід стосується також рослин, що моприблизно 2477 bр; жуть отримуватися шляхом розмноження рослини v) однієї групи із двох фрагментів Ndel, обидва WOSR, і/або схрещування з рослиною WOSR, визавдовжки в межах від 5077 до 14057 bр, у кращорощеною з насіння, депонованого в АТСС під ному варіанті один завдовжки приблизно 6500 bр, і мером доступу РТА-730. один завдовжки приблизно 10kbp; Даний винахід стосується також способу одеде кожний із цих фрагментів рестрикції здатржання гібридного насіння WOSR, який включає у ний гібридизуватися в стандартних умовах жорстсебе схрещування рослини WOSR чоловічої стекості з фрагментом 3942 bр, що містить послідов 13 88861 14 ність РТА29-барнази, отримувану шляхом переВинахід також стосується комплекту для ідентравлювання фрагментом Hindlll описаної тут платифікації рослин, що містять елітну подію RF-BN1 зміди pTHW107, і/або за даним винаходом, який містить два PCR-зонди с) геномна ДНК може використовуватися для з нуклеотидними послідовностями SEQ ID No. 23 і підсилення фрагмента ДНК завдовжки від 260 до SEQ ID No. 41. 300 bр, у кращому варіанті приблизно 280 bр, згідВинахід також стосується комплекту для іденно з описаним тут протоколом PCR-ідентифікації тифікації елітної події MS-BN1 і/або RF-BN1 у біодвома праймерами, що ідентифікують вищезазналогічних зразках, який містить принаймні один чену елітну подію і мають нуклеотидні послідовноспецифічний праймер або зонд, що має послідовсті SEQ ID No. 12 і SEQ ID No. 19 відповідно. ність, яка відповідає (або є комплементарною) Даний винахід стосується також способу іденпослідовності, котра має 80-100% ідентичність зі тифікації трансгенної рослини або її клітин чи ткаспецифічною ділянкою MS-BN1, і/або принаймні нин, що містять елітну подію RF-BN1 за даним один специфічний праймер або зонд, що має повинаходом, який (спосіб) включає в себе встановслідовність, яка відповідає (або є комплементарлення однієї чи обох таких характеристик геномної ною) послідовності, котра має 80-100% ідентичДНК трансгенної рослини або її клітин чи тканин: ність зі специфічною ділянкою RF-BN1. У кращому b) зазначена геномна ДНК є здатною давати варіанті здійснення послідовність зонда відповідає принаймні дві, у кращому варіанті принаймні три, у специфічній ділянці, яка містить частину 5'- або 3'ще кращому - чотири групи фрагментів рестрикції, фланкувальної ділянки події MS-BN1 і/або RF-BN1. вибрані серед: У найкращому варіанті специфічний зонд має (або і) однієї групи з чотирьох фрагментів ВаmНІ, є комплементарним) послідовності, що має 80серед яких один має довжину в межах від 805 до 100% ідентичність з послідовністю ДНК рослини в 1099 bр, у кращому варіанті приблизно 814 bр, межах SEQ ID No. 36 або SEQ ID No. 38 для MSодин має довжину в межах від 1700 до 1986 bр, у BN1 або з послідовністю ДНК рослини в межах кращому варіанті приблизно 1849 bр, один має SEQ ID No. 39 або SEQ ID No. 40 для RF-BN1. довжину в межах від 2450 до 2838 bр, у кращому У кращому варіанті здійснення комплект за варіанті приблизно 2607 bр, і один має довжину в даним винаходом у додаток до праймера, що спемежах від 5077 до 14057 bр, у кращому варіанті цифічно розпізнає 5'- або 3'-фланкувальну ділянку приблизно 6500 bр; подій MS-BN1 і/або RF-BN1, містить другий прайіі) однієї групи з чотирьох фрагментів EcoRI, мер, що специфічно розпізнає послідовність у стоодин з яких має довжину в межах від 805 до 1159 ронній ДНК подій MS-BN1 і/або RF-BN1, для заbр, у кращому варіанті приблизно 1094 bр, один стосування в протоколі PCR-ідентифікації. має довжину в межах від 1986 до 2450 bр, у краКомплект за даним винаходом у кращому варіанті щому варіанті приблизно 2149 bр, і два мають домістить два (або більше) специфічних праймери, вжину в межах від 5077 до 14057 bр, у кращому один із яких розпізнає послідовність на 3'варіанті один має довжину приблизно 7000 bр, і фланкувальній ділянці подій MS-BN1 і/або RFодин має довжину приблизно 10 kbp; BN1, а в найкращому варіанті - послідовність на ііі) однієї групи з двох фрагментів EcoRV, седілянці SEQ ID No. 36 або SEQ ID No. 38 ДНК росред яких обидва фрагменти мають довжину в мелини для події MS-BN1 або послідовності SEQ ID жах від 5077 до 14057 bр, у кращому варіанті один No. 39 чи SEQ ID No. 40 ДНК рослини для події має довжину приблизно 5,4 kbp, і один має довжиRF-BN1, а інший розпізнає послідовність у сторонну приблизно 8 kbp; ній ДНК події MS-BN1 і/або RF-BN1 відповідно. В iv) однієї групи з трьох фрагментів Hindlll, сеособливо кращому варіанті здійснення винаходу ред яких один має довжину в межах від 1700 до праймер, що розпізнає послідовність ДНК рослини 2140 bр, у кращому варіанті приблизно 1969 bр, і на 5'-фланкувальній ділянці MS-BN1, містить нукдва мають довжину в межах від 2450 до 2838 bр, у леотидну послідовність SEQ ID No. 19. Зокрема, кращому варіанті один має довжину приблизно праймер, що розпізнає послідовність ДНК рослини 2565 bр і один має довжину приблизно 2635 bр; на 5'-фланкувальній ділянці події MS-BN1, містить де кожний з цих фрагментів рестрикції здатний нуклеотидну послідовність SEQ ID No. 19, а прайгібридизуватися в стандартних умовах жорсткості мер, що розпізнає сторонню ДНК події MS-BN1, з фрагментом 2182 bр, що містить послідовність містить описану тут нуклеотидну послідовність РТА29-барстар, одержувану шляхом перетравлюSEQ ID No. 12. В особливо кращому варіанті здійвання фрагментом НраІ описаної тут плазміди снення винаходу праймер, що розпізнає послідовpTHW118; і/або ність ДНК рослини на 5'-фланкувальній ділянці d) геномна ДНК може використовуватися для події RF-BN1, містить нуклеотидну послідовність підсилення фрагмента ДНК завдовжки від 195 до SEQ ID No. 41. Зокрема, праймер, що розпізнає 235 bр, у кращому варіанті приблизно 215 bр, за послідовність ДНК рослини на 5'-фланкувальній описаним тут протоколом PCR-ідентифікації з ділянці події MS-BN1, містить нуклеотидну послідвома праймерами, які ідентифікують вищезазнадовність SEQ ID No. 41, а праймер, що розпізнає чену елітну подію і мають нуклеотидні послідовносторонню ДНК події RF-BN1, містить описану тут сті SEQ ID No. 23 і SEQ ID No. 41 відповідно. нуклеотидну послідовність SEQ ID No. 23. Винахід також стосується комплекту для іденСпособи і комплекти, що охоплюються даним тифікації рослин, що містять елітну подію MS-BN1 винаходом, можуть використовуватися для різноза даним винаходом, який містить два PCR-зонди манітних цілей і, зокрема, але не обмежуючись з нуклеотидними послідовностями SEQ ID No. 12 і лише ними, для ідентифікації подій MS-BN1 і/або SEQ ID No. 19. RF-BN1 у рослинах, рослинному матеріалі або в 15 88861 16 продуктах, таких як, але не обмежуючись лише - ДНК із OSR дикого типу; доріжка 4 - негативний ними, харчові продукти для людей і корм для хуконтрольний зразок (вода); доріжка 5 - молекулярдоби (свіжих або оброблених), що містять матеріно-масовий маркер (зі сполученою циклічною ал рослини або походять з нього. Способи і комструктурою завдовжки 100 bр). плекти за даним винаходом додатково або як Використовуваний тут термін «ген» стосується альтернатива можуть використовуватися для іденбудь-якої послідовності ДНК, що містить декілька тифікації матеріалу трансгенної рослини з метою функціонально зв'язаних фрагментів ДНК, таких як розрізнювання між трансгенним і нетрансгенним промотор і нетрансльовану 5'-ділянку (5'- UTR: матеріалом. Додатково або як альтернатива споuntranslated region), які разом утворюють промотособи і комплекти за даним винаходом можуть вирну ділянку; кодувальну ділянку (яка може кодувакористовуватися для визначення якості (тобто відти або не кодувати на білок); і нетрансльовану 3'сотка чистого матеріалу) матеріалу рослини, що ділянку (3'- UTR), що містить сайт поліаденілюванмістить подію MS-BN1 і/або RF-BN1. ня. Зазвичай в клітинах рослин ділянка 5'- UTR, Конкретні варіанти здійснення даного винахокодувальна ділянка і ділянка 3'- UTR транскрибуду викладені в залежних пунктах поданої тут Форються в РНК, яка у випадку гена, що кодує білок, мули винаходу. транслюється в цей білок. Ген може включати у Докладний опис винаходу, який подано тут себе додаткові фрагменти ДНК, наприклад, інтролише як приклад, що не несе з собою жодних обни. У даному описі під терміном «генетичний ломежень даного винаходу, може бути зрозумілий кус» мається на увазі місце знаходження гена в разом з доданими кресленнями, де геномі рослини. Фіг.1. Плазмідна карта pVE113. Термін «химерний» по відношенню до гена Фіг.2. Рестрикційна карта, отримана після пеабо послідовності ДНК використовується для заретравлення геномної ДНК події MS-BN1. значення того, що даний ген або послідовність Порядок завантажування гелю, що піддавався ДНК містить принаймні два функціонально релеаналізу за методом Саузерн-блотінгу: доріжка 1 вантних фрагменти ДНК (такі як, промотор, ділянДНК події MS-BN1, перетравлена фрагментом ка 5'- UTR, кодувальна ділянка, ділянка 3'- UTR, EcoRI; доріжка 2 - ДНК події MS-BN1, перетравлеінтрон), які звичайно не зв'язуються один з одним і на фрагментом EcoRV; доріжка 3 - ДНК події MSпоходять, наприклад, із різних джерел. Термін BN1, перетравлена фрагментом НраІ; доріжка 4 «сторонній» при визначенні гена або послідовності ДНК події MS-BN1, перетравлена фрагментом ДНК по відношенню до того чи іншого виду рослин Afllll; доріжка 5 -ДНК події MS-BN1, перетравлена використовується для зазначення того, що даний фрагментом Ndel; доріжка 6 - ДНК нетрансгенної ген або дана послідовність ДНК звичайно у даному WOSR, перетравлена фрагментом BamHI; доріжка виді рослин є відсутніми або за природних умов їх 7 - нетрансгенна WOSR, перетравлена фрагменнемає у даному генетичному локусі даного виду том BamHI + контрольна плазмідна pTHW107 ДНК, рослин. Термін «стороння ДНК» використовується перетравлена фрагментом BamHI. тут для визначення послідовності ДНК, вбудованої Фіг.3. Рестрикційна карта, отримана після пев геном рослини в результаті трансформації. Терретравлення геномної ДНК події RF-BN1. мін «трансформувальна ДНК» стосується молекуПорядок завантажування гелю, що піддавався ли рекомбінантної ДНК, застосовуваної для аналізу за методом Саузерн-блотінгу: доріжка 1 трансформування. Трансформувальна ДНК зазвиДНК події RF-BN1, перетравлена фрагментом чай містить один «ген, на який звернена увага» BamHI; доріжка 2 - ДНК події RF-BN1, перетравлеабо «важливий ген» (наприклад, химерний ген), на фрагментом EcoRI; доріжка 3 - ДНК події RFздатний наділяти специфічною характеристикою BN1, перетравлена фрагментом EcoRV; доріжка 4або специфічними характеристиками трансфорДНК події RF-BN1, перетравлена фрагментом мовану рослину. Термін «молекула рекомбінантної HindIll; доріжка 5 - ДНК нетрансгенної WOSR, пеДНК» застосовується для демонстрування того ретравлена фрагментом BamHI; доріжка 6 - нефакту, наприклад, що ізольована молекула нуклетрансгенна WOSR, перетравлена фрагментом їнової кислоти може бути ДНК і