Спосіб стабілізації мономерного білка – інтерферону

1. Спосіб одержання стабілізованого нерозбавленого розчину мономерного білка, яким є інтерферон, який включає стадії: a) підготування основної маси мономерного білка у буферному розчині; b) додавання до основної маси мономерного білка наповнювача, вибраного із групи, яку складають: і) бактеріостатичний препарат, іі) поверхнево-активна речовина, ііі) агент для регулювання ізотонічності, iv) амінокислота, v) антиоксидант, vi) агент для регулювання ізотонічності та антиоксидант, vii) агент для регулювання ізотонічності, антиоксидант та амінокислота, viii) амінокислота та антиоксидант, іх) амінокислота, антиоксидант та поверхневоактивна речовина, х) бактеріостатичний препарат та антиоксидант, та хі) бактеріостатичний препарат, антиоксидант та поверхнево-активна речовина, та c) інкубування згаданої основної маси мономерного білка при температурі в діапазоні від 27 °С до 31 °С. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що інтерфероном є бета-інтерферон. 3. Спосіб за п. 2, який відрізняється тим, що бета-інтерфероном є рекомбінантний людський бета-інтерферон. 4. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що бактеріостатичним препаратом є бензиловий спирт. 2 (19) 1 3 93349 4 23. Спосіб за п. 22, який відрізняється тим, що згаданий рН дорівнює 4,7. 24. Спосіб за будь-яким із попередніх пунктів, який відрізняється тим, що концентрація мономерного білка становить від 10 мкг/мл до 2000 мкг/мл. 25. Спосіб за будь-яким із попередніх пунктів, який відрізняється тим, що концентрація мономерного білка становить від 500 мкг/мл до 810 мкг/мл. 26. Спосіб за будь-яким із попередніх пунктів, який відрізняється тим, що концентрація буферу становить від 5 мМ до 500 мМ. 27. Спосіб за будь-яким із попередніх пунктів, який відрізняється тим, що концентрація буферу становить від 10 мМ до 50 мМ. 28. Спосіб за будь-яким із попередніх пунктів, який відрізняється тим, що концентрація згаданого агента для регулювання ізотонічності становить від 0,5 мг/мл до 500 мг/мл. 29. Спосіб за будь-яким із попередніх пунктів, який відрізняється тим, що концентрація згаданого агента для регулювання ізотонічності становить 55 мг/мл, або 150 мМ, або 300 мМ, або 600 мМ. 30. Спосіб за будь-яким із попередніх пунктів, який відрізняється тим, що концентрація згаданого твіну 20 становить від 0,01 мг/мл до 10 мг/мл. 31. Спосіб за будь-яким із попередніх пунктів, який відрізняється тим, що концентрація згаданого твіну 20 становить 0,5 мг/мл. 32. Спосіб за будь-яким із попередніх пунктів, який відрізняється тим, що концентрація згаданого антиоксиданта становить від 0,01 мг/мл до 5,0 мг/мл. 33. Спосіб за будь-яким із попередніх пунктів, який відрізняється тим, що концентрація згаданого антиоксиданта становить 0,12 мг/мл або 0,24 мг/мл. 34. Спосіб за будь-яким із попередніх пунктів, який відрізняється тим, що концентрація згаданої амінокислоти становить від 20 мг/мл до 200 мг/мл. 35. Спосіб за будь-яким із попередніх пунктів, який відрізняється тим, що концентрація згаданого лізину становить 27 мг/мл або 55 мг/мл, або 82 мг/мл, або 164 мг/мл. 36. Спосіб за будь-яким із попередніх пунктів, який відрізняється тим, що концентрація згаданого аргініну становить 32 мг/мл або 63 мг/мл. 37. Спосіб за будь-яким із попередніх пунктів, який відрізняється тим, що концентрація згаданого бактеріостатичного препарату становить від 0,01 мг/мл до 200 мг/мл. 38. Спосіб за будь-яким із попередніх пунктів, який відрізняється тим, що концентрація згаданого бактеріостатичного препарату становить 5 мг/мл або 10 мг/мл. 39. Спосіб підвищення та/або підтримання стабільності мономерного білка - інтерферону, який включає спосіб за будь-яким із пп. 1-38. Галузь, до якої належить винахід Цей винахід, взагалі, має відношення до способу одержання стабілізованого нерозбавленого розчину мономерного білка шляхом забезпечення наявності основної маси мономерного білка у буферному розчині і додання специфічного(-их) наповнювача(-ів) до нерозбавленого розчину. Передумови створення винаходу Інтерферони є цитокінами, тобто розчинними білками, які передають повідомлення між клітинами та відіграють суттєву роль в імунній системі шляхом надання допомоги при знищенні мікроорганізмів, які спричинюють інфекцію, і усунення будь-якого пошкодження, яке виникає унаслідок цього. Інтерферони природним шляхом секретуються інфікованими клітинами і вперше були ідентифіковані у 1957 році. Їхня назва є наслідком того, що вони "перешкоджають" процесам реплікації та продукування вірусів. Інтерферони демонструють як противірусну, так і антипроліферативну активність. На основі біохімічних та імунологічних властивостей природні людські інтерферони підрозділяють на три головні класи: альфаінтерферон (лейкоцитарний інтерферон), бетаінтерферон (фібробластний інтерферон) та гаммаінтерферон (імунний інтерферон). Зараз альфаінтерферон є схваленим у Сполучених Штатах та інших країнах для лікування волосатоклітинного лейкозу, гострокінцевих кондилом, саркоми Капоші (рак, який, як правило, уражає хворих, що страждають на синдром набутого імунодефіциту (СНІД)) та хронічного гепатиту ні-А, ні-В. На додаток до цього, інтерферони (IFNs) являють собою глікопротеїни, які продукуються організмом у відповідь на вірусну інфекцію. Вони пригнічують розмноження вірусів у захищених клітинах. Складаючись з білка низької молекулярної маси, інтерферони є вкрай неспецифічними за своєю дією, тобто інтерферон, індукований одним вірусом, є ефективним проти широкого діапазону інших вірусів. Інтерферони, однак, є видоспецифічними, тобто інтерферон, продукований одним видом, буде стимулювати антивірусну активність лише в клітинах того самого або близько спорідненого виду. Інтерферони були першою групою цитокінів, які почали застосовувати завдяки їхній потенційній протипухлинній та противірусній активності. Три основні інтерферони називають інтерфероном (-IFN), -інтерфероном (-IFN) та -інтерфероном (-IFN). Початково інтерферони були класифіковані на такі головні види відповідно до їх клітин походження (лейкоцит, фібробласт або Т-клітина). Виявилось, однак, що одна клітина може продукувати декілька типів. З цієї причини зараз лейкоцитарний інтерферон називають IFN, фібробластний інтерферон називають -IFN, а Т-клітинний інтерферон називають -IFN. Існує також інтерферон четвертого типу, лімфобластоїдний інтерферон, що продукується лінією клітин "Namalwa" (яка була одержана з лімфоми Бьоркіта), яка, як видається, продукує суміш як лейкоцитарних, так і фібробластних інтерферонів. 5 Показником активності інтерферону є одиниця інтерферону або міжнародна одиниця інтерферону (U (Од.) або IU (МОд.) для міжнародної одиниці), яка визначається як кількість, необхідна для захисту 50% клітин проти вірусного пошкодження. Аналізом, який може застосовуватись для визначення біологічної активності, є аналіз пригнічення цитопатичного ефекту, як описано (Рубінштейн (Rubinstein) та інші, 1981; Фамілетті П.К. (Familletti Р.С.) та інші, 1981). Кількість інтерферону у цьому антивірусному аналізі, необхідна для продукування 50% цитопатичного ефекту, дорівнює приблизно 1 Од/мл. Згадані одиниці визначаються відносно міжнародного контрольного еталону людського бета-інтерферону, який надається Національним Інститутом Здоров'я (National Institutes of Health) (Пестка (Pestka), 1986). Кожен клас інтерферонів містить декілька різних типів. Кожен з -IFN і -IFN є продуктом одного гена. Білки, які класифікуються як α-інтерферони, є найбільш різноманітною групою, що містить приблизно 15 типів. У 9 хромосомі знаходиться кластер генів -IFN, до складу якого входить щонайменше 23 члени, 15 членів з яких є активними і транскрибуються. Зрілі -інтерферони не глікозилюються. -інтерферони і -інтерферони мають однакову довжину (165 амінокислот або 166 амінокислот) і подібні біологічні активності. Довжина інтерферонів дорівнює 146 амінокислотам і вони є менш подібними до  і  класів. Лише -IFN можуть активувати макрофаги або індукувати визрівання Т-клітин-кілерів. Ці нові типи терапевтичних засобів подеколи називають модуляторами біологічної реакції (BRMs), оскільки вони впливають на реакцію організму на пухлину, виявляючи негативний вплив на розпізнавання через механізм імуномодуляції. Людський фібробластний інтерферон (-IFN) має антивірусну активність і може також стимулювати природні клітини-кілери проти пухлинних клітин. Це поліпептид масою приблизно 20000 Да, що індукується вірусами і двонитковими РНК. Повну амінокислотну послідовність цього білка розшифрували з нуклеотидної послідовності гена для фібробластного інтерферону, клонованого методами рекомбінантних ДНК (Деринк (Derynk) та інші). Його довжина становить 166 амінокислот. Шепард (Shepard) та інші, 1981, описав мутацію на основі 842 (CysTyr у положенні 141), яка ліквідує його антивірусну активність, і варіантний клон із делецією нуклеотидів 1119-1121. Марк (Mark) та інші, 1984, здійснив штучну мутацію шляхом заміни основи 469 (Т) на (А), унаслідок чого відбулась амінокислотна заміна CysSer у положенні 17. Повідомляли, що активність -IFN, який одержали, була такою самою, що і активність "нативного" -IFN і він мав таку саму стійкість впродовж тривалого зберігання (-70°С). Rebif (рекомбінантний -інтерферон фірми Serono), найостанніша розробка у галузі інтерферонотерапії розсіяного склерозу (MS), являє собою бета-інтерферон-1a, який продукується лініями клітин ссавців. Рекомендованою міжнародною 93349 6 непатентованою назвою (INN) цього інтерферону є "бета-інтерферон-1а". Як і з усіма фармацевтичними засобами на основі білків, однією з головних проблем, яку необхідно подолати у разі застосування бетаінтерферону як терапевтичного засобу, є втрата фармацевтичної придатності, що може бути наслідком його нестабільності у фармацевтичних композиціях. До числа фізичних нестабільностей, які загрожують активності та ефективності поліпептиду у фармацевтичних композиціях, належать денатурація і утворення розчинних і нерозчинних агрегатів, у той час як до числа хімічних нестабільностей належать гідроліз, утворення імідів, окиснення, рацемізація і деамідування. Відомо, що наслідком деяких із цих змін є втрата або зниження фармацевтичної активності білка, що становить інтерес. У інших випадках, точні ефекти цих змін є невідомими, однак, продукти розкладу, які одержують, як наслідок згаданих змін, все ж вважаються фармацевтично неприйнятними унаслідок можливості небажаних побічних ефектів. Стабілізація поліпептидів у фармацевтичних композиціях залишається галуззю, у якій спроби та помилки відіграють головну роль (оглядові статті Ванг (Wang) (1999) Int. J. Pharm. 185:129-188; Ванг (Wang), Хансон (Hanson) (1988) J. Parenteral Sci. Tech. 42:S3-S26). До числа наповнювачів, які додають до поліпептидних фармацевтичних композицій для підвищення їхньої стабільності, належать буфери, цукри, поверхнево-активні речовини, амінокислоти, поліетиленгліколі та полімери, однак стабілізувальні ефекти цих хімічних додатків змінюються у залежності від білка. У сучасних білкових композиціях вдаються до включення наповнювачів до складу кінцевих білкових препаратів. Ці композиції, однак, залишаються частково нестабільними. На додаток до цього, білки, які є біологічно активними як мономери, тобто мономерні білки, мають схильність до полімеризації і агрегування у разі напруження (наприклад, температурного напруження). Унаслідок цього, існує потреба у способі, який поліпшує розчинність білків і посилює стабілізацію мономерних білків, зокрема, проти агрегування і олігомеризації, з підвищенням, тим самим, ступеня їхньої фармацевтичної придатності. Суть винаходу Відповідно до першого аспекту, цей винахід пропонує спосіб одержання стабілізованого нерозбавленого розчину мономерного білка, який включає стадії: a) забезпечення наявності основної маси мономерного білка у буферному розчині, та b) додання наповнювача до згаданої основної маси, причому згаданий наповнювач вибираний із групи, яку складають: і) бактеріостатичний препарат, іі) поверхнево-активна речовина, ііі) агент для регулювання ізотонічності, iv) амінокислота, ν) антиоксидант, vi) агент для регулювання ізотонічності та антиоксидант, 7 vii) агент для регулювання ізотонічності, антиоксидант та амінокислота, viii) амінокислота та антиоксидант, іх) амінокислота, антиоксидант та поверхневоактивна речовина, х) бактеріостатичний препарат та антиоксидант, та хі) бактеріостатичний препарат, антиоксидант та поверхнево-активна речовина. На додаток до цього, нерозбавлений розчин білка може також інкубуватись при конкретній температурі перед або після здійснення способу відповідно до першого аспекту цього винаходу. Відповідно до другого аспекту, цей винахід пропонує нерозбавлений розчин, що містить основну масу білка, попередньо одержаний за способом відповідно до першого аспекту цього винаходу. Відповідно до третього аспекту, цей винахід пропонує спосіб підвищення та/або підтримання стабільності мономерного білка, який включає спосіб попереднього одержання нерозбавленого розчину, що містить основну масу білка, відповідно до першого аспекту цього винаходу. Опис фігур Фіг. 1 - Метод термічної дисоціації у невеликому лабораторному масштабі. Фіг. 1 має відношення до методу термічної дисоціації у невеликому лабораторному масштабі Прикладу 1а, пов'язаного із впливом температури та тривалості інкубування на стабілізацію нерозбавленого розчину інтерферону. Фіг. 1 відповідає Таблиці 4. Результати високоефективної рідинної витіснювальної хроматографії за розміром молекул (SE-HPLC) 0,9 мл зразків нерозбавленого розчину білка після чотирьох циклів заморожування/розморожування. На Фіг. 2 наведені результати термічної дисоціації у лабораторному масштабі при температурі 29°С після чотирьох циклів заморожування/розморожування за Прикладом 1b. На осі Υ представлено відсоток площини. На осі X представлені виявлені форми r-h-бета-IFN 1а, тобто агрегати, димери або мономери. Перший стовпчик кожної виявленої форми є контролем і відповідає попередньо одержаному нерозбавленому розчину, що містить основну масу білка, який розморожували при кімнатній температурі впродовж 2 год, після чого зберігали при температурі -4°С. Другий стовпчик кожної виявленої форми відповідає попередньо одержаному нерозбавленому розчину, що містить основну масу білка, який розморожували при кімнатній температурі впродовж 2 год, після чого інкубували при температурі 29°С впродовж 3 год. Третій стовпчик кожної виявленої форми відповідає попередньо одержаному нерозбавленому розчину, що містить основну масу білка, який розморожували при кімнатній температурі впродовж 2 год, після чого інкубували при температурі 29°С впродовж 15 год. Останній або четвертий стовпчик кожної виявленої форми відповідає попередньо одержаному нерозбавленому розчину, що містить основну масу білка, який розморожували на бані, після чого інкубували при темпера 93349 8 турі 29°С впродовж 15 год. Фіг. 2 відповідає Таблиці 11. Фіг. 3 - Результати високоефективної рідинної витіснювальної хроматографії за розміром молекул (SE-HPLC) 200 мл зразків нерозбавленого розчину білка після двох циклів заморожування/розморожування. На Фіг. 3 наведені результати термічної дисоціації у лабораторному масштабі при температурі 29°С після двох циклів заморожування/розморожування за Прикладом 1b. На осі Υ представлено відсоток площини. На осі X представлені виявлені форми r-h-бета-IFN 1а, тобто агрегати, димери або мономери. Перший стовпчик кожної виявленої форми є контролем і відповідає попередньо одержаному нерозбавленому розчину, що містить основну масу білка, який розморожували при кімнатній температурі впродовж 7 год, після чого зберігали при температурі -4°С. Другий стовпчик кожної виявленої форми відповідає попередньо одержаному нерозбавленому розчину, що містить основну масу білка, який розморожували при кімнатній температурі впродовж 7 год, після чого інкубували при температурі 29°С впродовж 15 год. Фіг. 3 відповідає Таблиці 12. Фіг. 4 - Кінетика термічної дисоціації у лабораторних масштабах після одного циклу заморожування/розморожування. Відсоток мономерів впродовж певного періоду часу. На Фіг. 4 показано відсоток мономерів r-hбета-IFN 1а впродовж певного періоду часу у разі інкубування при температурі 29°С після одного циклу заморожування/розморожування. На осі Υ показано відсоток площини. На осі X показано час у годинах. Результати Фіг. 4 наведені у Таблиці 14. Фіг. 5 - Кінетика термічної дисоціації у лабораторних масштабах після одного циклу заморожування/розморожування. Відсоток димерів впродовж певного періоду часу. На Фіг. 5 показано відсоток димерів r-h-бетаIFN 1а впродовж певного періоду часу у разі інкубування при температурі 29°С після одного циклу заморожування/розморожування. На осі Υ показано відсоток площини. На осі X показано час у годинах. Результати Фіг. 5 наведені у Таблиці 14. Фіг. 6 - Кінетика термічної дисоціації у лабораторних масштабах після одного циклу заморожування/розморожування. Відсоток агрегатів впродовж певного періоду часу. На Фіг. 6 показано відсоток агрегатів r-h-бетаIFN 1а впродовж певного періоду часу у разі інкубування при температурі 29°С після одного циклу заморожування/розморожування. На осі Υ показано відсоток площини. На осі X показано час у годинах. Результати Фіг. 6 наведені у Таблиці 14. Фіг. 7 - Схема дослідження попереднього одержання нерозбавленого розчину, що містить основну масу білка, для Прикладу 2. На Фіг. 7 зображена схема дослідження Прикладу 2, яке зосереджується на зведенні до мінімального рівня ступеня олігомеризації r-h-бета-IFN 1а на стадіях виготовлення від SEC-EL фракції до зберігання кінцевої лікарської форми (FDF) з метою забезпечення наявності стабілізованого не 9 розбавленого розчину бета-інтерферону. Згадана схема описується також у розділі 6.2 Прикладу 2. Фіг. 8 - Схема дослідження попереднього одержання нерозбавленого розчину, що містить основну масу білка, для Прикладу 3. На Фіг. 8 зображена схема дослідження Прикладу 3, яке спрямовувалось на зведення до мінімального рівня ступеня олігомеризації r-h-бета-IFN 1а, під час проведення якого застосовували два різні способи, ультрацентрифугування та SE-HPLC (високоефективна рідинна хроматографія), для визначення рівня мономерів r-h-бета-IFN 1а після стабілізації нерозбавленого розчину бетаінтерферону. Згадана схема описується також у розділі 6.1 та розділі 6.2 Прикладу 3. Докладний опис винаходу Цей винахід спрямовано на спосіб одержання стабілізованого нерозбавленого розчину мономерного білка, який включає стадії: a) забезпечення наявності основної маси мономерного білка у буферному розчині, та b) додання наповнювача до згаданої основної маси, причому згаданий наповнювач вибраний із групи, яку складають: і) бактеріостатичний препарат, іі) поверхнево-активна речовина, ііі) агент для регулювання ізотонічності, iv) амінокислота, ν) антиоксидант, vi) агент для регулювання ізотонічності та антиоксидант, vii) агент для регулювання ізотонічності, антиоксидант та амінокислота, viii) амінокислота та антиоксидант, іх) амінокислота, антиоксидант та поверхневоактивна речовина, х) бактеріостатичний препарат та антиоксидант, та хі) бактеріостатичний препарат, антиоксидант та поверхнево-активна речовина. Заявник фактично встановив, що у разі, коли стабілізацію здійснюють шляхом додання до нерозбавленого розчину білка одного або декількох наповнювачів, як докладно описано у цій заявці на патент, стабільність надається, розпочинаючи з моменту, коли один або декілька наповнювачів додаються до нерозбавленого розчину білка, і до кінцевого розміщення згаданого розчину, що містить білок, наприклад, до кінцевого приймання хворим. Таким чином, стабілізація, відбувається не лише на стадії зберігання, але і на різноманітних стадіях, на яких може опинитись білок впродовж строку його придатності до кінцевого розміщення, тобто перед, під час та після зберігання. Спосіб за цим винаходом, таким чином, є здатним до чинення протидії різним напруженням, яким може піддаватись білкова композиція впродовж строку її придатності. Стабілізація, таким чином, відбувається не лише впродовж виготовлення, але і у процесі транспортування, зберігання і доставки. Цей винахід включає також стабілізований нерозбавлений розчин білка, який одержують за способом за цим винаходом, який називають також попередньо одержаним нерозбавленим розчином, що містить основну масу білка. 