може одержуватиBamHI + контрольна плазмідна pTHW118 ДНК, ся у рекомбінантний чи інший спосіб. перетравлена фрагментом BamHI. Використовуваний тут термін «трансген» стоФіг.4. PCR-аналіз різноманітних ліній за протосується важливого гена, вбудованого в геном росколом PCR-ідентифікації події MS-BN1. лини. Терміном «трансгенна рослина» визначаПорядок завантажування гелю: доріжка 1 ється рослина, яка містить принаймні один зразок ДНК із рослини OSR, що містить трансгенну трансген у геномі всіх її клітин. подію MS-BN1; доріжка 2 - зразок ДНК із рослини Стороння ДНК, присутня в рослинах за даним OSR, що містить іншу трансгенну подію; доріжка 3 винаходом, у кращому варіанті містить два важли- ДНК із OSR дикого типу; доріжка 4 - негативний вих гени, конкретніше - або ген чоловічої стерильконтрольний зразок (вода); доріжка 5 - молекулярності і ген гербіцидостійкості, або ген відновлення но-масовий маркер (зі сполученою циклічною фертильності і ген гербіцидостійкості. структурою завдовжки 100 bр). Термін «ген чоловічої стерильності» викорисФіг.5. PCR-аналіз різноманітних ліній за прототовується тут для визначення гена, який при ексколом PCR-ідентифікації події RF-BN1. пресії в рослині надає цій рослині властивості бути Порядок завантажування гелю: доріжка 1 неспроможною продукувати схоже, життєздатне зразок ДНК із рослини OSR, що містить трансгенну насіння. Як приклад гена чоловічої стерильності подію MS-BN1; доріжка 2 - зразок ДНК із рослини можна назвати ген, що містить послідовність ДНК, OSR, що містить іншу трансгенну подію; доріжка 3 котра кодує барназу під керуванням промотору, 17 88861 18 що спрямовує експресію в клітинах тапетуму. Зоктолерантністю до гербіцидів), якими і потрібно рема, згідно з даним винаходом, геном чоловічої було її наділити шляхом включення молекули рестерильності є описана тут «ТА29-барназа». комбінантної ДНК-трансформувальної ДНК, викоТермін «ген відновлення фертильності» застористовуваної під час трансформації (на основі совується тут для визначення гена, який при ексструктури і функції частини або всього важливого пресії в рослині, що містить ген чоловічої стерильгена чи генів). ності, зданий запобігати фенотипічній експресії Терміном «подія» тут визначається (штучний) гена чоловічої стерильності і, таким чином, відногенетичний локус, який у результаті генетичної влювати плодоносність даної рослини. Зокрема, маніпуляції несе сторонню ДНК, що містить приген відновлення фертильності містить ДНК, що наймні одну копію важливого гена (чи генів). Типокодує білок або поліпептид, здатний запобігати вими алельними станами події є наявність чи відфенотипічній експресії гена чоловічої стерильності сутність сторонньої ДНК. Застосовувані тут під керуванням промотору, що спрямовує експревизначення подія «MS» і подія «RF» визначають сію принаймні в тих клітинах, в яких експресується події, які несуть трансгени відповідно «ТА29ДНК чоловічої стерильності. Наприклад, згідно з барнази» і «ТА29-барстар». З боку фенотипії подія даним винаходом геном відновлення фертильносхарактеризується експресією одного і більше ті є описаний тут «ТА29-барстар». трансгенів. На генетичному рівні подія є частиною Убудовування молекули рекомбінантної ДНК у генетичної організації рослини. На молекулярному геном рослини зазвичай є результатом трансфоррівні подія характеризується картою рестрикції мування клітини або тканини (або результатом (наприклад, визначеною Саузерн-блотінгом) і/або іншої генетичної маніпуляції). Конкретний сайт верхньою і/або нижньою фланкувальними посліубудовування є або випадковим, або він є у зададовностями трансгена, і/або молекулярною конфіному місці (у разі застосування способу цільової гурацією трансгена. Зазвичай, трансформація роінтеграції). слини трансформувальною ДНК, що містить Стороння ДНК може характеризуватися міспринаймні один важливий ген, приводить до мноцем її розташування і конфігурацією в сайті убудужини подій, кожна з яких є унікальною. вання молекули рекомбінантної ДНК у геномі росЗастосовуваний тут термін «елітна подія» лини. Сайт в геномі рослини, де була вставлена означає подію, вибрану із групи подій, одержуварекомбінантна ДНК, зветься також «інсерційним них трансформацією тією ж самою трансформувасайтом» або «цільовим сайтом». Інсерція трансгельною ДНК або зворотним схрещуванням з рослина в геном рослини може бути пов'язана з делецінами, отриманими такою трансформацією, на єю ДНК рослини, що зветься «делецією цільового основі експресії і стабільності даного трансгена і сайта». Термін «фланкувальна ділянка» або його сумісності з оптимальними агрономічними «фланкувальна послідовність» застосовується тут характеристиками рослини, що його містить. Тадля визначення послідовності завдовжки принайким чином, вибір елітної події визначається одним, мні 20 bр, краще принаймні 50 bр, і до 5000 bр двома і більше, а ще краще, якщо всіма такими геному рослини, розташованого або безпосередкритеріями: ньо за сторонньою ДНК у прямому і суміжному з a) наявність трансгена не повинна компроменнею напрямках, або у зворотному і суміжному з тувати інші бажані характеристики рослини, нанею напрямках. Способи трансформації, що приприклад, такі, що стосуються агрономічної потужводять до випадкової інтеграції сторонньої ДНК, ності або комерційної цінності; дають трансформанти з різними фланкувальними b) дана подія повинна характеризуватися добділянками, які для кожного трансформанта є хараре визначеною молекулярною конфігурацією, яка ктеристичними і унікальними. Якщо трансген увостабільно успадковується і для якої можуть бути диться в рослину шляхом традиційного схрещурозроблені відповідні діагностичні інструменти для вання, то його ісерційний сайт в геномі рослини контролю ідентичності; або його фланкувальні ділянки у загальному випаc) важливий ген (або гени) у даному трансгені дку не будуть змінюватися. Використовуваний тут повинний (повинні) демонструвати правильну, відтермін «інерційна ділянка» стосується ділянки, що повідну і стабільну просторову і часову фенотипічвідповідає ділянці завдовжки принаймні 40 bр, ну експресію, як за гетерозиготних (або гемізиготкраще принаймні 100 bр, і до більше, ніж 10000 bр, них), так і за гомозиготних умов події, на охоплюваної фланкувальними ділянками трансгекомерційно прийнятному рівні в діапазоні навкона в прямому і зворотному напрямках у «нетранслишніх умов, у котрих рослини, що несуть цю поформованому» геномі рослини, і є такою, що дію, з очевидністю, будуть знаходитися під дією включає у себе інсерційний сайт (а можливо і дезвичайних агрономічних умов. лецію цільового сайта). Беручи до уваги малі розБажано, щоб стороння ДНК була зв'язана з біжності, зумовлені мутацією у межах виду, інсерположенням геному рослини, яке б дозволяло інційна ділянка за своєю послідовністю є принаймні трагресуватися у бажане генетико-комерційне підна 85%, у кращому варіанті на 90%, у ще кращому ґрунтя. - на 95% і в найкращому на 100% ідентичною поЕлітний статус події підтверджується інтрагреслідовності, що містить фланкувальні ділянки у сією цієї елітної події в різноманітні підходящі гепрямому і зворотному напрямках сторонньої ДНК у нетичні підґрунтя і спостереженнями задоволення даній рослині цього виду. одному, двом або всім критеріям, наприклад, a), b) Поняттям експресії важливого гена визначаі с), наведеним вище. ється той факт, що даний ген наділяє рослину одКрім того, для трансгенів, що кодують описану нією і більше фенотипічними рисами (наприклад, тут чоловічу стерильність і відновлення фертиль 19 88861 20 ності, вибір елітних подій буде також визначатися гена, то можуть бути розроблені PCR-зонди, що сумісністю між цими подіями, а конкретніше тим, специфічно розпізнають усю (або усі) послідовщо потомство від схрещування між рослиною, що ність (послідовності) у протоколі PCRнесе подію чоловічої стерильності, і рослиною, що ідентифікації. Рослини або рослинний матеріал, несе подію відновлення фертильності, в котрих що містять елітну подію, можуть бути ідентифіконаявними є обидві ці події, має такі характеристивані шляхом тестування за протоколом PCRки: ідентифікації, використовуючи ці специфічні прайa) адекватну фенотипічну експресію фенотипу мери. з відновленою фертильністю, тобто чоловічою Термін «біологічний зразок» стосується зразка фертильністю; і рослини, рослинного матеріалу або продуктів, що b) фенотипічною експресією на комерційно містять рослинний матеріал. Терміном «рослина» прийнятному рівні в діапазоні навколишніх умов, у охоплюються рослинні тканини WOSR (Brassica котрих рослини, що несуть ці дві події, з певною napus) на всіх стадіях зрілості, а також всі клітини, імовірністю будуть використовуватися за звичайтканини або органи, взяті або виведені із такої них агрономічних умов. рослини, включаючи, без обмеження, її насіння, Таким чином, термін «елітна подія» стосується листя, стеблини, квіти, коріння, поодинокі клітини, генетичного локусу, що містить трансген, котрий гамети, клітинні культури, культури тканин або відповідає вищепереліченим критеріям. Рослина, протопласти. Використовуваний тут термін «росрослинний матеріал або потомство, таке як насінлинний матеріал» стосується матеріалу, одержаня, можуть містити у своєму геномі одну чи більше ного або виведеного із рослини. Продуктами, що елітних подій. містять рослинний матеріал, можуть бути харчові «Діагностичний інструмент», розроблений для продукти, корм для худоби або інші продукти, що ідентифікації елітної події або рослини чи рослинвиробляються із застосуванням рослинного матеного матеріалу, що містить елітну подію, базується ріалу або можуть містити рослинний матеріал. на специфічних геномних характеристиках даної Зрозуміло, що в контексті даного винаходу такі елітної події і, зокрема, на специфічній рестрикційбіологічні зразки переважно тестуються на наявній карті геномної ділянки, що містить сторонню ність у них нуклеїнових кислот, специфічних для ДНК і/або послідовність фланкувальної ділянки (чи подій MS-BN1 і/або RF-BN1, що є свідченням наділянок) трансгена. Використовуваний тут термін явності нуклеїнових кислот у зразках. Отже пере«рестрикційна карта» стосується набору рисунків лічені тут способи ідентифікації елітної події MSСаузерн-блоту, отриманих після розщеплення BN1 і/або RF-BN1 у біологічних зразках, передусім геномної ДНК рослини особливим ферментом рестосуються ідентифікації в біологічних зразках стрикції або групою ферментів рестрикції і після нуклеїнових кислот, що містять елітну подію. гібридизації із зондом, що є подібним за послідовВикористовуваний тут термін «комплект» ністю з трансгеном у стандартних умовах жорсткоозначає групу реагентів, призначених для здійссті. Термін «стандартні умови жорсткості» стосунення способу за даним винаходом і, зокрема, для ється умов описаної тут гібридизації або умов ідентифікації елітної події MS-BN1 і/або RF-BN1 у звичайної гібридизації, описаних в [Sambrook et al. біологічних зразках. Більш конкретно, у кращому (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, варіанті в комплект за даним винаходом входять Second Edition, Cold Spring Harbour Laboratory принаймні один або два специфічних праймери, Press, NY], котрі можуть включати у себе, наприописані вище. Додатково комплект може також клад, такі стадії: 1) імобілізацію фрагментів геноммістити будь-який інший реагент, зазначений тут у ної ДНК рослини на фільтрі; 2) гібридизацію фільпротоколі PCR-ідентифікації. В іншому варіанті тра протягом 1-2 годин при 42°С у 50% формаміді, здійснення даного винаходу в такий комплект мо5 х SSPE, 2 х реагент Денгардта (Denhardt) і 0,1% же входити специфічний зонд, описаний вище, SDS (додецилсульфат натрію), або протягом 1-2 який специфічним чином гібридизується з нуклеїгодин при 68°С в 6 х SSC, 2 х реагент Денгардта і новою кислотою біологічних зразків для ідентифі0,1% SDS; 3) добавлення міченого зонда гібридикації наявності в них подій MS-BN1 і/або RF-BN1 зації; 4) інкубування протягом 16-24 годин; 5) проДодатково комплект може також містити будь-який мивання фільтра протягом 20 хвилин при кімнатній інший реагент (такий як, але без обмеження, бутемпературі в 1 х SSC, 0,1% SDS; 6) трикратне фер для гібридизації, мітку) для ідентифікації попромивання фільтра по 20 хвилин при 68°С в 0,2 дій MS-BN1 і/або RF-BN1 у біологічних зразках за SSC, 0,1% SDS; і 7) експозиція фільтра протягом допомогою специфічного зонду. 