93349 10 Термін "попередньо одержані нерозбавлені розчини, що містять основну масу білка", який вживають у цьому описі, означає композиції, що містять . основну масу мономерного білка. Стабільність, яка надається цим попередньо одержаним нерозбавленим розчинам, що містять основну масу білка, полягає не тільки у зниженні ступеня агрегування та олігомеризації, але включає також шкідливі процеси інших типів, наприклад, окиснення, деамідування тощо. Цей винахід, як такий, включає також процеси будь-яких інших типів доти, доки ці процеси мають вплив на стабільність мономерного білка. Словосполучення "впродовж зберігання" має відношення до лікарської форми або композиції, яку не вводять суб'єкту негайно після одержання. Після одержання її, скоріше, пакують для зберігання у рідкій формі або іншій формі, придатній для введення суб'єкту. Словосполучення "висушена форма" має відношення до лікарської форми або композиції, яку висушують шляхом сублімаційного, розпилювального або повітряного сушіння. Утворення агрегатів або олігомерів мономерним білком або будь-якими іншими складовими фармацевтичної композиції може негативно вплинути на біологічну активність мономерного білка, наслідком чого є втрата терапевтичної ефективності фармацевтичної композиції. На додаток до цього, утворення агрегатів або олігомерів може спричинити інші проблеми, наприклад, закупорення трубок, мембран або насосів, коли фармацевтичну композицію, що містить мономерний білок, вводять за допомогою системи для вливання. Термін "стабільність" означає відносну часову постійність активності білка, наприклад, противірусної активності та/або структури білка і має, в міру потреби, функціональне визначення. Термін "стабільність" означає також фізичну, хімічну і конформаційну стабільність попередньо одержаних нерозбавлених розчинів інтерферону за цим винаходом (включаючи зберігання біологічної активності). Нестабільність попередньо одержаних білкових розчинів може спричинюватись хімічним розкладом або агрегуванням білкових молекул з утворенням полімерів більш високого порядку, деглікозилуванням, модифікацією процесу глікозилування, окисненням або будь-якою іншою структурною модифікацією, яка зменшує щонайменше одну біологічну активність мономерного білка, яку включено до цього винаходу. "Стабільним" попередньо одержаним розчином є розчин, в якому ступінь розкладу, модифікації, агрегування, втрати біологічної активності тощо білків є задовільно контрольованою і не спричинює його неприйнятності впродовж певного періоду часу. Термін "стабілізований" означає мономерний білок або композицію, що містить мономерний білок, за цим винаходом, який (яка) демонструє підвищену стабільність або/та підтримує стабільність, відносно мономерних білків або композицій, що були одержані за відсутності наповнювача, як розкривається у цьому описі, який було додано до 11 основної маси мономерного білка або композиції, що містить мономерний білок. Термін "стабілізувати", який вживають у цьому описі, вживається взаємозамінно зі словосполученнями "зменшення або/та запобігання агрегуванню білків" та/або "зменшення та/або запобігання олігомеризації білків" та/або "зменшення та/або запобігання утворенню агрегатів" та/або "зменшення та/або запобігання полімеризації" та/або "зменшення та/або запобігання окисненню" та/або "зменшення та/або запобігання утворенню міцел(и)" та/або "зменшення та/або запобігання деамідуванню" та/або "зменшення та/або запобігання шкідливому ефекту процесу будь-якого роду на мономерний білок або композицію, що містить згаданий мономерний білок". Термін "мономер" або "мономерний" означає молекулу, що має лише один пептидний ланцюг. Терміни "нерозбавлений розчин білка" або "нерозбавлений розчин згаданого білка" або "нерозбавлений розчин мономерного білка" або "нерозбавлений розчин згаданого мономерного білка" означає у цьому описі стан білка або мономерного білка, який вже було піддано стадіям очищення у процесі виготовлення, але який, однак, ще не піддавали кінцевим стадіям одержання композиції, які надають можливість одержання "кінцевої лікарської форми" (FDF) або "фармацевтичної композиції" після завершувального пакування і розподілу для продажу. Таким чином, нерозбавлений розчин рекомбінантного білка вважається у цьому описі продуктом, який одержують після завершення процесу очищення, однак перед . тим як цей продукт піддають кінцевим стадіям одержання композиції. Іншими словами, спосіб за цим винаходом може розглядатись як такий, що включає стадію попереднього одержання нерозбавленого розчину, яка надає можливість попереднього одержання нерозбавленого розчину, що містить основну масу білка, який шляхом подальшого додання додаткових наповнювачів перетвориться на кінцеву лікарську форму або фармацевтичну композицію. Попередньо одержаний нерозбавлений розчин, що містить основну масу білка, або основну масу білка, не включену до складу розчину, зберігають перед одержанням кінцевої композиції, однак не обов'язково. У разі зберігання у замороженому стані нерозбавлений розчин білка, як правило розморожують, фільтрують, після чого піддають кінцевим стадіям одержання композиції, однак не обов'язково. Відповідно до конкретного варіанта здійснення цього винаходу, у тому разі коли білок являє собою рекомбінантний людський бета-інтерферон 1а (r-h-бета-IFN 1а), стабілізувальний наповнювач додають до елюату кінцевої стадії хроматографування, якою може бути, наприклад, витіснювальна хроматографія за розміром молекул (SEC), яку у цьому описі згадують як "SEC-EL" або "SEC-EL2", перед підданням стадії фільтрації або безпосередньо після стадії фільтрації (дивись Приклади). У цьому разі, витіснювальна хроматографія за розміром молекул (SEC) представляє кінцеву стадію процедури очищення. Відповідно до інших процедур очищення, на кінцевій стадії можуть застосо 93349 12 вуватись інші методи хроматографування чи відокремлення або можуть застосовуватись інші методи очищення, за якими методи відокремлення не застосовують як кінцеву стадію очищення; це жодною мірою не повинно обмежувати обсяг цього винаходу, як визначається терміном "нерозбавлений розчин білка". Доти, доки стабілізувальний наповнювач додають після процедури очищення, незалежно від того, яким(-и) може(-уть) бути метод(-и) очищення, це передбачається цим винаходом. На додаток до цього, стабілізувальні наповнювачі, згадані у цьому винаході, можуть також додатково додаватись до кінцевої композиції (кінцевої лікарської форми (FDF)). Таким чином, наповнювачі, які входять до складу кінцевої лікарської форми, можуть відповідати наповнювачам, які додавались до попередньо одержаного нерозбавленого розчину, що містить основну масу білка, однак не обов'язково. Термін "олігомерний білок" або "олігомер", що вживається у цьому описі, означає мультисубодиничний білок, що має два або декілька поліпептидних ланцюгів. Термін "олігомерний білок" подеколи означає білок, дві або декілька структурних одиниць якого є ідентичними поліпептидними ланцюгами. Розрізнюють олігомери щонайменше трьох типів: - швидкооборотні нековалентні невеликі олігомери (димер, тример, тетрамер і т.ін.); - необоротні нековалентні олігомери; - ковалентні олігомери (наприклад, дисульфіди). "Мультимерний білок" є описовим визначенням білка, що складається з декількох субодиниць. "Субодиниця" означає одну з ідентичних або неідентичних білкових молекул, які складають мультимерний білок. Термін "олігомеризація" означає хімічний процес одержання олігомерів із більших або менших молекул. Термін "олігомеризація" означає також процес перетворення мономеру або суміші мономерів на олігомер. Термін "олігомеризація" означає також одержання мультимерів окремих білкових молекул шляхом нековалентної або ковалентної взаємодії. Олігомеризація може бути оборотною або необоротною. Термін "полімеризація" описує хімічні реакції, які продукують полімери шляхом повторної комбінації мономерів з одержанням довгих чи великих молекул, або процес "перетворення мономеру або суміші мономерів на полімер. Термін "агрегація" означає утворення різновидів із більшою молекулярною масою, головним чином, шляхом нековалентного зчеплення різновидів меншої величини. Зокрема, щодо білків, агрегація являє собою форму денатурації, під час якої неполярні поверхні вторинних структур, наприклад, неполярні поверхні -спіралей і -листків, які, за нормальних умов, вступають у міжмолекулярні взаємодії і є схованими усередині білка, одержують можливість здійснення міжмолекулярних взаємодій і утворення мультимолекулярних форм, які іноді є нерозчинними. Терміни "нерозчинний", у протилежність "розчинному", іноді вживають, відповідно, як "необоротний", у протилеж 13 ність "оборотному". Агрегати можуть також визначатись як асоціації великих олігомерних білків (наприклад, більш ніж 10-членні). "Агрегати", у разі нековалентного зв'язку, можуть бути оборотними. Цей винахід- не повинен обмежуватись визначеннями "агрегація", "агрегат(-и)", "олігомер(-и)", "мультимер(-и)", "олігомеризація", "мультимеризація", "мультимерний", "олігомерний", "полімеризація", якими б не були згадані визначення. Таким чином, обсяг цього винаходу не повинен обмежуватись цими термінами або будь-якою теорію, пов'язаною з ними. Важливим моментом є те, що "агрегати" і "олігомери" можуть відрізнятись один від одного за допомогою способів виявлення (наприклад, SE-HPLC (високоефективна рідинна витіснювальна хроматографія за розміром молекул)), як правило, відокремленими, чітко розрізнюваними сигналами, наприклад, відокремленими піками; кожен пік відповідає агрегатам або олігомерам. Таким самим чином, мономерній формі білка відповідає точний специфічний визначений пік. Термін "буфер" або "фізіологічно прийнятний буфер" означає розчини сполук, які, як відомо, є безпечними для фармацевтичного або ветеринарного застосування у композиціях і які мають здатність до підтримання або контролювання рН композиції у діапазоні рН, бажаному для згаданої композиції. Прийнятними буферами для контролювання рН у межах від помірно кислого рН до помірно лужного рН є (але без обмеження) такі сполуки, як фосфат, ацетат, цитрат, аргінін, трис і гістидин. "Трис" означає 2-аміно-2-гідроксиметил1,3-пропандіол та будь-яку його фармацевтично прийнятну сіль. Буферами, яким віддають перевагу, є ацетатні буфери у фізіологічному розчині або прийнятна сіль. "Агентом для регулювання ізотонічності" є сполука, яка є фізіологічно прийнятною і яка забезпечує відповідну ізотонічність композиції для запобігання чистого потоку води через клітинні мембрани, які контактують зі згаданою композицією. З подібними цілями традиційно застосовують такі сполуки, як гліцерин, із відомими концентраціями. Іншими прийнятними агентами для регулювання ізотонічності є (але без обмеження) амінокислоти або білки (наприклад, гліцин або альбумін), солі (наприклад, хлорид натрію) і цукри (наприклад, декстроза, маніт, цукроза і лактоза). Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, агентом для регулювання ізотонічності є маніт. Термін "антиоксидант" означає сполуку, яка запобігає взаємодії кисню або вільних радикалів кисню з іншими речовинами. Антиоксиданти входять до числа наповнювачів, які традиційно додають до фармацевтичних систем для підвищення фізичної та хімічної стабільності. Антиоксиданти додають для зведення до мінімального рівня або уповільнення процесів окиснення, які відбуваються з деякими лікарськими засобами або наповнювачами у разі піддання їх дії кисню або у присутності вільних радикалів. Ці процеси можуть часто каталізуватись світлом, температурою, підвищенням концентрації водню, присутністю мікроелементів або пероксидів. Сульфіти, бісульфіти, тіосечовину, метіонін, солі етилендіамінтетраоцтової кислоти 93349 14 (EDTA), бутильований гідрокситолуол (ВНТ) та бутильований гідроксіанізол (ВНА) часто - застосовують як антиоксиданти у лікарських засобах. Було встановлено, що натрій-EDTA підсилює активність антиоксидантів шляхом утворення хелатних комплексів з іонами металів, які, у противному разі, каталізували б реакцію окиснення. Антиоксидантом, якому віддають найбільшу перевагу, є метіонін. Антиоксиданти у цьому описі називають також стабілізаторами. Метіонін може бути присутнім у формі вільної основи або у сольовій формі. Будь-який стереоізомер (тобто L, D або DL ізомер) метіоніну може застосовуватись за цим способом або у цій композиції за цим винаходом доти, доки метіонін присутній у формі вільної основи або у сольовій формі. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, застосовують L-стереоізомер. У композиції за цим винаходом можуть також застосовуватись аналоги метіоніну. Термін "аналог метіоніну" означає похідну природного метіоніну. Аналоги метіоніну можуть також застосовуватись у композиції за цим винаходом у формі вільної основи або у сольовій формі. Підвищення та/або підтримка стабільності у разі додання антиоксидантів (наприклад, метіоніну) відбувається залежним від концентрації чином. Тобто наслідком підвищення концентрації антиоксидантів є підвищення та/або підтримка стабільності композиції, що містить бета-інтерферон, за цим винаходом, у разі, коли ця композиція, що містить бета-інтерферон, як правило, демонструє окиснення або агрегування/утворення олігомерів за відсутності антиоксиданта. Визначення кількості антиоксиданта (наприклад, метіоніну), яка повинна застосовуватись у композиції за цим винаходом для зниження окиснення або утворення олігомерів/агрегатів, може легко здійснюватись без зайвого експериментування за допомогою способів, відомих, як правило, фахівцю у цій галузі. Термін "бактеріостатик" означає сполуку або композиції, які додають до лікарської форми для відігравання ролі антибактеріального засобу. Консервовані лікарські форми, що містять інтерферон, за цим винаходом, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, відповідають передбаченим законом або інструктивним критеріям щодо ефективності консерванта такою мірою, щоб бути комерційно придатним універсальним продуктом. Прикладами бактеріостатиків є фенол, м-крезол, n-крезол, о-крезол, хлоркрезол, бензиловий спирт, алкілпарабен (метил, етил, пропіл, бутил тощо), хлорид бензалконію, хлорид бензетонію, дигідроацетат натрію та тимеросал. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, бактеріостатичним засобом є бензиловий спирт. Бензиловий спирт у цьому описі називають також стабілізатором. Термін "поверхнево-активна речовина" означає розчинну сполуку, яка знижує поверхневий натяг рідин або зменшує міжфазний натяг між двома рідинами або між рідиною і твердою речовиною, де поверхневий натяг являє собою силу, яка діє на поверхню рідини, намагаючись звести до мінімального рівня площу поверхні. Подеколи поверхнево-активні речовини застосовують у фа 15 рмацевтичних композиціях, у тому числі для доставки лікарських засобів і поліпептидів низької молекулярної маси, для модифікування абсорбції лікарського засобу або його доставки до тканинмішеней. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, поверхнево-активною речовиною є Твін 20 або полоксамер. Відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, поверхнево-активною речовиною є Poloxamer 188. Відповідно до варіанта, якому віддається ще більша перевага, поверхнево-активною речовиною є Твін 20 (Tween 20). Термін "амінокислота" означає амінокислоту або комбінацію амінокислот, де будь-яка дана амінокислота є присутньою у формі вільної основи або у формі солі. У разі застосування комбінації амінокислот, усі амінокислоти можуть бути присутніми у формі вільних основ, усі можуть бути присутніми у формі солей або деякі можуть бути присутніми у формі вільних основ, у той час як інші присутні у формі солей. Амінокислотами для застосування за цим способом або у композиції за цим винаходом, яким віддають перевагу, є амінокислоти, що несуть заряджений бічний ланцюг, наприклад, аргінін, лізин, аспарагінова кислота і глутамінова кислота. Відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага,згаданими амінокислотами є лізин і аргінін. Відповідно до варіанта, якому віддається ще більша перевага, згаданою амінокислотою є лізин. Будь-який стереоізомер (тобто L, D або DL ізомер) конкретної амінокислоти або комбінації цих стереоізомерів, може застосовуватись за цим способом або у комбінації за цим винаходом доти, доки згадана конкретна амінокислота присутня у формі вільної основи або у формі солі. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, застосовують L-стереоізомер. За цим способом або у комбінації за цим винаходом можуть також застосовуватись аналоги цих амінокислот, яким віддається перевага. Термін "аналог амінокислоти" означає похідну природної амінокислоти. Відповідні аналоги аргініну включають, наприклад, аміногуанідин і N-моноетил-L-аргінін. Як і у разі амінокислот, яким віддається перевага, аналоги амінокислот застосовують за цим способом або у композиції у формі вільної основи або у формі солі. Амінокислоти у цьому описі називають також стабілізаторами. Амінокислота(-и), яку (які) застосовують за цим способом або у композиції за цим винаходом, захищає(-ють) терапевтично активний поліпептид проти різних напружень із забезпеченням, тим самим, підвищення або/та підтримки стабільності мономерного білка або комбінації, що містить мономерний білок, впродовж строку придатності згаданого мономерного білка (перед, під час або після зберігання). Термін "напруження" у цьому описі включає (але без обмеження) нагрівання, заморожування, рН, світло, збовтування (перемішування), окиснення, дегідратацію, поверхневий натяг, зсувне зусилля, заморожування/розморожування, тиск, важкі метали, сполуки фенолу, денатурувальні речовини тощо. Термін "напруження" включає будь-який фактор, який модулює (тобто зменшує, підтримує або підвищує) стабільність (мономерного) білка або композиції, що містить (мономерний) 93349 16 білок. Підвищення та/або підтримання стабільності у разі додання амінокислоти відбувається залежним від концентрації чином, тобто наслідком підвищення концентрації амінокислоти є підвищення та/або підтримання стабільності мономерного білка або композиції, що містить мономерний білок за цим винаходом, коли цей мономерний білок або композиція, що містить цей мономерний білок, за нормальних умов демонструє утворення агрегатів або олiгомерів за відсутності амінокислоти. Визначення кількості конкретної амінокислоти для застосування за цим способом або у композиції за цим винаходом для зниження ступеня утворення олігомерів або агрегатів і, тим самим, підвищення стабільності мономерного білка, а, тим самим, підвищення стабільності композиції впродовж усього строку придатності згаданого мономерного білка, може легко здійснюватись для будь-якого конкретного мономерного білка, який становить інтерес, без зайвого експериментування за допомогою способів, як правило, відомих фахівцю у цій галузі. Словосполучення "низькотемпературне зберігання" означає заморожування і зберігання попередньо водного препарату мономерного білка