24-48 годин на рентгенівську плівку при -70°С з Комплект за даним винаходом може викориспідсилювальним екраном. товуватися, а його компоненти можуть бути відреЗавдяки сайтам ендогенної рестрикції, наявгульовані відповідно до конкретних ситуацій для ним в геномі рослини перед убудуванням сторонздійснення контролю якості (наприклад, чистоти ньої ДНК, інсерція сторонньої ДНК буде змінювати партій насіння), виявлення елітної події в матеріалі специфічну карту рестрикції цього геному. Таким рослини або матеріалі, що містить матеріал росчином, конкретний трансформант або виведене з лини або походить із нього, такого як, але без обнього потомство можуть бути ідентифіковані по меження, продукту харчування або корму для хуодному або більше специфічним рисункам рестридоби. кції. Умови визначення карти рестрикції тої чи інДаний винахід стосується розробки групи елітшої події виведені в «протоколі ідентифікації карт них подій (MS-BN1 і RF-BN1) у WOSR, а також рестрикції». Як альтернатива, якщо була секвенорослин, що містять ці події, потомства, отримувавана одна чи обидві фланкувальні ділянки трансного внаслідок схрещування цих рослин, і клітин 21 88861 22 рослин або рослинного матеріалу, виведених із 1990 bр, і один фрагмент завдовжки в межах від цих подій. Рослини, що містять елітну подію MS2140 до 2450 bр, у кращому варіанті приблизно BN1, були одержані шляхом трансформації за до2229 bр; помогою pTHW107, як описано в Прикладі 1. Рос- Afllll - один фрагмент завдовжки в межах від лини, що містять елітну подію RF-BN1, були одер514 до 805 bр, у кращому варіанті приблизно 522 жані шляхом трансформації за допомогою bр, і один фрагмент завдовжки в межах від 2140 pTHW118, також описаної в Прикладі 1. до 2450 bр, у кращому варіанті приблизно 2250 bр Молекула рекомбінантної ДНК, використовуі один фрагмент завдовжки в межах від 2450 до вана для створення елітної події MS-BN1, містить 2838 bр, у кращому варіанті приблизно 2477 bр; послідовність ДНК, що кодує молекулу барнази під - Ndel - два фрагменти завдовжки в межах від керуванням промотору, який селективно спрямо5077 до 14057 bр, у кращому варіанті один привує експресію в клітини тапетуму (під назвою близно 6500 bр і один приблизно 10 kbp. «ТА29-барнази»). Промотор ТА29 має конфігураДовжина фрагментів ДНК визначається шляцію «тапетум-селективної експресії в OSR [De хом порівняння з групою фрагментів ДНК відомої Block and Debrouwer, Planta 189:218-225, 1993]. довжини і, зокрема, фрагментів Pstl лямбда-ДНК Експресія гена ТА29-барнази в рослинах WOSR фага. Фрагмент завдовжки більше 14 kbp оцінюприводить до деструкції тапетуму, внаслідок чого ється як такий, що має довжину в межах від 14 kbp рослини набувають чоловічої стерильності [Mariani до 40 kbp, коли екстракція ДНК відбувається згідно et al, 1990, див. вище]. Молекула рекомбінантної з методом Делапорта [Dellaporta et al., 1983, Plant ДНК, використовувана для створення події RFMolecular Biology Reporter, 1, vol.3, p.19-21]. BN1, має послідовність ДНК, що кодує молекулу Якщо матеріал рослини після перетравлення барстару під керуванням тапетум-специфічного принаймні двома, в кращому варіанті принаймні промотору (що зветься «РТА29-барстар»). Екстрьома, в ще кращому варіанті принаймні чотирма, пресія гена РТА29-барстар у рослинах WOSR буі в особливо кращому варіанті всіма цими фермеде при наявності гена «ТА29-барнази» в рослині нтами рестрикції дає ферменти ДНК такої самої запобігати дії барнази в клітинах тапетуму рослидовжини, що описані вище, то рослина WOSR вини, відвертаючи деструкцію тапетуму і, таким чизначається як така, що містить елітну подію MSном, відновлюючи фертильність цих рослин BN1. [Mariani et al, 1992, див. вище]. Рослини або рослинний матеріал, які містять Обидві рекомбінантні ДНК, що використовуMS-BN1, можна ідентифікувати також згідно з проються для створення елітних подій MS-BN1 і RFтоколом PCR-ідентифікації, описаним для випадку BN1, містять також послідовність ДНК, що кодує MS-BN1 у Прикладі 5. Методика цієї ідентифікації фермент фосфінотрицинацетилтрансферази і полягає в тому, що геномна ДНК рослини WOSR промотор 35S вірусу Cauliflower Mosaic Virus, де ампліфікується полімеразно-ланцюговою реакцією послідовність, що кодує фосфінотрицинацетилтза допомогою праймера, який специфічно розпірансферазу, знаходиться під керуванням промознає фланкувальну послідовність події MS-BN1, у тору 35S (що зветься «35S-бap»). Промотор 35S кращому варіанті розпізнаючи 5' або 3' фланкувамає конфігурацію «конститутивної» експресії в льну послідовнівсть описуваної тут події MS-BN1 і, OSR, що означає, що він значно експресується у зокрема, за допомогою праймера з послідовністю більшості типів клітин протягом більшої частини SEQ ID No 19, і праймера, який розпізнає послідожиттєвого циклу рослини. Експресія гена 35S-бap вність у трансгені і, зокрема, праймера з послідовв рослинах OSR підтверджує стійкість до гербіциністю SEQ ID No 12. Як контрольні використовудних сполук фосфінтрицину, біалафосу, глюфосиються ендогенні праймери WOSR. Якщо нату, чи більш узагальнено, інгібіторів глутамінсирослинний матеріал дає фрагмент завдовжки від нтетази або їхніх солей та оптичних ізомерів. 260 до 300 bр, краще, якщо приблизно 280 bр, то Рослини або рослинний матеріал WOSR, що рослина WOSR визначається як така, що містить містить подію MS-BN1, може ідентифікуватися елітну подію MS-BN1. згідно з протоколом ідентифікації карт рестрикції, Фенотип рослин, що містять MS-BN1, характеописаним для MS-BN1 у Прикладі 5. Стисло кажуризується тим фактом, що у відсутність в їхньому чи, геномна ДНК WOSR перетравлюється групою геномі гена-відновлювача вони мають чоловічу (у кращому варіанті від 2 до 5) таких ферментів стерильність. Рослина з чоловічою стерильністю рестрикції: EcoRI, EcoRV, Ndel, Hpal, Afllll. Після визначається як така, що не є спроможною продуцього вона передається на нейлонову мембрану і кувати схоже, життєздатне насіння. гібридизується з фрагментом Hindlll завдовжки Рослини, що містять MS-BN1, можна отриму3942 bр плазміди pTHW107 (або Т-ДНК, що в ній вати, наприклад, із насіння, що містить MS-BN1, міститься). Далі для кожного використовуваного депонованого в АТСС під номером доступу РТАферменту рестрикції визначається, чи можуть бути 730. Такі рослини можна далі розмножувати для ідентифіковані такі фрагменти: введення елітної події за даним винаходом в інші - EcoRI - один фрагмент завдовжки в межах культури того ж виду. від 2140 до 2450 bр, у кращому варіанті приблизно Рослини або рослинний матеріал WOSR, що 2266 bр, і один фрагмент більше 14 kbp; містять RF-BN1, можуть бути ідентифіковані згідно - EcoRV - один фрагмент завдовжки в межах з протоколом ідентифікації карт рестрикції, описавід 1159 до 1700 bр, у кращому варіанті приблизно ним у Прикладі 5 для RF-BN1. Коротко ця методи1,4 kbp, і один фрагмент більше 14 kbp; ка полягає в тому, що геномну ДНК WOSR пере- Hpal - один фрагмент завдовжки в межах від травлюють з вибором (у кращому варіанті від 2 до 1986 до 2140 bр, у кращому варіанті приблизно 4) таких ферментів рестрикції: BamHI, EcoRI, 23 88861 24 EcoRV, and Hindlll, потім переносять на нейлонові ТА29-барстар не надає фенотипу помітності. За мембрани і гібридизують з фрагментом НраІ занаявності гена чоловічої стерильності в геномі вдовжки 2182 bр плазміди pTHW118 (або Т-ДНК, рослини ген ТА29-барстар приводить до відновщо в ній міститься). Далі для кожного використолення фертильності, тобто робить фенотип фервуваного ферменту рестрикції визначають, чи мотильним. Рослина з фенотипом відновленої фержуть бути ідентифіковані такі фрагменти: тильності визначається як така, що, незважаючи - BamHI - один фрагмент завдовжки в межах на наявність в її геномі гена чоловічої стерильносвід 805 до 1099 bр, у кращому варіанті приблизно ті, є спроможною продукувати схоже, життєздатне 814 bр, один фрагмент завдовжки в межах від насіння. 1700 до 1986 bр, у кращому варіанті приблизно Рослини, що містять RF-BN1, можуть бути 1849 bр, один фрагмент завдовжки в межах від одержані, наприклад, із насіння, депонованого в 2450 до 2838 bр, у кращому варіанті приблизно АТСС під номером доступу РТА-730. Такі рослини 2607 bр, і один фрагмент в межах від 5077 до можуть бути також розмножені і/або використову14057 bр, у кращому варіанті приблизно 6500 bр; ватися за звичайною схемою розмноження для EcoRI - один фрагмент завдовжки в межах від введення елітної події за даним винаходом в інші 805 до 1159 bр, у кращому варіанті приблизно культивари тих самих рослинних видів. 1094 bр, один фрагмент завдовжки в межах від Рослини, що містять події MS-BN1 і/або RF1986 до 2450 bр, у кращому варіанті приблизно BN1, характеризуються також толерантністю до 2149 bр, і два фрагменти в межах від 5077 до глюфосинату, яка в контексті даного винаходу 14057 bр, у кращому варіанті один завдовжки привключає толерантність до гербіциду Liberty™. Криблизно 7000 bр і один - приблизно 10 kbp; терієм толерантності рослин до гербіциду Liberty™ EcoRV - два фрагменти в межах від 5077 до є те, що обприскування їх на проміжку від третьої 14057 bр, у кращому варіанті один завдовжки придо четвертої листяних стадій (від 3V до 4V) гербіблизно 5,4 kbp і один - приблизно 8 kbp; цидом з активним інгредієнтом у кількості принайHindlll - один фрагмент завдовжки в межах від мні 200г на гектар (г.а.і./га), у кращому варіанті 1700 до 1986 bр, у кращому варіанті приблизно 400г.а.