при температурі нижче 0°С, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, при температурі -20°С або нижче, відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, при температурі -70°С. Словосполучення "цикли заморожування/розморожування" або "операції заморожування/розморожування" означають відомі способи низькотемпературного зберігання зразків білків, при яких температура зразка підвищується до рівня, який забезпечує відновлення рідкого стану зразка впродовж періоду часу, тривалість якого є достатньою для можливості застосування системи Rampie, з подальшим заморожуванням до температури нижче 0°С і поверненням до умов низькотемпературного зберігання, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, при температурі 20°С або нижче, відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, при температурі 70°С. Метою цього винаходу є протидія принаймні процесам агрегування і олігомеризації (цей винахід не обмежується цими процесами) не лише мономерного білка, але також і інших агентів, інгредієнтів або сполук, які також додаються до нерозбавленого розчину білка за цим винаходом. Таким чином, цей винахід є спроможним надати стабільності (наприклад, шляхом зменшення та/або пригнічення утворення олігомерів, а також агрегатів) усім сполукам, агентам (наприклад, бактеріостатичним препаратам, агентам для регулювання ізотонічності), білкам, поверхнево-активним речовинам, наповнювачам, які додаються до згаданого нерозбавленого розчину за цим винаходом і які будуть включені до кінцевої лікарської форми або фармацевтичної композиції, що містить білок, який становить інтерес. Іншими словами, стабілізація надається не лише (мономерному) білку, але також композиції, що містить (мономерний) білок, "у цілому". Агрегація може не лише погіршити біологічну активність, але також викликати реакції на 17 місці ін'єкції та імуногенність унаслідок розвитку нейтралізувальних антитіл (NAbs). Наведені приклади чітко показують, що додання конкретних наповнювачів до нерозбавленого розчину, що містить основну масу мономерного білка, може значно підвищити стабільність і розчинність згаданого нерозбавленого розчину, що містить мономерний білок, шляхом запобігання та/або пригнічення утворення поліпептидних агрегатів або олігомерів під час низькотемпературного зберігання або/та повторних циклів заморожування/розморожування. На додаток до цього, цей винахід показує, що термічна дисоціація є ефективною відносно надання стабільності (мономерному) білку або композиції, що містить (мономерний) білок. Термін "термічна дисоціація", який вживають у цьому описі, означає процес, за допомогою якого білки, які знаходяться у формі мультимерів, перетворюються або дисоціюють до відновленої мультимерної форми або до мономерної форми під дією температури (наприклад, димери білка перетворюються на мономери у разі піддання впливу конкретної температури). Білок у композиції присутній у численних мультимерних формах (димерній, тримерній тощо). Термічна дисоціація є, таким чином, ефективною щодо перетворення або дисоціації усіх мультимерних форм до відновлених мультимерних форм або мономерних форм. Цей винахід демонструє існування взаємозв'язку між температурою і дисоціацією мультимерів. Композиція, у разі піддання термічній дисоціації, буде містити менше мультимерних форм і більше мономерних форм, порівняно з композицією, яку не піддавали термічній дисоціації. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, термічна дисоціація перетворює усі мультимерні форми на мономерні форми. Температура може негайно виставлятись на фіксований рівень або повільно підвищуватись до досягнення конкретного рівня. На додаток до цього, цей винахід демонструє, що тривалість термічної дисоціації є ефективною щодо стабілізації (мономерного) білка або композиції, що містить (мономерний) білок. Цей винахід демонструє існування взаємозв'язку між тривалістю термічної дисоціації та дисоціацією мономерних ланцюгів полімеру. Приклади показують, що термічна дисоціація є вкрай ефективною впродовж перших годин термічної дисоціації до досягнення певної точки, де тривалість стає неефективною. Термічна дисоціація є специфічною щодо білків. Встановлення відповідних параметрів, наприклад, температури і тривалості, для конкретного білка для досягнення оптимального рівня термічної дисоціації, може легко здійснюватись фахівцем у цій галузі із застосуванням традиційних способів. Фахівцю у цій галузі є відомими численні аналітичні методи визначення продуктів розкладу, наприклад, агрегування, окиснення, деамідування, розщеплення, поверхнева адсорбція, поверхнева денатурація, утворення циклічних імідів, укорочення тощо. До методів визначення стабільності належать (але ними не обмежуються) високоефективна рідинна хроматографія (HPLC), витіснювальна хроматографія за розміром молекул (SEC) (з або 93349 18 без денатуруючих речовин, наприклад, SDS (додецилсульфат натрію), хлориду гуанідію або органічного розчинника у зразку або у рухомій фазі), високоефективна рідинна хроматографія з оберненою фазою (RP HPLС), високоефективна рідинна іонообмінна хроматографія, електрофорез, гідрофобна хроматографія (НІС), афінна хроматографія, електрофорез у поліакриламідному гелі у присутності додецилсульфату натрію (SDS-PAGE), відновлення дисульфідів за допомогою відновника(-ів), нативний гель-електрофорез, капілярний електрофорез, аналітичне ультрацентрифугування, розсіяння світла, аналіз помутніння та аналіз концентрації білка. Дослідження структури і стабільності може здійснюватись за допомогою кругового дихроїзму, флуоресценції (зв'язування внутрішнього та гідрофобного зонда), ультрафіолетового випромінювання, FTIR (інфрачервоної мікроскопії з перетворенням Фур'є) та/або диференційної сканувальної калориметрії. Таким чином, ефект конкретного наповнювача на агрегацію або олігомеризацію мономерного білка може бути визначеним, наприклад, за зміною вмісту розчинного мономерного білка у розчині впродовж певного періоду часу. При проведенні витіснювальної хроматографії за розміром молекул (SEC), відомої також як гельфільтрація або хроматографія на молекулярних ситах, застосовують колонки з пористою матрицею, яка затримує молекули, менші за розміром, аніж розмір пор, у той час як більші молекули видаляються і елююються раніше. У більшості випадків застосовують ізократичний градієнт. Нижче буде наведено опис різних аспектів цього винаходу. Відповідно до першого аспекту, цей винахід пропонує спосіб одержання стабілізованого нерозбавленого розчину мономерного білка, який включає стадії: a) забезпечення наявності основної маси мономерного білка у буферному розчині, та b) додання наповнювача до згаданої основної маси, причому згаданий наповнювач вибраний із групи, яку складають: і) бактеріостатичний препарат, іі) поверхнево-активна речовина, iii) агент для регулювання ізотонічності, iv) амінокислота, ν) антиоксидант, vi) агент для регулювання ізотонічності та антиоксидант, vii) агент для регулювання ізотонічності, антиоксидант та амінокислота, viii) амінокислота та антиоксидант, іх) амінокислота, антиоксидант та поверхневоактивна речовина, х) бактеріостатичний препарат та антиоксидант, та хі) бактеріостатичний препарат, антиоксидант та поверхнево-активна речовина. Наповнювач(-і) або їх комбінації можуть додатково додаватись до кінцевої лікарської форми (FDF), а не лише до нерозбавленого розчину мономерного білка. Іншими словами, наповнювачі можуть додаватись на різних стадіях одержання 19 нерозбавленого розчину мономерного білка, а також на кінцевих стадіях технологічного процесу одержання композиції, але щонайменше один раз до нерозбавленого розчину мономерного білка. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, згаданим мономерним білком є інтерферон. Відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, згаданим інтерфероном є бетаінтерферон. Відповідно до варіанта, якому віддається ще більша перевага, згаданим бетаінтерфероном є людський рекомбінантний бетаінтерферон. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, білок стабілізують проти агрегування або олігомеризації. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, бактеріостатичним препаратом є бензиловий спирт, поверхнево-активною речовиною є твін 20, агентом для регулювання ізотонічності є маніт, амінокислота вибрана із групи, яку складають лізин або аргінін, і антиоксидантом є метіонін. Комбінаціями наповнювачів, яким віддається перевага, є такі: 1) агентом для регулювання ізотонічності є маніт, антиоксидантом є метіонін; 2) агентом для регулювання ізотонічності є маніт, антиоксидантом є метіонін і амінокислотою є лізин; 3) амінокислотою є лізин, антиоксидантом є метіонін; 4) амінокислотою є лізин, антиоксидантом є метіонін і поверхнево-активною речовиною є твін 20; 5) бактеріостатичним препаратом є бензиловий спирт, антиоксидантом є метіонін, або 6) бактеріостатичним препаратом є бензиловий спирт, антиоксидантом є метіонін і поверхнево-активною речовиною є твін 20. На додаток до цього, нерозбавлений розчин білка може інкубуватись при конкретних температурах для сприяння термічній дисоціації нерозбавленого розчину мономерного білка. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, температурний діапазон знаходиться у межах від 27°С до ЗГС. Відповідно до варіанта, якому віддається найбільша перевага, температуру встановлюють на рівні 29°С. За альтернативним варіантом, температуру поступово підвищують до досягнення рівня конкретних вищезгаданих температур. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, інкубування здійснюють впродовж щонайменше 3 год або у діапазоні від 6 год до 40 год. Відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, інкубування здійснюють у межах від 15 год до 30 год або впродовж 10 год, 16 год, 18,5 год чи 24 год. Відповідно до варіанта, якому віддається ще більша перевага, інкубування здійснюють впродовж 24 год. Інкубування може здійснюватись (але без обмеження) перед або після стадії попереднього одержання нерозбавленого розчину, що містить основну масу білка, відповідно до першого аспекту цього винаходу. Мономерний білок, стабілізований відповідно до першого аспекту цього винаходу, може інкубуватись на будь-якій стадії 93349 20 технологічного процесу, тобто також на кінцевих стадіях одержання композиції. Відповідно до другого аспекту, цей винахід пропонує нерозбавлений розчин, що містить основну масу білка, попередньо одержаний за способом відповідно до першого аспекту цього винаходу. Відповідно до третього аспекту, цей винахід пропонує спосіб підвищення та/або підтримання стабільності мономерного білка, що включає спосіб попереднього одержання нерозбавленого розчину білка відповідно до першого аспекту цього винаходу. Нижче буде наведено опис варіанта здійснення цього винаходу, якому віддають перевагу, із застосуванням мономерного білка, інтерферону, відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, бета-інтерферону. Термін "інтерферон" або "IFN", який вживають у цьому описі, означає будь-яку молекулу, визначену як таку у літературі, і включає, наприклад, інтерферони будь-яких типів, що згадуються у вищенаведеному розділі "Передумови створення винаходу". Зокрема, вищенаведене визначення включає -IFN, -IFN та -IFN. За цим винаходом, -IFN є інтерфероном, якому віддається перевага. Відповідний -IFN за цим винаходом є комерційно доступним, наприклад, як Rebif® (фірма Serono), Avonex® (фірма Biogen) або Betaferon (фірма Schering). За цим винаходом перевага віддається також застосуванню інтерферонів людського походження. Термін "інтерферон", який вживають у цьому винаході, включає його солі, функціональні похідні, варіанти, аналоги і активні фрагменти. Термін "бета-інтерферон (бета-IFN або IFN)", який вживають у цьому описі, включає фібробластний інтерферон, зокрема, людського походження, який одержують шляхом виділення з біологічних рідин або методами" рекомбінантних ДНК із прокаріотних або еукаріотних клітин-хазяїв, а також його солі, функціональні похідні, варіанти, аналоги і активні фрагменти. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, бета-IFN означає бета-інтерферон 1а. Термін "мутеїни", який застосовується у цьому описі, означає аналоги інтерферону, у яких один або декілька амінокислотних залишків природного інтерферону замінюють на різні амінокислотні залишки або їх піддають делеції чи один або декілька амінокислотних залишків додають до природної послідовності інтерферону без значної зміни активності одержаних продуктів, порівняно з інтерфероном дикого типу. Ці мутеїни одержують відомими методами синтезу та/або способами сайтспрямованого мутагенезу чи будь-яким іншим відомим, придатним у цьому разі способом. До мутеїнів, яким віддається перевага, належать, наприклад, мутеїни, опис яких наведено Шепард (Shepard) та інші (1981) або Марк (Mark) та інші (1984). Будь-який з таких мутеїнів, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, має послідовність амінокислот, яка дублює амінокислотну послідовність інтерферону достатньою мірою для того, щоб мати активність, по суті подібну або на 21 віть кращу за активність інтерферону. Біологічна функція інтерферону є добре відомою фахівцю у цій галузі і біологічні стандарти є встановленими і доступними, наприклад, від Національного Інституту Біологічних Стандартів та Контролю (National Institute for Biological Standards and Control) (http://immunology.org/links/NIBSC). Існує описання біологічних аналізів для визначення активності інтерферону. Аналіз інтерферону може здійснюватись так, наприклад, як описано Рубінштейном (Rubinstein) та іншими (1981). Таким чином, шляхом звичайного експериментування можна визначити, чи має будь-який даний мутеїн активність, по суті подібну або навіть кращу за активність інтерферону. До числа мутеїнів інтерферону, які можуть застосовуватись за цим винаходом, або нуклеїнових кислот, які їх кодують, належить кінцевий набір, по суті відповідних послідовностей, таких як замісні пептиди або полінуклеотиди, які можуть бути звичайним шляхом одержані пересічним фахівцем у цій галузі без зайвого експериментування, виходячи із вказівок та настанов, наведених у цьому описі. Замінами, яким віддається перевага відповідно до цього винаходу для одержання мутеїнів, є заміни, відомі як "консервативні" заміщення. Консервативні амінокислотні заміщення поліпептидів або білків за цим винаходом можуть включати синонімічні амінокислоти у межах групи, які мають фізико-хімічні властивості, достатньо подібні для того, щоб заміщення між членами групи зберегло біологічну функцію молекули. Зрозуміло, що у вищевизначених послідовностях інсерції та делеції амінокислот можуть здійснюватись без зміни їх функції, зокрема, якщо згадані інсерції або делеції залучають лише декілька амінокислот, наприклад, менше тридцяти, а відповідно до варіанта, якому віддається перевага, менше десяти, і не видаляють або зміщують амінокислоти, які є критичними для функціональної конформації, наприклад, залишки цистеїну. Білки та мутеїни, одержані унаслідок таких делецій та/або інсерцій, входять до сфери дії цього винаходу. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, синонімічними амінокислотними групами є групи, визначені у Таблиці І. Відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, синонімічними амінокислотними групами є групи, визначені у Таблиці II; і відповідно до варіанта, якому віддається найбільша перевага, синонімічними амінокислотними групами є групи, визначені у Таблиці III. 93349 22 Таблиця І Групи синонімічних амінокислот, яким віддається перевага Амінокислота Ser Arg Leu Pro Thr Ala Val Gly Ile Phe Tyr Cys His Gln Asn Lys Asp Glu Met Trp Синонімічна група Ser, Thr, Gly, Asn Arg, Gln, Lys, Glu, His Ile, Phe, Tyr, Met, Val, Leu Gly, Ala, Thr, Pro Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Thr Gly, Thr, Pro, Ala Met, Tyr, Phe, Ile, Leu, Val Ala, Thr, Pro, Ser, Gly Met, Tyr, Phe, Val, Leu, Ile Trp, Met, Tyr, Ile, Val, Leu, Phe Trp, Met, Phe, Ile, Val, Leu, Tyr Ser, Thr, Cys Glu, Lys, Gln, Thr, Arg, His Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gln Gln, Asp, Ser, Asn Glu, Gln, His, Arg, Lys Glu, Asn, Asp Asp, Lys, Asn, Gln, His, Arg, Glu Phe, Ile, Val, Leu, Met Trp Таблиця II Групи синонімічних амінокислот, яким віддається більша перевага Амінокислота Ser Arg Leu Pro Thr Ala Val Gly Ile Phe Tyr Cys His Gln Asn Lys Asp Glu Met Trp Синонімічна група Ser His, Lys, Arg Leu, Ile, Phe, Met Ala, Pro Thr Pro,Ala Val, Met, Ile Gly Ile, Met, Phe, Val, Leu Met, Tyr, Ile, Leu, Phe Phe, Tyr Cys, Ser His, Gln, Arg Glu, Gln, His Asp, Asn Lys, Arg Asp, Asn Glu, Gln Met, Phe, Ile, Val, Leu Trp 23 93349 Таблиця III Групи синонімічних амінокислот, яким віддається найбільша перевага Амінокислота Ser Arg Leu Pro Thr Ala Val Gly Ile Phe Туr Cys His Gln Asn Lys Asp Glu Met Trp Синонімічна група Ser Arg Leu, Ile, Met Pro Thr Ala Val Gly Ile, Met, Leu Phe Tyr Cys, Ser His Gln Asn Lys Asp Glu Met, Ile, Leu Met Приклади здійснення амінокислотних заміщень у білках, які можуть застосовуватись для одержання мутеїнів інтерферону, для застосування у цьому винаході, включають стадії будь-яких відомих способів, наприклад, представлених у патентах США № 4,959,314, № 4,588,585 і № 4,737,462 на ім'я Марк (Mark) та інші; № 5,116,943 на ім'я Коте (Koths) та інші; № 4,965,195 на ім'я Намен (Namen) та інші; № 4,879,111 на ім'я Чонг (Chong) та інші; та № 5,017,691 на ім'я Лі (Lee) та інші; та білки із заміною лізину, представлені у патенті США № 4,904,584 (на ім'я Шоу (Shaw) та інші). Специфічні мутеїни бета-IFN були описані, наприклад, Марк (Mark) та іншими, 1984. Термін "гібридний білок" означає поліпептид, що містить інтерферон або його мутеїн, злитий з іншим білком, який, наприклад, має подовжений час перебування у загальній воді організму. Інтерферон може, таким чином, бути злитим з іншим білком, поліпептидом тощо, наприклад, імуноглобуліном або його фрагментом. Словосполучення "функціональні похідні", що вживається у цьому описі, означає похідні інтерферону, їхні мутеїни та гібридні білки, які можна одержати з функціональними групами, які існують у вигляді бічних ланцюгів на залишках або N- чи Скінцевих груп, способами, відомими у цій галузі, і які включаються до цього винаходу доти, доки вони залишаються фармацевтично прийнятними, тобто вони не знищують активності білка, яка є по суті подібною до активності інтерферону, і не наділяють токсичними властивостями композиції, які їх містять. До числа цих похідних можуть, наприклад, бути включені бічні ланцюги поліетиленгліколю, які можуть маскувати ділянки детермінанти і подовжувати тривалість перебування інтерферону у 24 загальній воді організму. До інших похідних належать складні аліфатичні ефіри карбоксильних груп, аміди карбоксильних груп, які одержують шляхом реакції з аміаком або з первинними чи вторинними амінами, N-ацильні похідні вільних аміногруп амінокислотних залишків, одержаних з ацильними складовими (наприклад, алканоїльні або карбоциклічні ароїльні групи) або О-ацильні похідні вільних гідроксильних груп (наприклад, похідні залишків серилу або треонілу), які одержують з ацильними складовими. Під "активними фракціями" інтерферону або мутеїнів та гібридних білків у цьому винаході розуміють будь-який фрагмент або попередників поліпептидного ланцюга білкової молекули самостійно або разом з асоційованими молекулами або залишками, пов'язаними з нею, наприклад, залишками цукру або фосфату, чи агрегати білкової молекули або залишків цукру між собою, за умови, що активність згаданої фракції не є суттєво зниженою, порівняно з відповідним інтерфероном. Термін "солі", який вживають у цьому описі, означає як солі карбоксильних груп, так і одержані додаванням