і./га і, можливо, до 1600г.а.і./га, рослину не 1969 bр, і два фрагменти в межах від 2450 до 2838 вбиває. Рослини, що містять MS-BN1 і/або RFbр, у кращому варіанті один завдовжки приблизно BN1, можуть також характеризуватися наявністю в 2565 bр і один - приблизно 2635 bр. їхніх клітинах фосфінотрицинацетилтрансферази, Довжина фрагментів ДНК визначається шлящо визначається шляхом РАТ-аналізу [De Block et хом порівняння з ножиною фрагментів ДНК відомої al, 1987, див. вище]. довжини і, зокрема, фрагментів Pstl лямбда-ДНК Культивування рослин WOSR за даним винафага. ходом може здійснюватися звичайним шляхом. Якщо матеріал рослини після перетравлення Наявність гена 35S-6ap є гарантією того, що ці принаймні двома, в кращому варіанті принаймні рослини будуть толерантними до глюфосинату. трьома, а в найкращому варіанті всіма цими ферТаким чином, боротьба з бур'яном у полях, де виментами рестрикції дає ферменти ДНК такої самої рощуються такі рослини WOSR, може здійснювадовжини, що описані вище, то рослина WOSR витися із застосуванням гербіцидів, котрі як активний значається як така, що містить елітну подію RFінгредієнт (наприклад, Liberty ™) містять глюфосиBN1. нат. Рослини або рослинний матеріал, які містять Рослини, що містять події MS-BN1 і/або RFRF-BN1, можна ідентифікувати також згідно з проBN1, характеризуються також агрономічними влатоколом PCR-ідентифікації, описаним для випадку стивостями, порівняними з комерційно цінними RF-BN1 у Прикладі 5. Коротко методика цієї іденрізновидами WOSR у США. тифікації полягає в тому, що геномну ДНК рослини Агрономічними властивостями, що мають відWOSR ампліфікують полімеразно-ланцюговою ношення до даного питання, є: висота рослин, реакцією за допомогою праймера, який специфічміцність і жорсткість соломи, схильність до виляно розпізнає фланкувальну послідовність події RFгання, зимостійкість, стійкість до затемнення, поBN1, у кращому варіанті 5' або 3' фланкувальну сухостійкість, хворобостійкість (чорна ніжка, світпослідовність описуваної тут події RF-BN1 і, зоклоплямистість листя, склеротинія), виробництво рема, за допомогою праймера з послідовністю насіння і корисний вихід. SEQ ID No 41, і праймера, який розпізнає послідоСпостерігалося, що наявність сторонньої ДНК вність у трансгені, зокрема, праймера з послідовна ділянках інсерції описуваного тут геному рослиністю SEQ ID No 23. Як контрольні використовуни WOSR Brassica napus, а точніше в цих інсерються ендогенні праймери WOSR. Якщо ційних сайтах в геномі рослини WOSR Brassica рослинний матеріал дає фрагмент завдовжки від napus, підтверджує наявність особливо цікавих 195 до 235 bр, краще, якщо приблизно 215 bр, то фенотипічних і молекулярних характеристик у ророслина WOSR визначається як така, що містить слин, що містять ці події. Більш конкретно, наявелітну подію RF-BN1. ність сторонньої ДНК на цих особливих ділянках у Рослини, які містять подію RF-BN1, характеригеномі цих рослин дає стабільну фенотипічну ексзуються тим, що барстар експресується в клітинах пресію трансгенів без суттєвого погіршення будьтапетуму. Продукування барстару в клітинах тапеякого аспекту бажаних агрономічних властивостей туму такої рослини, як було показано в [Маrіаnі et рослин, роблячи їх особливо підходящими для al. 1992, див. вище], ні сприяє, ні завдає шкоди продукування гібридних WOSR. Таким чином, діпродукуванню насіння. Отже, за відсутності гена лянки інсерції, що відповідають послідовностям чоловічої стерильності в геномі такої рослини ген SEQ ID No 22 і SEQ ID No 34, а точніше сайти ін 25 88861 26 серції MS-BN1 і RF-BN1 на них виказують себе як значеною функціональністю чи структурою, може особливо підходящі для введення важливого гена містити додаткові послідовності ДНК та ін. (чи генів). Зокрема, ділянки інсерції MS-BN1 (SEQ У наведених нижче Прикладах описані процес ID No 22) і RF-BN1 (SEQ ID No 34) або сайти інсерозвитку і характеристики рослин WOSR, що місрції відповідно MS-BN1 і RF-BN1 на них є особлитять елітні події MS-BN1 і RF-BN1. во підходящими для введення плазмід, що містять Якщо не зазначено іншого, то всі процедури ген чоловічої стерильності і ген відновлення феррекомбінантних ДНК проводяться за стандартними тильності, забезпечуючи оптимальну експресію протоколами, описаними в [Sambrook et al. (1989) кожного з цих генів або обох генів у рослині, не Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second завдаючи шкоди її агрономічним властивостям. Edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY Молекула рекомбінантної ДНК може бути спеand in Volumes 1 and 2 of Ausubel et al. (1994) цифічним чином вставлена у специфічну ділянку Current Protocols in Molecular Biology, Current способом цільової інсерції. Такі способи добре Protocols, USA]. Стандартні матеріали і способи відомі фахівцям у даній галузі і включають, напримолекулярних досліджень рослин описані в [Plant клад, гомологічну рекомбінацію за допомогою реMolecular Biology Labfax (1993) by R.D.D. Cray комбінази, такої як, але без обмеження, FLPpublished by BIOS Scientific Publications Ltd (UK) рекомбіназа із Saccharomyces cervisiae [Патент and Blackwell Scientific Publications, UK]. США №5,527,695], CRE-рекомбіназа із фага Р1 У даному описі і Прикладах зроблені посиланEscherichia соli [Опублікована заявка РСТ № WO ня на такі послідовності: 9109957], рекомбіназа із pSRI виду Saccharomyces SEQ ID No 1: плазміда pTHW107 rоuхіі [Araki et al. 1985, J Моl Biol 182:191-203] або SEQ ID No 2: плазміда pTHW118 така, як описано в Патенті США №4,673,640, реSEQ ID No 3: праймер 248 комбінаційна система лямбда-фага. SEQ ID No 4: праймер 249 Використовуваний тут термін «ідентичність за SEQ ID No 5: праймер 247 послідовністю» по відношенню до нуклеотидних SEQ ID No 6: праймер 250 послідовностей (ДНК або РНК) стосується ідентиSEQ ID No 7: праймер 251 чності, що визначається як кількість положень з SEQ ID No 8: праймер 254 ідентичними нуклеотидами, поділена на кількість SEQ ID No 9 праймер 258 нуклеотидів у коротшій з двох послідовностей, що SEQ ID No 10: праймер SP6 розглядаються. Порівнювальний аналіз двох нукSEQ ID No 11: праймер Т7 леотидних послідовностей виконується за алгориSEQ ID No 12: праймер 201 (BNA01) тмом Вільбура-Ліпмана [Wilbur and Lipmann, 1983] SEQ ID No 13: послідовність, що містить 5'з розміром вікна 20 нуклеотидів, довжиною слова фланкувальну ділянку події MS-BN1 4 нуклеотиди і штрафом за пропуск 4. Аналіз і інSEQ ID No 14: праймер 611 терпретація даних послідовностей за допомогою SEQ ID No 15: праймер 259 комп'ютера, включаючи порівнювальний аналіз SEQ ID No 16: праймер 260 послідовностей, як зазначалося вище, можна виSEQ ID No 17: праймер 24 конувати, наприклад, за програмами SEQ ID No 18: послідовність, що містить 3'Intelligenetics™ Suite (фірма Intelligenetics Inc., CA). фланкувальну ділянку події MS-BN1 Послідовності вважаються «практично подібниSEQ ID No 19: праймер 51 (BNA02) ми», якщо така послідовність має ідентичність за SEQ ID No 20: праймер 48 послідовністю, що складає принаймні приблизно SEQ ID No 21: послідовність, що містить деле75%, у кращому варіанті приблизно 80%, у ще цію цільового сайта події MS-BN1 кращому варіанті принаймні 85%, в особливо краSEQ ID No 22: інсерційна ділянка MS-BN1 щому варіанті принаймні 90%, у надзвичайно краSEQ ID No 23: праймер 193 (BNA03) щому варіанті приблизно 95% і в найкращому ваSEQ ID No 24: послідовність, що містить 5'ріанті приблизно 100%. Зрозуміло, що коли фланкувальну ділянку події RF-BN1 послідовності РНК визнаються практично подібниSEQ ID No 25: праймер 286 ми одна одній або мають певний ступінь ідентичSEQ ID No 26: праймер 314 ності за послідовністю з послідовностями ДНК, SEQ ID No 27: праймер 315 тимін (Т) у послідовності ДНК вважається таким, SEQ ID No 28: праймер 316 що дорівнює урацилу (U) у послідовності РНК. SEQ ID No 29: праймер 288 Використовуваний тут термін «містить» SEQ ID No 30: послідовність, що містить 3'(«включає», «має») означає наявність в об'єкті, що фланкувальну ділянку події RF-BN1 розглядається, зазначених властивостей, цілих SEQ ID No 31: праймер 269 чисел, стадій або компонентів, але не виключає SEQ ID No 32: праймер 283 наявності чи добавлення одного (однієї) чи більше SEQ ID No 33: праймер 284 властивостей, цілих чисел, стадій або компоненSEQ ID No 34: інтеграційна ділянка RF-BN1 тів, чи груп з них. Таким чином, наприклад, нуклеїSEQ ID No 35: праймер 57 нова кислота або білок, що містить послідовність із SEQ ID No 36: послідовність, що містить 5'нуклеотидів або амінокислот, може містити більше фланкувальну ділянку події MS-BN1 у WOSR нуклеотидів або амінокислот, ніж фактично зазнаSEQ ID No 37: праймер 68 чені, тобто бути вбудованою (чи вбудованим) у SEQ ID No 38: послідовність, що містить 3'більшу нуклеїнову кислоту або білок. Химерний фланкувальну ділянку події MS-BN1 у WOSR ген, що містить ту чи іншу послідовність ДНК з виSEQ ID No 39: послідовність, що містить 5'фланкувальну ділянку події RF-BN1 у WOSR 27 88861 28 SEQ ID No 40: послідовність, що містить 3'сам був виведений із pGSC1700 [Cornelissen and фланкувальну ділянку події RF-BN1 у WOSR Vandewielle, 1989], але містив штучну Т-ділянку, SEQ ID No 41: праймер 268 (BNA04) що складалася із лівограничної і правограничної SEQ ID No 42: праймер BNA05 послідовностей TL-ДНК із рТІВ6S3 і клонувальних SEQ ID No 43: праймер BNA06 сайтів мультилінкера, що дозволяли інсерцію хиПриклади мерних генів між граничними повторами Т-ДНК. Приклад 1. Трансформація Brassica napus геВектор pGSVl був забезпечений геном барстару на ном чоловічої стерильності і геном-відновлювачем основній плазмідній рамці з регуляторними сигнаа) Конструювання химерної ДНК, що містить лами для експресії в Е. соlі. ген барнази, під керуванням тапетального специПовний опис ДНК, замкненої між граничними фічного промотора (pTHW107). повторами плазміди pTHW107, поданий в Таблиця Плазміда pTHW107 (SEQ ID No. 1) була виве1. дена із проміжного вектора pGSVl Вектор pGSVl Таблиця 1 Т-ДНК плазміди pTHW107 nt положення Орієнтація Опис і посилання Правограничний повтор із ТЛ-ДНК із pTiB6S3 [Gielen et al (1984) The EMBO Journal 3: 835-8461. 26-97 Послідовності, виведені із синтетичним полілінкером 3'-нетрансльований кінець із гена TL-ДНК 7 (3'g7) pTiB6S3 [Velten and Schell. (1985) За годиннико309-98 Nucleic Acids Research 13: 6981-6998; Dhaese etal. (1983) The EMBO Journal 3: 835вою стрілкою 846]. 310-330 Послідовності, виведені із синтетичним полілінкером Кодувальна послідовність bаr-гена Streptomyces hygroscopicus [Thompson etal. За годиннико882-331 (1987) The EMBO Journal 6: 2519-2523]. Два N-кінцеві кодони bаr-кодувальної ділявою стрілкою нки дикого типу були заміщені на кодони ATG і GAC відповідно. Промотор із малого субодиничного гена atS1A рибулозо-1,52608- За годинникобіфосфаткарбоксилази із Arabidopsis thaliana (PssuAra) [Krebbers et al. (1988) Plant 883 вою стрілкою Molecular Biology 11: 745-759]. 