кислоти солі аміногруп білків, опис яких було наведено вище, або їхніх аналогів. Солі карбоксильної групи можна одержати засобами, відомими у цій галузі, і вони включають неорганічні солі, наприклад, солі натрію, кальцію, амонію, заліза або цинку тощо та солі, одержані з органічними основами, наприклад, солі, одержані з амінами, наприклад, триетаноламіном, аргініном або лізином, піперидином, прокаїном тощо. До солей, одержаних додаванням кислоти, належать, наприклад, солі, одержані з мінеральними кислотами, наприклад, хлористоводневою кислотою або сірчаною кислотою, і солі, одержані з органічними кислотами, наприклад, оцтовою кислотою або щавлевою кислотою. Будь-яка з таких солей, звичайно, повинна зберігати біологічну активність білків (IFN) за цим винаходом, тобто здатність до зв'язування з відповідним рецептором і ініціювання передачі сигналу рецептором. За цим винаходом, застосуванню рекомбінантного людського бета-інтерферону і сполук за цим винаходом віддається додаткова особлива перевага. Нещодавно описали варіант інтерферону особливого роду. Так звані "консенсусні інтерферони" являють собою штучні варіанти інтерферону (патент США № 6,013,253). За варіантом здійснення цього винаходу, якому віддається перевага, згадані сполуки за цим винаходом застосовуються у поєднанні з консенсусним інтерфероном. Словосполучення "консенсус людського інтерферону (IFN-con)", яке вживають у цьому описі, означає штучний поліпептид, який, головним чином, включає ті залишки амінокислот, що є спільними для підгрупи альфа-інтерферону, яка представляє більшість послідовностей підтипу природного людського лейкоцитарного інтерферону і яка включає, у одному або декількох з тих положень, де немає амінокислот, спільних для усіх підтипів, амінокислоту, яка, головним чином, займає це положення, і у жодному разі не включає будь-якого залишку амінокислоти, який не існує у 25 цьому положенні у щонайменше одного природного підтипу. IFN-con включає (але ними не обмежується) амінокислотні послідовності, позначені як IFN-con1, IFN-con2 та IFN-соn3, які розкриваються у патентах США № 4,695,623, № 4,897,471 та № 5,541,293. Послідовності ДНК, що кодують IFNcon, можуть бути одержані як описано у вищезгаданих патентах або за допомогою інших стандартних способів. За додатковим варіантом здійснення, якому віддають перевагу, гібридний білок включає злиття Ig. Згадане злиття може бути безпосереднім або здійснюватись за допомогою короткого лінкерного пептиду, довжина якого може становити усього від 1 амінокислотного залишку до 3 амінокислотних залишків або більше, наприклад, 13 амінокислотних залишків. Згаданий лінкер може бути трипептидом з послідовністю E-F-M (Glu-Phe-Met), наприклад, лінкером з послідовністю 13 амінокислот, які включають Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-GlyGly-Gln-Phe-Met, введеним між послідовністю інтерферону і послідовністю імуноглобуліну. Одержаний гібридний білок може мати поліпшені властивості, наприклад, подовжений час перебування у загальній воді організму (період напіввиведення), підвищену специфічну активність, підвищений рівень експресії або полегшується очищення згаданого гібридного білка. Відповідно до додаткового варіанта здійснення, якому віддається перевага, інтерферон зливають із константною ділянкою молекули імуноглобуліну. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, інтерферон зливають із ділянками важкого ланцюга, наприклад, доменами СН2 та СН3 людського IgG1. Інші ізоформи молекул імуноглобуліну є також придатними для одержання гібридних білків за цим винаходом, наприклад, ізоформи IgG2, IgG3 або IgG4, або імуноглобуліни інших класів, наприклад, IgM чи IgA. Гібридні білки можуть бути мономерними або мультимерними, гетероабо гомомультимерними. Відповідно до додаткового варіанта здійснення, якому віддається перевага, функціональна похідна являє собою щонайменше одну складову, приєднану до однієї або декількох функціональних груп, які існують як один або декілька бічних ланцюгів на залишках амінокислот. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, згаданою складовою є поліетиленова (PEG) складова. Поліетиленгліколізація може здійснюватись відомими способами, наприклад, способами, описаними у WO 99/55377. Цей винахід, взагалі, є придатним для інтерферону будь-якого роду, для інтерферонів, які згадувались вище, для природних інтерферонів, інтерферону, який одержали методами рекомбінантних ДНК, та інтерферону, який одержали шляхом хімічного синтезу або модифікації. Термін "інтерферон" включає також неочищений, напівочищений та очищений інтерферон із фібробластів, лейкоцитів, лімфоцитів або будь-яких інших тканин людей або будь-яких інших відповідних видів, що містять або продукують інтерферон. Відповідно до варіанта, якому віддається найбільша 93349 26 перевага, цей винахід є придатним для людського фібробластного інтерферону (бета-інтерферону). Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, концентрація бета-IFN у попередньо одержаному нерозбавленому розчині становить від приблизно 10 мкг/мл до приблизно 2000 мкг/мл, відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, становить від приблизно 100 мкг/мл до приблизно 1000 мкг/мл, відповідно до варіанта, якому віддається найбільша перевага, становить приблизно 500 мкг/мл чи приблизно 810 мкг/мл. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, буфер присутній у кількості, достатній для підтримання рН згаданого нерозбавленого розчину у межах плюс або мінус 0,5 одиниці визначеного рівня рН, де визначений рівень рН становить від приблизно 3,5 до приблизно 5,5. Відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, рН дорівнює 3,8, 4,2 або 4,7. Відповідно до варіанта, якому віддається ще більша перевага, рН дорівнює 4,7. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, буфер присутній у концентрації від приблизно 5 мМ до приблизно 500 мМ. Концентрації буфера у загальному об'ємі розчину можуть дорівнювати приблизно 5 мМ, 9,5 мМ, 10 мМ, 50 мМ, 100 мМ, 150 мМ, 200 мМ, 250 мМ та 500 мМ. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, концентрація буфера дорівнює приблизно 10 мМ або приблизно 50 мМ. Особлива перевага віддається концентрації буфера, яка дорівнює приблизно 50 мМ з іонами ацетату при рН 4,7. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, буфером є ацетатний буфер, де протиіонами, яким віддається перевага, є іони натрію або калію. Ацетатні буфери у фізіологічному розчині є добре відомими у цій галузі. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, концентрація агента для регулювання ізотонічності (наприклад, маніту) становить від приблизно 0,5 мг/мл до приблизно 500 мг/мл. Відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, концентрація агента для регулювання ізотонічності становить приблизно 55 мг/мл. Відповідно до варіанта, якому віддається ще більша перевага, концентрація агента для регулювання ізотонічності становить приблизно 150 мМ, приблизно 300 мМ чи приблизно 600 мМ. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, концентрація поверхнево-активної речовини (тобто твін 20) становить від приблизно 0,01мг/мл до приблизно 10 мг/мл. Відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, концентрація поверхнево-активної речовини становить приблизно 0,05 мг/мл. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, концентрація антиоксиданта (наприклад, метіоніну) становить від приблизно 0,01 мг/мл до приблизно 5,0 мг/мл. Відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, концентрація антиоксиданта становить приблизно 0,12 мг/мл чи приблизно 0,24 мг/мл. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, амінокислотою є лізин або аргінін. Відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, амінокислотою є лізин. Відповідно до варіанта, 27 якому віддається перевага, концентрація амінокислоти (наприклад, лізину або аргініну) становить від приблизно 20 мг/мл до приблизно 200 мг/мл. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, концентрація лізину становить приблизно 27мг/мл, приблизно 55 мг/мл, приблизно 82 мг/мл чи приблизно 164 мг/мл. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, концентрація аргініну становить приблизно 32 мг/мл чи приблизно 63мг/мл. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, концентрація бактеріостатичного препарату (наприклад, бензилового спирту) становить від приблизно 0,01 мг/мл до приблизно 200 мг/мл. Відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, концентрація бактеріостатичного препарату становить приблизно 5 мг/мл чи приблизно 10мг/мл. Усі матеріали, на які здійснюється посилання у цьому описі, у тому числі журнальні статті або реферати, опубліковані або неопубліковані заявки на патенти США або зарубіжних країн, видані патенти США або зарубіжних країн чи будь-які інші матеріали, включені до цього опису у повному обсязі шляхом посилання, у тому числі усі дані, таблиці, фігури і текст, присутні у матеріалах, на які здійснюється посилання. На додаток до цього, матеріал, на який здійснюється посилання у матеріалі, на який здійснюється посилання у цьому описі, також включено до цього опису у повному обсязі шляхом посилання. Посилання на стадії відомих способів, стадії традиційних способів, відомі способи або традиційні способи у жодному разі не є визнанням того, що будь-який аспект, опис або варіант здійснення цього винаходу розкривається, описується або пропонується у відповідній галузі. Наведений вище опис конкретних варіантів здійснення з такою повнотою розкриває загальну природу цього винаходу, що інші можуть, застосовуючи фахові знання у межах цієї галузі (у тому числі вміст матеріалів, на які здійснюється посилання у цьому описі), легко модифікувати та/або адаптувати для різних варіантів застосування такі конкретні варіанти здійснення, без зайвого експериментування, без