2609Послідовності, виведені із синтетичним полілінкером 2658 Фрагмент Taql завдовжки 260 bр із 3'-нетрансльованого кінця гена нопалінсинтази 2919- За годиннико(3'nos) із Т-ДНК рТіТ37 з сигналами поліаденілювання рослини [Depicker et al. 2659 вою стрілкою (1982) Journal of Molecular and Applied Genetics 1: 561-573]. 29203'-нетрансльована ділянка прямого напрямку із кодувальної послідовності барнази 3031 В. amyloliquefaciens 3367- За годиннико- Кодувальна ділянка гена барнази із Bacillus amyloliquefaciens [Hartley (1988) 3032 вою стрілкою Journal of Molecular Biology 202:913-915]. Промоторна ділянка пиляк-специфічного гена ТА29 із Nicotiana tabacum. Цей про4877- За годинникомотор містив 1,5 kb зворотної послідовності із кодона ATG ініціації [Seurinck et al. 3368 вою стрілкою (1990) Nucleic Acids Research 18: 3403]. 4878Послідовності, виведені із синтетичним полілінкером 4921 4922Лівограничний повтор із TL-ДНК із pTiB6S3 [Gielen et al (1984) The EMBO Journal 3: 4946 835-846]. 1-25 b) Конструювання химерної ДНК, що містить ген барстару під керуванням конститутивного промотора (pTHW118). Плазміда pTHW118 (SEQ ID No. 2) також була виведена із проміжного вектора pGSVl (зазна ченого вище). Повний опис ДНК, замкненої між граничними повторами плазміди pTHW118, поданий у Табл. 2. 29 88861 30 Таблиця 2 Т-ДНК плазміди pTHW118 nt положення 1-25 Орієнтація Опис і посилання Правограничний повтор із ТЛ-ДНК із pTiB6S3 [Gielen et al (1984) The EMBO Journal 3: 835-846]. 26-53 Послідовності, виведені із синтетичним полілінкером 54-90 Залишкова послідовність із ТЛ-ДНК на правограничному повторі. 91-97 Послідовності, виведені із синтетичним полілінкером 309-98 За годиннико- 3'-нетрансльований кінець із гена 7 ТЛ-ДНК (3'g7) pTiB6S3 [Velten and Schell. вою стрілкою (1985) Nucleic Acids Research 13: 6981-6998; Dhaese et al. (1983) The EMBO Journal 3: 835-846]. 310-330 Послідовності, виведені із синтетичним полілінкером 883-331 За годиннико- Кодувальна послідовність гена стійкості до біалафосу (бар) Streptomyces вою стрілкою hygroscopicus [Thompson et al. (1987) The EMBO Journal 6: 2519-2523]. Два Nкінцеві кодони бар-кодувальної ділянки дикого типу були заміщені на кодони ATG і GAC відповідно. 2608- За годиннико- Промотор із малого субодиничного гена atS1A рибулозо-1,5883 вою стрілкою біфосфаткарбоксилази із Arabidopsis thaliana (PssuAra) [Krebbers et al. (1988) Plant Molecular Biology 11: 745-759]. 2609Послідовності, виведені із синтетичним полілінкером 2658 2919- За годиннико- Фрагмент Taql завдовжки 260 bр із 3'-нетрансльованого кінця гена нопалінсинта2659 вою стрілкою зи (3'nos) із Т-ДНК рТіТ37, що містив сигнали поліаденілювання рослини [Depicker et al. (1982) Journal of Molecular and Applied Genetics 1: 561-573]. 2920Послідовності, виведені із синтетичним полілінкером 2940 29413'-нетрансльована ділянка прямого напрямку із барстар-кодувальної послідовно2980 сті із Bacillus amyloliquefaciens 3253- За годиннико- Кодувальна ділянка барстар-гена із Bacillus amyloliquefaciens [Hartley (1988) 2981 вою стрілкою Journal of Molecular Biology 202:913-915]. 4762- За годиннико- Промоторна ділянка пиляк-специфічного гена ТА29 із Nicotiana tabacum. Цей 3254 вою стрілкою промотор містив 1,5 kb зворотної послідовності із кодона ATG ініціації [Seurinck et al. (1990) Nucleic Acids Research 18: 3403]. 4763Послідовності, виведені із синтетичним полілінкером 4807 4808Лівограничний повтор із ТЛ-ДНК із pTiB6S3 [Gielen et a/(1984) The EMBO Journal 4832 3: 835-846]. с) Трансформація рослини Brassica napus Для трансформування Brassica napus використовувалася векторна система, описана в [Deblaere et al. (1985, 1987]. Ця векторна система складається із штаму Agrobacterium і двох плазмідних компонентів: 1) неонкогенної Ті-плазміди (pGV4000) і 2) проміжного клонувального вектора на основі плазміди pGSV1. Неонкогенна Тіплазміда, із якої була делетована Т-ділянка, несе vir-гени, що потребуються для передачі штучної Т-ДНК, клонованої на другій плазміді у геном рослини. Для трансформування рослини можуть використовуватися штами Agrobacterium, одержувані шляхом трибатьківського схрещування цих компонентів. На всіх стадіях, за винятком стадії регенерації молодої рослинки, яка проводилася за відсутності фосфінотрицину (РРТ) для прискорення "барназа" зондом: "бар" зондом: росту, селекція проводилася на РРТ. В результаті отримували групу первинних трансформантів (рослини покоління Т0). Приклад 2. Виведення подій 2.1. Характеризація трансгенних подій 2.1.1. Аналіз подій MS за методом Саузернблотінгу Наявність трансгена і кількість генних вставок перевірялися за допомогою стандартного аналізу за методом Саузерн-блотінгу. Всю геномну ДНК виділяли із 1г кореневої тканини, як описано в [Dellaporta (1983, Plant Molecular Biology Reporter, 1, vol.3, p.19-21 or Doyle et al. 1987, Phytochem. Bull. 19:11], і перетравлювали ферментом рестрикції Sacl. Фермент Sad має унікальний сайт рестрикції у фрагменті Т-ДНК, розміщеному між конструкціями барнази і бару (bar). Саузерн-блотаналіз виконували з двома такими зондами: 478 bр фрагмент Pstl-EcoRI плазміди pVE113 546 bр фрагмент Ncol-Bglll плазміди pDE110 31 88861 Плазміди pVE113 і pDE110 описані на Фіг.1 і в заявці WO 92/09696, відповідно. Гібридизація подій MS барназа зондом дає смугу завдовжки 12 kb, у той час як гібридизація бар зондом дає фрагмент завдовжки 14 kb. Відносна інтенсивність смуги забезпечувала індикацію того, чи були рослини для трансгенного локусу гомозиготними чи гемізиготними. Було виявлено, що дві події мали прості вставки. Це підтверджувалося тим фактом, що рисунок сегрегації трансгена можна було пояснити спадковістю Менделіана (Mendelian) простого локусу. "барстар" зондом: "бар" зондом: 32 2.1.2. Аналіз подій RF за методом Саузернблотінгу Наявність трансгена і кількість генних вставок перевірялися за допомогою стандартного аналізу за методом Саузерн-блотінгу. Всю геномну ДНК виділяли із 1г кореневої тканини, як описано в [Doyle et al. 1987, Phytochem. Bull. 19:11], і перетравлювали ферментом рестрикції Sacl. Фермент Sacl має унікальний сайт рестрикції у фрагменті Т-ДНК, розміщеному між конструкціями барнази і бару (bar). Саузерн-блот-аналіз виконували з двома такими зондами: 436 bр фрагмент Hindlll-Pstl плазміди pVE113 546 bр фрагмент Ncol-Bglll плазміди pDE110 Гібридизація подій RF барстар зондом дає смугу завдовжки 3 kb, у той час як гібридизація бар зондом дає фрагмент завдовжки 14 kb. Відносна інтенсивність смуги забезпечувала індикацію того, чи були рослини для трансгенного локусу гомозиготними чи гемізиготними. Було виявлено, що кілька подій мали прості вставки. Це підтверджувалося тим фактом, що рисунок сегрегації трансгена можна було пояснити спадковістю Менделіана простого локусу. 2.1.3. Загальний фенотип і агрономічні властивості рослин Рослини Т1 обох подій, MS і RF, були оцінені щодо кількості фенотипічних рис, включаючи висоту рослин, міцність і жорсткість соломи, схильність до вилягання, стійкість до затемнення, посухостійкість, хворобостійкість (чорна ніжка, світлоплямистість листя, склеротинія) і продукування насіння та корисний вихід. Оцінка показала, що лінії були подібними (або поліпшеними) за вищепереліченими агрономічними властивостями порівняно з нетрансформованими різновидами, а також з численними олієнасіннєвими рапсовими культиварами. У деяких випадках рослини виділялися для сомаклональної варіації за однією або більше з вищеперелічених рис. Якщо це не давало нових цікавих з комерційної точки зору фенотипічних рис, то такі рослини викидалися. 2.2. Виведення ліній з MS або RF рисами Молоді гемізиготні рослинки з різними То («Ms/-» або «Rf/-») були перенесені із тканинної культури в грунт теплиці. Наявність трансгена і кількість копій перевіряли за допомогою аналізу за методом Саузерн-блотінгу (описаного вище). Під час цвітіння рослин їхні квіти перевірялися на стерильність і фертильність. Рослини Т0 були схрещені з рослинами дикого типу (-/-) для продукування насіння Т1 (MsT1 і RfT1). Насіння Т1 було посаджене і вирощене в теплиці. У рослин була оцінена їхня толерантність до амонійглюфосинату. Рослини Ms-T1 оцінювалися на сегрегацію стерильності/фертильності (у необприсканих рослин), у той час як рослини Rf-T1 були перевірені на наявність у них плодоносних квітів. Рослини Ms-T1, що містили трансген, для продукування насіння MsRf-F1 були схрещені з випробуваною рослиною, гомозиготною за геном відновлення фертильності (Rf/Rf). Це насіння (Ms/-, Rf/- і -/-, Rf/-) було посаджене в теплиці і обприскане гербіцидом Liberty™. Решта потомства F1 була оцінена на сегрегацію стерильності/фертильності для перевірки того, чи зможе чоловіча стерильність адекватно відновитися у Bnassica napus (фертильність близько 100%). Кращі події були відібрані для подальших випробувань. Рослини Ms-T1 були схрещені з гомозиготним відновлювачем фертильності, і насіння було посаджено в поле. Рослини були оцінені на толерантність до гербіциду Liberty™ (при дозі 800г активного інгредієнту на гектар (г.а.і./га), у той час як доза, що пропонується для фермерів, складає 400г.а.і./га), на сегрегацію фертильність/стерильність і загальні фенотипічні характеристики. При цьому відбиралися лінії, в котрих фертильність була відновлена на 100% і в котрих не спостерігалося негативних оцінок щодо фенотипічних або агрономічних властивостей (докладно див. у п. d) порівняно з ізогенним контрольним зразком дикого типу. Рослини Rf-T1, що містили трансген, були схрещені з випробуваною рослиною (Ms/-), що містила ген чоловічої стерильності, для продукування насіння F1. Це насіння було висаджене в теплицю, обприскане гербіцидом Liberty™ і оцінене на відновлення фертильності (близько 100%). Тимчасом рослини Rf-T1 росли до одержання насіння S1. Рослини S1 вирощувалися в теплиці, обприскувалися гербіцидом Liberty™ і знов продукували насіння S2. Із насіння S2 відбиралися гомозиготні зразки. 2.3. Комбінування подій MS і RF Відібрані рослини Ms-T1 були схрещені з відібраними подіями Rf-S2 в теплиці для випробувань на відновлення фертильності. Насіння було пересаджене в теплицю, рослини були обприскані гербіцидом Liberty™, і була перевірена плодоносність їхніх квітів. 2.4. Випробування подій MS і RF на різному генетичному підґрунті і в різних місцях Відібрані події були введені у два протилежних одне одному генетичних підґрунтя з метою довести, що події MS і RF добре функціонують і не дають негативних наслідків на корисний вихід і якість продукції у будь-якому випробуваному підґрунті. 33 88861 34 Поряд з цим відібрані події MS і RF випробувостями. Ці події відбиралися як елітні MS і RF у валися в чотирьох-п'яти різних навколишніх умоWOSR і одержали найменування MS-BN1 і RFвах з метою переконатися у відсутності негативBN1 відповідно. ної взаємодії між ними і навколишнім Приклад 4. Визначення характеристик елітсередовищем. них подій MS-BN1 і RF-BN1 На наступній стадії були проведені більш поПісля того, як події MS-BN1 і RF-BN1 були ширені польові випробування продукування гібідентифіковані як елітні, в котрих експресія відпоридного насіння при використанні відібраних повідних трансгенів, а також загальні агрономічні дій MS і RF. Відібрана подія MS в її властивості були оптимальними, проводився деоригінальному підґрунті і в двох різних, протилетальний аналіз місця знаходження трансгенів на жних одне одному підґрунтях схрещувалася з молекулярному рівні. Ці дослідження включали у відібраною подією RF в оригінальному підґрунті себе детальний аналіз за методом Саузерностанньої і в двох різних, протилежних одне одблотінгу (при використанні численних ферментів ному підґрунтях. Гібрид F1 оцінювали на його рестрикції) і секвенування фланкувальних ділястійкість до гербіциду Liberty™, на плодоносність, нок трансгена. а також на загальні агрономічні властивості (ко4.1. Аналіз за методом Саузерн-блотінгу при рисний вихід і якість). використанні численних ферментів рестрикції 2.5. Селекція елітних подій У трансгенних і контрольних рослин була зіОписана вище процедура відбору в процесі брана листяна тканина. Із листяної тканини відвиведення трансгенних ліній MS дала в резульповідно до [Dellaporta et al. (1983, Plant Molecular таті декілька елітних подій, які продемонстрували Biology Reporter, 1, vol.3, p.19-21] була виділена оптимальну експресію трансгена, тобто стійкість повна геномна ДНК. Концентрація ДНК кожного до амонійглюфосинату, фенотип чоловічої степрепарату визначалася шляхом вимірювання рильності і сприйнятливість до повного відновоптичної густини на спектрофотометрі при довлення фертильності гомозиготною лінієюжині хвилі 260нм. відновлювачем і, зокрема, відібраною елітною Геномна ДНК у кількості 10мкг була перетраподією RF. влена ферментом рестрикції у кінцевому реакОписана вище процедура відбору в процесі ційному об'ємі 40мкл в умовах, зазначених вировиведення трансгенних ліній RF дала в результабником. Тривалість перетравлювання і/або ті декілька елітних подій, які продемонстрували кількість ферменту рестрикції встановлювали оптимальну експресію трансгена, тобто стійкість такими, щоб забезпечити повне перетравлення до амонійглюфосинату і здатність до відновлення зразків геномної ДНК без неспецифічної деграфертильності F1 при схрещуванні з рослиною, дації. Після перетравлення до перетравлених що несе ген чоловічої стерильності і, зокрема, з зразків ДНК добавили 4мкл завантажувального відібраною елітною подією MS. барвника, і все це помістили в 1% агарозний Приклад 3. Уведення елітних подійгель. кандидатів до відбору v WOSR У гель були поміщені також такі контрольні Декілька елітних подій MS і RF, виведених в ДНК: В. Napus, як описано вище, були введені шляхом - негативний контрольний зразок з геномною повторюваного зворотного схрещування рослин ДНК, приготованою із нетрансгенної рослини виду Drakkar у культивар WOSR. Були проведені Brassica; цей зразок використовувався для піддослідження цих рослин, які показали, що: твердження відсутності фонової гібридизації; a) наявність сторонньої ДНК не погіршує ін- позитивний контрольний зразок ДНК. При ших бажаних характеристик рослини, що стосуінтеграції гетерозиготної унікальної копії трансгеються агрономічних властивостей або комерційна в геном Brassica napus 10мкг геномної ДНК ної цінності; мали таку саму кількість еквівалентів молекули, b) досліджувана подія характеризувалася що й ±19 пкг 1501 bр фрагмента Pvul-Hindlll ДНК добре визначеною молекулярною конфігурацією, pTHW118 (розмір диплоїдного геному Brassica яка стабільно успадковувалася; napus: 0,8´109 bр). Кількість цього контрольного c) важливий ген (гени) в сторонній ДНК виказразка, яка відповідала копії однієї плазміди на зували правильну, відповідну і стабільну в просгеном, додавали до 1 мкг перетравленої нетрансторі і часі фенотипічну експресію як в гетерозигогенної ДНК Brassica napus. Одержаний в результних (або гемізиготних), так і в гомозиготних таті реконституційний зразок використовували умовах події на комерційно прийнятному рівні в для демонстрації того, що гібридизація проводидіапазоні навколишніх умов, у яких рослини, що лася в умовах, які дозволяли здійснювати гібринесуть дану подію, з очевидністю, будуть піддадизацію зонда з цільовими послідовностями. Як ватися звичайній агрономічній експлуатації. розмірний стандарт у зразок була включена лямКрім того, у досліджуваних рослин оцінювабда-ДНК фага (штам Clind 1 ts 857 Sam 7, Life лися агрономічні характеристики і властивості у Technologies), перетравлена фрагментом Pstl. порівнянні з видами WOSR дикого типу. Після електрофорезу зразки ДНК (перетравШирокі випробування в полі показали, що пеленої геномної ДНК Brassica, контрольні зразки і вні елітні події-кандидати весняного олієнасіннєрозмірний стандарт ДНК) були перенесені на вого рапсу, коли вони були введені у WOSR, данейлонну мембрану шляхом капілярного блотінгу вали рослини, котрі демонстрували адекватну протягом 12-16 годин. експресію важливих генів у сторонній ДНК у споТемплати ДНК, що використовувалися у прилученні з оптимальними агрономічними властиготуванні зонда для подій MS-BN1, були пригото 35 88861 36 вані шляхом рестрикційного перетравлювання ням до гібридизаційного розчину (6 ´ SSC (20 ´ PTW107 фрагментом Hindlll. У результаті цього SSC є 3,0 М NaCI, 0,3 М цитрату натрію, рН 7,0), звільнювався 3942 bр фрагмент ДНК, який охоп5 ´ розчин Денгардта (100 ´ розчин Денгардта = лював потрібну частину трансформувальної ДНК 2% фіколю (синтетичного середовища для фрак(частина PSSUARA, 3'nos, барназа, РТА29). ціонування клітин), 2% полівінілпіролідону, 2% Темплати ДНК, що використовувалися у приальбуміну бичачої сироватки), 0,5% додецилсуготуванні зонда для подій RF-BN1, були приготольфату натрію (SDS) і 20 мкг/мл денатурованого вані шляхом рестрикційного перетравлювання ДНК-носія (одноланцюгова ДНК риб'ячої сперми з PTW118 фрагментом НраІ. У результаті цього середньою довжиною 120-300 нуклеотидів). Гібзвільнювався 2182 bр фрагмент ДНК, який охопридизацію проводили протягом ночі при 65°С. лював потрібну частину трансформувальної ДНК Блоти тричі промивали протягом 30-40 хвилин (частина PSSUARA, 3'nos, барстар, РТА29). при 65°С мильним розчином (2 х SSC, 0,1% SDS). Після очищення фрагменти ДНК були поміАвторадіографічні знімки піддавали електронночені у стандартні способи і використовувалися му скануванню. для гібридизації на мембрану. 4.1.1. MS-BN1 Гібридизацію проводили у стандартних Рестрикційні карти, одержані після перетравумовах жорсткості: мічений зонд був денатуровалення геномної ДНК MS-BN1 різними ферментаний нагрівом протягом 5-10 хвилин у водяній бані ми рестрикції, подані на Фіг.2 і підсумовані в при температурі 95-100°С і охолодженням на Табл.3. льоду протягом 5-10 хвилин з наступним вливанТаблиця 3 Рестрикційна карта події MS-BN1 Номер доріжки Завантажена ДНК 1 MS-BN1 - EcoRI 2 MS-BN1 - EcoRV 4 MS-BN1- Hpal 5 MS-BN1 - AfIIII 6 MS-BN1 - Ndel 7 8 Нетрансгенна WOSR Контрольна плазмідна ДНК -BamHI Міграція фрагментів гібридизувальної ДНК між смугами розмірного маркера Більше, ніж Менше, ніж 2140 2450 14057 1159 1700 14057 1986 2140 2140 2450 2450 2838 2140 2450 514 805 5077 14057 5077 14057 1700 1986 2450 2838 Оцінювана довжина фрагментів гібридизаційної ДНК 2266 bp (*) >14 kbp 1.4kbp(*) >14 kbp 1990 bp 2229 bp 2477 bp (*) 2250 bp 552 bp (*) 10 kbp 6510 bp 1966 bp(*) 2607 bp (*) (*) Довжина цих фрагментів прогнозувалася на основі рестрикційної карти плазміди pTHW107. 4.1.2. RF-BN1 Рестрикційні карти, одержані після перетравлення геномної ДНК RF-BN1 різними фермента ми рестрикції, подані на Фіг.3 і підсумовані в Табл. 4. Таблиця 4 Рестрикціина карта події RF-BN1 Номер доріжки 1 2 Завантажена Міграція фрагментів гібридизувальної ДНК між Оцінювана довжина фрагментів ДНК смугами розмірного маркера гібридизаційної ДНК Більше, ніж Менше, ніж MS-BN1 805 1099 814 bр BamHI 1700 1986 1849 bр (*) 2450 2838 2607 bр (*) 5077 14057 6580 bр MS-BN1 805 1159 1094 bр EcoRI 1986 2450 2149 bр 5077 14057 7000 bр 5077 14057 10kbp 37 1 3 88861 2 MS-BN1 - EcoRV 3 5077 5077 1700 450 2450 1700 2450 5077 MS-BN1 - Hindlll 4 6 5 38 Продовження таблиці 4 Нетрансгенна WOSR Контрольна плазмідна ДНК BamHI 4 14057 14057 2140 2838 2838 1986 2838 14057 5 5.4 kbp 8kbp 1969 bр 2565 bр 2635 bр 1849 bр (*) 2607 bр (*) 8100 bр (*) Довжина цих фрагментів прогнозувалася на основі рестрикційної 4.2. Ідентифікація фланкувальних ділянок Фланкувальні ділянки елітних подій MS-BN1 і RF-BN1 спочатку ідентифікувалися на весінніх OSR, в яких виводилися ці події, а після цього перевірялися на WOSR. 4.2.1. Ідентифікація фланкувальних ділянок події MS-BN1 4.2.1.1. Права (5') фланкувальна ділянка Послідовність правограничної фланкувальної ділянки події MS-BN1 визначали за допомогою опосередкованої лігуванням полімеразноланцюгової реакції [Mueller et al. 1989, Science 780-786; Махіпе et al., 1994, PCR Methods and Applications, 71-75] із захопленням подовжувального сегмента [Tormanen et al., 1993, NAR 20:5487-5488]. Біотинільований праймер MDB247 Послідовність (5' ® 3') CCG.TCA.CCG.AGA.TCT.GAT.CTC.ACG.CG (SEQ ID No. 5) Далі лінкер лігували з першоланцюговою ДНК, котру потім зв'язували з магнітними кульками, з яких вимивали небіотинільований ланцюг. Лінкерний праймер MDB250 Т-ДНК праймер MDB251 Гніздовий лінкерний праймер MDB254 322¬347 Положення в pTHW107 ---293 ¬ 317 го гелю, і була проведена гніздова полімеразноланцюгова реакція при 100-кратному розрідженні цієї ДНК і використанні таких праймерів: Послідовність (5' ® 3') CTTAGCCTGGGTCAGGGCATG (SEQ ID No. 8) CTA.CGG.CAA.TGT.ACC.AGC.TG (SEQ ID No. 9) У результаті був одержаний фрагмент завдовжки приблизно 1000 bр, який елюювали з агарозного гелю, очистили і лігували з вектором Положення в pTHW107 Цю ДНК використовували у збільшеній PCRампліфікації при використанні таких праймерів: Послідовність (5' ® 3') GCACTGAGGGCCAAAGCTTGGCTC (SEQ ID No. 6) GGA.TCC.CCC.GAT.GAG.CTA.AGC.TAG.C (SEQ ID No.7) Полімеразно-ланцюгова реакція дала фрагмент завдовжки приблизно 1150 bр. Цей правограничний фрагмент був елюйований із агарозно Т-ДНК праймер MDB258 Для приготування лінкера використовувалися такі олігонуклеотиди: MDB248: (SEQ ID No. 3) 5'САТ.GСС.СТG.АСС.САG.GСТ.AAG.ТАТ.ТТ Т.AAС.ТТТ.ААС.САС.ТТТ.GСТ.ССG.АСА.GТС.СС А.ТТG MDB249: (SEQ ID No. 4) 5'CAA.TGG.GAC.TGT.CGG.AGG.ACT.GAG.G GC.CAA.AGC.TTG.GCT.CTT.AGC.CTG.GGT.CAG. GGC. ATG Після приготування лінкера здійснювали синтез першого ланцюга із перетравленої Ncol геномної ДНК події MS-BN1, використовуючи біотинільований ген-специфічний праймер: Положення в pTHW107 ---224 ¬ 243 pGem®-T. Рекомбінантну плазмідну ДНК відбирали за допомогою стандартної PCR-реакції з такими праймерами: 39 88861 40 Послідовність (5' ® 3') TAA.TAC.GAC.TCA.CTA.TAG.GGC.GA (SEQ ID No. 10) TTT.AGG.TGA.CAC.TAT.AGA.ATA.C (SEQ ID No. 11) primer gCT.TGG.ACT.ATA.ATA.CCT.GAC (SEQ ID No. 12) Положення в pTHW107 (SP6 промотор у векторі pGem®-T) (Т7 промотор у векторі pGem®-T) 143 ¬163 SP6 праймер Т7 primer Т-ДНК MDB201 У результаті були отримані такі фрагменти: SP6-T7: 1224 bр SP6-MDB201: 1068 bр T7-MDB201: 1044 bр Правограничний фрагмент очистили і піддали секвенуванню (SEQ ID No. 13), отримавши в результаті 963 bр, із яких основні пари 1-867 відповідали ДНК рослини, а основні пари від 868 до 953 відповідали Т-ДНК плазміди pTW107. 4.2.1.2. Ліва (5') фланкувальна ділянка події MS-BN1 Послідовність лівограничної фланкувальної ділянки вставленого трансгена в події MS-BN1 визначали за допомогою способу термальної асиметричної переплетеної PCR-реакції (TAILPCR), описаного в [Liu et al. (1995, The Plant Journal 8(3): 457-463]. У цьому способі викорис Вироджений праймер MDB611 Первинний TAIL MDB259 Вторинний TAIL MDB260 Третинний TAIL НСА24 товуються три гніздових специфічних праймери у послідовних реакціях разом з коротшим, довільно виродженим (AD: arbitrary degenerate) праймером таким чином, що забезпечується можливість теплового контролю відносних ефективностей ампліфікації специфічних і неспецифічних продуктів. Специфічні праймери відбирали для відпалювання до границі трансгена і базувалися на їхніх умовах відпалювання. Невелика кількість (5 мкл неочищених вторинного і третинного продуктів PCR-реакції аналізували в 1% агарозному гелі. Третинний продукт PCR-реакції використовували для препаративної ампліфікації, очищували і секвенували на автоматичному секвенаторі з використанням циклічного комплекту DyeDeoxy Terminator. Використовувалися такі праймери: Послідовність (5' ® 3') NgT.CgA.SWg.TNT.WCA.A (SEQ ID No. 14) gТg.Саg.ggА.АgС.ggТ.ТАА.СТg.g (SEQ ID No. 15) ССТ.ТТg.gАg.ТАА.АТg.gТg.ТТg.g (SEQ ID No. 16) gCg.AAT.gTA.TAT.TAT.Atg.CA (SEQ ID No. 17) Положення в pTHW107 ---7164®4186 4346®4366 4738®4757 де: N=A,C,T або g; S=C або g; W=A або T Ампліфікований за допомогою HCA24MDB611 фрагмент мав довжину приблизно 540 bр, із яких 537 bр були секвеновані (3'-кінець: SEQ ID No 18). Послідовність між парами 1 і 180 містила ДНК плазміди pTHW107, у той час як послідовність між парами 181 і 537 відповідала ДНК рослини. VDS51 HCA48 Послідовність (5' ®3') TgA.CAC.TTT.gAg.CCA.CTC.g (SEQ ID No. 19) GgA.ggg.TgT.TTT.Tgg.TTA.TC (SEQ ID No. 20) 4.2.1.3. Ідентифікація делеції цільового сайта За допомогою праймерів, що відповідали послідовностям на фланкувальних ділянках трансгена при використанні як темплату різновиду Drakkar Brassica napus дикого типу, був ідентифікований інсерційний сайт трансгена. Для цього використовувалися такі праймери: Положення на 5'-кінці (SEQ ID No 13) 733®751 Положення на 3'-кінці (SEQ ID No 18) --- --- 189¬208 У результаті був одержаний 178 bp фрагмент (SEQ ID No 21), в якому ділянка від 132 до 150 bр відповідала делеції цільового сайта. 4.2.1.4. Ідентифікація інсерційної ділянки події MS-BN1 1-822: 823-841 842-1198: 5'-фланкувальна ділянка делеція цільового сайта 3'-фланкувальна ділянка На основі ідентифікації фланкувальних ділянок і делеції цільового сайта можна було визначити інсерційну ділянку події MS-BN1 (SEQ ID No 22): bр 46-867 SEQ ID No 13 bр 132-150 SEQ ID No 21 bр 181 до 537 SEQ ID No 18 41 88861 4.2.2. Ідентифікація фланкувальних ділянок події RF-BN1 Граничні фланкувальні ділянки події RF-BN1 визначалися за методом маловекторної полімеразно-ланцюгової реакції [Use of Vectorette and Subvectorette PCR to isolate transgene flanking DNA (Застосування маловекторної і субмаловекторної PCR для виділення фланкувальної ДНК трансгена), Maxine J. Allen, Andrew Collick, and Маловекторний праймер MDB250 Маловекторний праймер MDB254 Т-ДНК праймер MDB251 Т-ДНК праймер MDB193 Т-ДНК праймер MDB258 Т-ДНК праймер MDB201 42 Alec J. Jeffreys PCR Methods and Applications 1994 (4) pages 71 - 75] з геномною ДНК події RFBN1 як темплатом, перетравленим фрагментом Hindlll. Маловекторний лінкер був одержаний за допомогою праймерів MDB248 (SEQ ID No. 3) і MDB249 (SEQ ID No. 4), описаних вище. 4.2.2.1. Права (5') фланкувальна ділянка події RF-BN1 Використовувалися такі праймери: Послідовність (5' ® 3') GCA.CTG.AGG.GCC.AAA.GCT.TGG.CTC (SEQ ID No. 6) CTT.AGC.CTG.GGT.CAG.GGC.ATG (SEQ ID No. 8) GGA.TCC.CCC.GAT.GAG.CTA.AGC.TAG.C (SEQ ID No. 7) CTA.CGG.CAA.TGT.ACC.AGC (SEQ ID No. 23) CTA.CGG.CAA.TGT.ACC.AGC.TG (SEQ ID No. 9) GCT.TGG.ACT.ATA.ATA.CCT.GAC (SEQ ID No. 12) Був одержаний 1077 bр фрагмент (SEQ ID No. 24), в якому ділянка 1-881 bp відповідала ДНК рослини, а ділянка 882-1077 bр відповідала ТДНК плазміди pTW118. 4.2.2.2. Ліва (3') фланкувальна ділянка події RF-BN1 ---293 ¬ 317 226 ¬243 224 ¬ 243 143 ¬163 (SEQ ID No.25) (SEQ ID No.26) (SEQ ID No.27) (SEQ ID No.28) для PCR-реакції при застосуванні таких праймерів: -праймер ДНК рослини MDB288 ATg.CAg.CAA.gAA.gCT.Tgg.Agg -Т-ДНК праймер MDB314 gTA.ggA.ggT.Tgg.gAA.gAC.C У результаті був одержаний фрагмент завдовжки приблизно 1500 bp (SEQ ID No. 30), в якому ділянка 1-166 bp відповідала Т-ДНК із плазміди pTW118, а ділянка 167-1441 bp відповідала ДНК рослини. 4.2.2.3. Молекулярний аналіз делеції цільового сайта --- Для ідентифікації фланкувальної ділянки (3') елітної події RF-BN1 була проведена TAIL PCRреакція, описана вище, із застосуванням довільно виродженого праймера і праймерів, розташованих у Т-ДНК поблизу лівої границі. Використовувалися такі праймери: - довільно вироджений праймер MDB286 NTg.CgA.SWg.ANA.WgA.A де: N=A,C,T або g; S=C або g; W=A або Т - Т-ДНК-праймери MDB314 gTA.ggA.ggT.Tgg.gAA.gAC.C MDB315 ggg.CTT.TCT.ACT.AgA.AAg.CTC.TCg.g MDB316 CCg.ATA.ggg.AAg.TgA.TgT.Agg.Agg Був одержаний фрагмент завдовжки приблизно 2000 bp. Цей фрагмент був клонованмй у векторі pGem®-T і використовувався як темплат Положення в pTHW118 (SEQ ID No. 29) (SEQ ID No. 26) Делеція цільового сайта була клонована за методом TAIL-PCR-реакції (описаним вище) при використанні специфічних праймерів геномної ДНК дикого типу і ДНК рослини у зворотному напрямку від вставки Т-ДНК, спрямованих у напрямку вставки: - довільно вироджений праймер: MDB286 NTg.CgA.SWg.ANA.WgA.A де: N=A,С,Т або g; S=C або g; W=A або Т - праймери ДНК рослини: MDB269 ggТТТТСggАggТССgАgАСg MDB283 СТТggАССССТАggТАААТgС MDB284 gТАСААААСТТggАССССТАgg (SEQ ID No. 25) (SEQ ID No.31) (SEQ ID No.32) (SEQ ID No. 33) 43 88861 44 Був одержаний фрагмент завдовжки 1068 bp практично подібною послідовності SEQ ID No. 13 (SEQ ID No. 34), в якому: (починаючи від нуклеотиду 98). 53-83: 5'-фланкувальна ділянка Ліва(3') фланкувальна послідовність події 84-133: делеція цільового сайта MS-BN1 рослин WOSR була визначена за допо134-1055: 3'-фланкувальна ділянка могою Т-ДНК-праймера (SEQ ID No. 17) і праймеПісля вставлення Т-ДНК був делетований ціра, розташованого у лівограничній ДНК рослини льовий сайт завдовжки 51 bр. Порівняння посліподії MS-BN1: довності локусу дикого типу з локусом Rf3 виявиНСА68: 5'-CCA.TAT.Acg.CCA.gAg.Agg.AC-3' ло наявність ДНК-філера на правому граничному (SEQ ID No. 37) з'єднанні. Послідовність-філер TCTCG на правій В результаті був одержаний фрагмент завдограниці закінчується триплетом ТСА на 5'-кінці і вжки 522 bp (SEQ ID No. 38) з послідовністю, триплетом CGA на 3'-кінці. Ці триплети виявляпрактично подібною послідовності SEQ ID No. 18. ються також у точці розриву делеції цільового Права (5') фланкувальна послідовність події сайта і Т-ДНК відповідно. Пошук у більш віддалеRF-BN1 рослин WOSR була визначена за допоних послідовностях рослин виявив можливе джемогою Т-ДНК-праймера (SEQ ID No. 12) і праймерело походження цієї ДНК-філера. Послідовність ра, розташованого у правограничній ДНК рослини TCA.TCTCG.CGA також розташована в ДНК росподії RF-BN1 (SEQ ID No. 31). В результаті був лини на 3'-кінці делеції цільового сайта. Це є сеодержаний фрагмент завдовжки 694 bp (SEQ ID рцевинна послідовність двох 13 bр ідентичних No. 39) з послідовністю, практично подібною поповторів, розміщених на 209 bр у прямому наслідовності SEQ ID No. 24 (від нуклеотиду 293 до прямку від точки розриву делеції цільового сайта. 980). Інсерційна ділянка для RF-BN1 може бути виЛівогранична послідовність події RF-BN1 розначена як така, що містить ліву фланкувальну слин WOSR була визначена за допомогою Тділянку, делецію цільового сайта і праву фланкуДНК-праймера (SEQ ID No. 26) і праймера, розвальну ділянку таким чином: ташованого у лівограничній ДНК рослини події 1-881: 5'-фланкувальна ділянка RF-BN1 (SEQ ID No. 29). В результаті був одер(bр 1-881 SEQ ID No.24) жаний фрагмент завдовжки 1450 bp, серед яких 882-932: делеція цільового сайта 1279 bp були секвеновані (SEQ ID No. 40). Ця (bр 84-133 SEQ ID No.34) послідовність виказувала практичну подібність 933-2207 3'-фланкувальна ділянка послідовності SEQ ID No. 30 (від нуклеотиду 141 (bр 167-1441 SEQ ID No.30) до 1421). 4.3. Генетичний аналіз локусу Таким чином, лівограничні і правограничні Генетична стабільність вставок для двох попослідовності елітних подій MS-BN1 і RF-BN1 дій перевірялася шляхом молекулярного і фенопідтвердили свою практичну подібність у рослин типічного аналізу в рослинах потомства кількох SOSR і WOSR. поколінь. Результати Саузерн-блот-аналізу росПриклад 5. Розробка діагностичних інструмелин поколінь То, Т1 і Т2 порівнювалися для обох нтів для контролю ідентичності подій - MS-BN1 і RF-BN1. Отримані картини виБули розроблені такі протоколи для ідентифіявилися ідентичними для кожної з цих подій у кації будь-якого рослинного матеріалу WOSR, що різних поколіннях. Це свідчить про те, що молемістить елітну подію MS-BN1. кулярна конфігурація трансгенів як в рослинах з 5.1. Протокол ідентифікації карт рестрикції подією MS-BN1, так і в рослинах з подією RF-BN1 елітних подій MS-BN1 і RF-BN1 була стабільною. Рослини WOSR з елітною подією MS-BN1, Події MS-BN1 і RF-BN1 виказували наявність можна ідентифікувати за допомогою аналізу за у них сегрегації Менделіана для їхніх відповідних методом Саузерн-блотінгу, використовуючи практрансгенів як унікальні генетичні локуси принайтично ту саму процедуру, що описана у Прикладі мні в трьох послідовних поколіннях, засвідчуючи 4.1. Отже, геномну ДНК WOSR 1) перетравлюють те, що вставки були стабільними. принаймні двома, а краще принаймні, ще краще На основі вищерозглянутих результатів події принаймні чотирма і найкраще - всіма такими MS-BN1 і RF-BN1 були ідентифіковані як елітні. ферментами рестрикції: EcoRI, EcoRV, Ndel, 4.4. Ідентифікація фланкувальних послідовHpal, Afllll, 2) переносять на нейлонові мембрани і ностей подій MS-BN1 і RF-BN1 у WOSR 3) гібридизують з 3942 bp фрагментом Hindlll Фланкувальні послідовності елітних подій плазміди pTHW107. Якщо стосовно принаймні MS-BN1 і RF-BN1 у WOSR визначали за допомодвох використовуваних ферментів рестрикції гою праймерів, виведених на основі фланкувальфрагменти ДНК ідентифікуються як такі, що маних послідовностей цих подій у весняному олієють однакову довжину з фрагментами, переліченасіннєвому рапсі. ними в Табл. 3 Прикладу 4.1.1, то рослина WOSR Права (5') фланкувальна послідовність події визначається як така, що містить елітну подію MS-BN1 рослин WOSR була визначена за допоMS-BN1. могою Т-ДНК-праймера (SEQ ID No. 12) і праймеРослини WOSR з елітною подією RF-BN1, ра, розташованого у правограничній ДНК рослини можна ідентифікувати за допомогою аналізу за події MS-BN1: методом Саузерн-блотінгу, використовуючи пракVDS57: 5'-gCATgATCT.gCT.Cgg.gAT.ggC-3' (SEQ ID тично ту саму процедуру, що описана у Прикладі No. 35) В результаті був одержаний фрагмент завдо4.1. Отже, геномну ДНК WOSR 1) перетравлюють вжки 909 bp (SEQ ID No. 36) з послідовністю, принаймні двома, краще принаймні трьома і най 45 88861 46 краще - всіма такими ферментами рестрикції: дса [Edwards et al. (Nucleic Acid Research, 19, BamHI, EcoRI, EcoRV, Hindlll, 2) переносять на p1349, 1991]. У разі використання ДНК, приготонейлонові мембрани і 3) гібридизують з 2182 bр ваної за іншими методами, випробування потрібфрагментом НраІ плазміди pTHW118. Якщо стоно проводити при інших кількостях темплату. совно принаймні двох використовуваних фермеЗвичайно найкращі результати дають 50нг генонтів рестрикції фрагменти ДНК ідентифікуються мної матричної ДНК. як такі, що мають однакову довжину з фрагмен5.2.2. Призначений позитивний і негативний тами, переліченими в Табл. 4 Прикладу 4,1.2, то контроль рослина WOSR визначається як така, що містить У процес полімеразно-ланцюгової реакції поелітну подію RF-BN1. винні бути включені позитивний і негативний кон5.2. Протокол ідентифікації за допомогою потроль. лімеразно-ланцюгової реакції елітних подій MS- Master Mix контроль (ДНК негативний контBN1 і RF-BN1 роль). Це є полімеразно-ланцюгова реакція, в яку Перед тим, як відбирати невідомий матеріал, не додається ДНК. Якщо в цьому випадку одерслід провести тестування з усіма відповідними жується очікуваний результат - відсутні продукти контрольними зразками. Поданий тут протокол PCR-реакції, то це означає, що PCR-суміш не може потребувати оптимізації по компонентах, які була забруднена цільовою ДНК. можуть змінюватися від лабораторії до лабора- ДНК позитивний контроль (відомий зразок торії (приготування матричної ДНК, Taq ДНК погеномної ДНК, що містить трансгенні послідовнолімераза, якість праймерів, dNTP, реакторний сті). Успішна ампліфікація цього позитивного контермоблок, тощо). тролю свідчить про те, що PCR-реакція проводиКлючову роль у протоколі відіграє ампліфікалася в умовах, що дозволяють ампліфікацію ція ендогенної послідовності. Потрібно встановцільових послідовностей. лювати такі умови полімеразно-ланцюгової реак- Контроль з ДНК дикого типу. Це є полімерації і термоциклування, щоб забезпечити зно-ланцюгова реакція, в котрій використовувана ампліфікацію еквімолярних кількостей як ендоматрична ДНК являє собою геномну ДНК, пригогенної, так і трансгенної послідовності у відомому товану із нетрансгенної рослини. Якщо в цьому трансгенному геномному ДНК-темплаті. В усіх випадку одержується очікуваний результат - відвипадках, коли цільовий ендогенний фрагмент не сутня ампліфікація трансгенного PCR-продукту, ампліфікується, або коли цільові послідовності не але наявна ампліфікація ендогенного PCRампліфікуються з однаковими інтенсивностями продукту, - то це означає, що в зразку геномної етидій-бромідного забарвлення, як на це вказує ДНК відсутня достатня для виявлення фонова електрофорез в агарозному гелі, може потребуампліфікація трансгена. ватися оптимізація умов полімеразно-ланцюгової 5.2.3. Праймери реакції. Використовувалися такі праймери, що спе5.2.1. Матрична ДНК цифічно розпізнають трансген і фланкувальну Матричну ДНК приготовляють із листяного послідовність події MS-BN1: пуншу або з однієї насінини за методикою ЕдварBNA01: (MDB201) BNA02: (VDS51) 5'-gСТ.Тgg.АСТ.АТА.АТА.ССТ.gАС-3' (ціль: трансген) 5'-ТgА.САС.ТТТ.gАg.ССА.СТС.g-3’ (ціль: ДНК рослини) Для ідентифікації рослинного матеріалу, що містить подію RF-BN1, використовувалися нижчеперелічені праймери, які специфічно розпізнаBNA03: (MDB193) BNA04: (MDB268) (SEQ ID 23) (SEQ ID 41) свідчить про те, що в препараті геномної ДНК для одержання цільового PCR-продукту є достатньо ДНК адекватної якості. При цьому використовуються такі ендогенні праймери: BNA05: 5'-AAC.gAg.TgT.CAg.СТА.gАС.САg.С-3' BNA06: 5'-СgС.АgТ.ТСТ.gТg.ААС.АТС.gАС.С-3’ 5.2.4. Ампліфіковані фрагменти Очікуваними ампліфікованими фрагментами у PCR-реакції є: (SEQ ID 19) ють трансген і фланкувальну послідовність події RF-BN1. 5'-TCA.TCT.ACg.gCA.ATg.TAC.CAg-3' (ціль: трансген) 5'-Тgg.АСС.ССТ.Аgg.ТАА.АТg.СС-3' (ціль: ДНК рослини) Праймери, націлені на ендогенну послідовність, завжди включаються в живильну PCRсуміш. Ці праймери служать як засоби внутрішнього контролю у невідомих зразках і для ДНК позитивного контролю. Позитивний результат, одержуваний з ендогенною праймерною парою, (SEQ ID 12) (SEQ ID 42) (SEQ ID 43) Для праймерної пари BNA05-BNA06: 394 bр (ендогенний контроль) 47 88861 Для праймерної пари BNA01-BNA02: 280 bр (елітна подія MS-BN1) Для праймерної пари BNA03-BNA04: 215 bр (елітна подія RF-BN1) 5.2.5. Умови PCR-реакції PCR-суміш для реакційного об'єму 50 мкл містить: 5 мкл матричної ДНК 5 мкл 10 х буфер для ампліфікації (що постачається разом з Taq полімеразою) 1 мкл 10mMdNTP 1 мкл BNA01 (MS-BN1) або BNA03 (RFBN1)(10 пмоль/ мкл) 1 мкл BNA02 (RF-BN1) або BNA04 (RF-BN1) (10 пмоль/ мкл) 0,5 мкл BNA05 (10 пмоль/ мкл) 0,5 мкл BNA06 (10 пмоль/ мкл) 0,2 мкл Taq ДНК полімерази (5 блоків/ мкл) вода до 50 мкл Для одержання оптимальних результатів потрібно дотримуватися такого профілю термоциклування: 4 хвилини при 95°С Далі: 1 хвилина при 95°С 1 хвилина при 57°С 2 хвилини при 72°С Протягом 5 циклів Далі: 30 секунд при 92°С 30 секунд при 57°С 1 хвилина при 72°С Протягом 22-25 циклів Далі: 5 хвилин при 72°С 5.2.6. Аналіз в агарозному гелі У 1,5% агарозний гель (трисборатний буфер) з маркером відповідної молекулярної маси (наприклад, сходовим маркером завдовжки 10 bp, PHARMACIA) поміщали PCR-зразки об'ємом від 10 до 20мкл. 5.2.7. Оцінка результатів Дані, одержані від зразків ДНК трансгенної рослини в одному PCR-експерименті з однією PCR-сумішшю, не можуть бути визнані задовільними, якщо 1) ДНК позитивний контроль показує очікувані PCR-продукти (трансгенні і ендогенні фрагменти), 2) ДНК негативний контроль дає негативний результат щодо PCR-ампліфікації (відсутність фрагментів) і 3) контроль з ДНК дикого типу показує очікуваний результат (ампліфікацію ендогенного фрагмента). Доріжки, на яких спостерігаються помітні кількості трансгенних і ендогенних PCR-продуктів очікуваних розмірів, свідчать про те, що відповідна рослина, з якої була приготована геномна матрична ДНК, успадкувала елітні події MS-BN1 і/або RF-BN1. Доріжки, на котрих не спостерігається помітних кількостей будь-якого з трансгенних PCR-продуктів, але які показують помітні кількості ендогенного PCR-продукту, вказують на те, що відповідна рослина, із якої була приготована дана геномна матрична ДНК, не містить елітної події. Доріжки, на котрих не спостерігається помітних кількостей ендогенних і трансгенних PCR-продуктів, вказують на те, що якість і/або кількість геномної ДНК не дозволяють генерувати PCR-продукт. Ці рослини до уваги не приймаються. Процес приготування геномної ДНК при цьому 48 повинний бути повторений, і потрібно буде провести новий PCR-експеримент з виконанням відповідного контролю. 5.2.8. Використання дискримінаційного PCRпротоколу для ідентифікації подій MS-BN1 і RFBN1 Листяний матеріал WOSR від рослин, що містили MS-BN1, RF-BN1 або іншу трансгенну подію, піддавався випробуванням за вищеописаним протоколом. Для негативного контролю використовувалися зразки від WOSR дикого типу. Результати PCR-аналізу ілюстровані на Фіг.4 і 5. На Фіг.4 показаний результат, одержаний згідно з протоколом PCR-ідентифікації елітних подій для MS-BN1 на двох зразках WOSR (доріжки 1 і 2). Доріжка 1 розпізнається як така, що містить елітну подію, оскільки на ній виявляється смуга 280 bр, у той час як зразок на доріжці 2 не містить події MS-BN1. На Фіг.5 показаний результат, одержаний згідно з протоколом PCR-ідентифікації елітних подій для RF-BN1 на двох зразках WOSR (доріжки 1 і 2). Доріжка 1 розпізнається як така, що містить елітну подію, оскільки на ній виявляється смуга 215 bр, у той час як зразок на доріжці 2 не містить події RF-BN1. Приклад 6. Продукування гібридного насіння за допомогою подій MS-BN1 і RF-BN1 у рослин WOSR Рослини WOSR чоловічої стерильності, що містили подію MS-BN1, схрещувалися з рослинами WOSR, гомозиготними з RF-BN1. Із MS-BN1 відбирали гібридне насіння і депонували його в АТСС під номером доступу РТА-730. Це гібридне насіння знов висівали в поле. Рослини з нього виказували 100% фертильність і демонстрували оптимальні агрономічні властивості. Одні з цих гібридних рослин містили як MSBN1, такі RF-BN1, а інші-лише RF-BN1. Приклад 7. Уведення подій MS-BN1 і RF-BN1 у кращі культивари WOSR Елітні події MS-BN1 і RF-BN1 були введені шляхом повторюваного зворотного схрещування рослин, що містили подію MS-BN1 або RF-BN1, відповідно, у численні, важливі із сільськогосподарської точки зору культивари WOSR. Спостерігалося, що інтрагресія елітних подій у ці культивари не чинить значного впливу на будь-які бажані фенотипи або агрономічні властивості цих культиварів (відсутність зумовленого зв'язуванням гальмування), у той час як експресія трансгена, як визначається толерантністю до глюфосинату, задовольняє комерційно прийнятним рівням. Це підтверджує елітний статус подій MS-BN1 і RF-BN1. У наведеній нижче Формулі винаходу термін «рослина», якщо не зазначено іншого, охоплює собою поняття рослинної тканини на будь-якій стадії зрілості, а також поняття насіння, тканини або органів, узятих або виведених із такої рослини, включаючи, без обмеження, будь-яке насіння, листя, стеблини, квіти, коріння, поодинокі клітини, гамети, клітинні культури, тканинні культури або протопласти. 49 88861 50 Насіння, що містило елітну подію MS-BN1 і BN1, було депоноване в Американську колекцію елітну подію RF-BN1 або тільки елітну подію RFтканинних культур під номером доступу РТА-730. 51 88861 52 53 88861 54 55 88861 56 57 88861 58 59 88861 60

Дивитися

Додаткова інформація

Назва патенту англійською

Hybrid winter oilseed rape and methods for producing thereof

Автори англійською

de Both Greta, de Beuckeleer Marc

Назва патенту російською

Гибридный озимый масличный рапс и способы его получения

Автори російською

де Бот Грета, де Бьокелер Марк

МПК / Мітки

МПК: A01H 5/10, C12N 15/82, C12Q 1/68

Мітки: гібридний, способи, одержання, озимий, олієнасіннєвий, рапс

Код посилання

<a href="https://ua.patents.su/45-88861-gibridnijj-ozimijj-oliehnasinnehvijj-raps-i-sposobi-jjogo-oderzhannya.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Гібридний озимий олієнасіннєвий рапс і способи його одержання</a>

Подібні патенти