відходження від загальної концепції цього винаходу. Таким чином, припускається, що такі адаптації та модифікації будуть знаходитись у межах значення діапазону еквівалентів розкритих варіантів здійснення, виходячи із вказівок та настанов, наведених у цьому описі. Слід розуміти, що фразеологія або термінологія, наведена у цьому описі, є призначеною для опису, а не для обмеження, завдяки чому термінологія або фразеологія наведеного опису повинна трактуватись досвідченим фахівцем у світлі вказівок і настанов, наведених у цьому описі, у поєднанні зі знаннями пересічного фахівця у цій галузі. Приклади Аналітичні методи, застосовані у наведених нижче прикладах, описані у прикладі 6. Приклад 1 - Вплив температури інкубування і часу інкубування на стабілізацію нерозбавленого розчину інтерферону (термічна дисоціація) 93349 28 Наведені нижче приклади були здійснені з метою визначення впливу температури розморожування, температури інкубування і часу (тривалості) інкубування на стабілізацію нерозбавленого розчину бета-інтерферону. Мета полягала у ефективному і постійному зменшенні утворення олігомерів інтерферону та/або агрегатів інтерферону у процесі одержання. Наведені нижче приклади є придатними, головним чином, для препаратів нерозбавленого розчину інтерферону, що знаходяться на низькотемпературному зберіганні (препарати, які зберігаються при температурі нижче 0°С, наприклад, при температурі -20°С або -70°С), які повинні спочатку розморожуватись, після чого, з часом, інкубуватись або зберігатись при даній температурі і впродовж певного періоду часу для подальшої технологічної переробки. Висновки, до яких дійшли на основі цих експериментів, можуть також застосовуватись для препаратів, які зберігаються при температурі вище 0°С (наприклад, 28°С) і які, завдяки цьому, не піддають стадії розморожування (або температурним зсувам), однак, які можуть зазнавати напруження іншого роду. Термін "витримуваний", що вживається у цьому описі, означає заморожений препарат, який розморожують (наприклад, у термостаті, на бані або іншим чином), після чого зберігають (наприклад, у термостаті, на бані або іншим чином) при даній температурі впродовж певного періоду часу; термін "температура витримування" означає як температуру розморожування, так і температуру інкубування; у разі, якщо заморожений препарат безпосередньо вміщують до термостата, терміни "температура інкубування" або "температура витримування" можуть вживатись взаємозамінно; термін "час витримування" означає загальну тривалість розморожування і зберігання (наприклад, тривалість інкубування) при конкретній температурі; у разі, якщо заморожений препарат безпосередньо вмішують до термостата, терміни "час інкубування" або "час витримування" можуть вживатись взаємозамінно. 1.а. Експеримент із термічної дисоціації у невеликому лабораторному масштабі при різних температурах У першому експерименті випробували впливи температури розморожування при кімнатній температурі (RT), 25°С, 27°С чи 29°С, з подальшим інкубуванням при температурі 25°С, 27°С або 29°С впродовж у цілому 16 год або 24 год. Експеримент сплановано таким чином, щоб не змінювати температурні установки, завдяки чому впродовж усієї процедури температура підтримується на постійному рівні. Згадана процедура узагальнюється у Таблиці 4 і на Фіг. 1. Рівні олігомерів інтерферону і агрегатів інтерферону визначали за допомогою нового методу високоефективної рідинної витіснювальної хроматографії за розміром молекул (SE-HPLC), який у цьому описі позначено як NEW SEC. Згаданий метод NEW SEC надає можливість як кількісного, так і якісного виявлення як нековалентних, так і ковалентних олігомерів. Мета полягала у оптимізації термічної дисоціації (TD) нерозбавленого розчину інтерферону для зниження олігомеризації та/або агрегації до мінімального 29 93349 рівня перед одержанням лікарського засобу (видалення пошкоджень) за допомогою наведених нижче параметрів або змінних: 1) Вплив температури інкубування (25°С, 27°С та 29°С) на ефективність термічної дисоціації. 30 2) Вплив тривалості інкубування на ефективність термічної дисоціації. 3) Скорочення тривалості розморожування шляхом розморожування у термостаті. Таблиця 4 Експеримент Температура розморожування °С Температура інкубування °С RT 25 Серія 1 RT 27 RT 29 25 25 Серія 2 27 27 29 29 Контроль RT RT *3агальна тривалість розморожування та інкубування дорівнює 16 год або 24 год Контроль при кімнатній температурі (RT) здійснювали один раз, Серію 1 експерименту здійснювали двічі, Серію 2 експерименту здійснювали тричі. За кожних умов, застосовували одну пробірку місткістю 250 мл, споряджену мо деллю невеликого масштабу (2 мл пробірка (фірма Nunc) з 1,8 мл "свіжого" нерозбавленого розчину інтерферону, "модель зі вставленою пробіркою"). Застосовували термостат із водяною оболонкою або з циркуляцією повітря. Словник спеціальних термінів/скорочення Agg СОА Dim Deg FDF F/T г-h IFN-beta 1a г-h IFN-beta FDF SE-HPLC SAB Темп. Агрегати Акт Сертифікат про проведення аналізу Димери Продукти розпаду Кінцева стандартна лікарська форма Заморожування і розморожування Рекомбінантний людський бета-інтерферон 1а (r-h IFN-beta 1a) з клітин СНО (яєчник китайського хом'ячка) Кінцева стандартна лікарська форма r-h IFN-beta 1a (г-h IFN-beta FDF) Високоефективна рідинна витіснювальна хроматографія за розміром молекул 50 мМ розчин ацетату натрію, рН 3,8 Температура 1. Обладнання і матеріали нового SEC-HPLC методу: Система HPLC: Waters Alliance. УФ-детекгор: Waters 996 PDA, довжина хвилі 214 нм. Температурна установка автоматичного відбірника проб: 4°С. Колонка TosoHaas TSK G200Q SWXL. Температура колонки: кімнатна температура. Рухома фаза: 50 мМ розчин ацетату натрію (рН 3,8) з 50 мМ розчином NaCl. Одержали шляхом розчинення 5,84 г NaCl у 2 л 50 мМ буферного розчину ацетату натрію (рН 3,8). Ацетатний буфер одержали у блоці для стерильних розчинів шляхом додання оцтової кислоти до води для ін'єкцій з подальшим титруванням 10 Μ розчином NaOH до рН 3,8. Швидкість потоку: 0,5 мл/хв. Об'єм введення: 200 мкл нерозбавленого (0,34-0,36 мг/мл) розчину r-h бета-IFN 1a. Реактиви: Оцтова кислота, код за каталогом фірми Merck K31358056 NaOH, код за каталогом фірми Merck B197582 10 Μ розчин NaOH Вода для ін'єкцій NaCl, код за каталогом фірми JT BAKER 362707 2. Методика - методика представлена на Фіг. 1: 1) 1,8 мл свіжого нерозбавленого розчину r-h IFN-beta 1a вносили до пробірок місткістю 2 мл (фірма Nunc) і заморожували при температурі 70°С усередині пробірок місткістю 250 мл, що містять 200 мл води. 2) Три пробірки розморожували при кімнатній температурі і інкубували нарізно при температурі 25°С, 27°С і 29°С у термостатах з визначеною температурою (постійною температурою або температурою, фіксованою впродовж певного періоду часу) впродовж у цілому 16 год. Із пробірок відбирали проби для перевірки за допомогою NEW SEC після розморожування і через 16 год (розморожування+інкубування). 3) Три пробірки розморожували при кімнатній температурі і інкубували нарізно при температурі 25°С, 27°С і 29°С у термостатах із визначеною температурою впродовж у цілому 24 год. Із пробірок відбирали проби для перевірки за допомогою NEW SEC після розморожування і через 24 год (розморожування+інкубування). 4) Три пробірки розморожували і інкубували нарізно при температурі 25°С, 27°С і 29°С у термостатах з визначеною температурою впродовж у цілому 16 год. Із пробірок відбирали проби для перевірки за допомогою NEW SEC після розморо 31 93349 жування і через 16 год (розморожування+інкубування). 5) Три пробірки розморожували і інкубували нарізно при температурі 25°С, 27°С і 29°С у термостатах з визначеною температурою впродовж у цілому 16 год. Із пробірок відбирали проби для перевірки за допомогою NEW SEC через 16 год (розморожування+інкубування) - проби після розморожування у термостаті не відбирали. 6) Три пробірки розморожували і інкубували нарізно при температурі 25°С, 27°С і 29°С у термостатах впродовж у цілому 24 год. Із пробірок відбирали проби для перевірки за допомогою NEW SEC через 24 год (розморожування+інкубування) проби після розморожування у термостаті не відбирали. 7) Пробірку розморожували при кімнатній температурі впродовж 16 год і зберігали при температурі 2-8°С впродовж періоду часу тривалістю до 72 год - проби із пробірки відбирали для перевірки за допомогою NEW-SEC і застосування як контролю для цього експерименту. 8) 3 метою визначення впливу на молекулу, експеримент повторили за вибраних умов. Інкубовані зразки перевіряли за допомогою: NEW SEC, IEF (імуноелектрофорез), QUANT-HPLC (кількісна 32 високоефективна рідинна хроматографія), ES-MS (електронна спектроскопія-мас-спектрометрія), BIOASSAY (біоаналіз), DEG/OX HPLC (високоефективна рідинна хроматографія з оберненою фазою для продуктів розпаду та окиснених форм), CZE (клінічний капілярний електрофорез). Результати порівнювали з контрольним зразком, який розморожували при кімнатній температурі впродовж 16 год і зберігали при температурі 2-8°С. 3. Результати: %Моn або %Monomer=% мономерів r-h бета-IFN 1a %Agg=% агрегатів r-h бета-IFN 1a Розморожування при кімнатній температурі і інкубування впродовж у цілому 16 год Пробірки (3250мл) із вставками заморожували при температурі -70°С і розморожували при кімнатній температурі; пробірки обережно перевертали двадцять разів, відбирали проби і негайно переносили до трьох термостатів (25°C, 27°C і 29°С) на період часу, тривалість якого, у цілому, становила 16 год (розморожування+інкубування). Проби зберігали при температурі 2-8°С до проведення аналізу засобами NEW SEC-HPLC. Результати наведені у Таблиці 5. Таблиця 5 **Тривалість інкубування - 10 год Умови** 25°С 27°С 29°С % мономерів 88,05 92,58 95,7 % агрегатів 0,64 0,70 0,56 Розморожування при кімнатній температурі і інкубування впродовж у цілому 24 год Пробірки (3250 мл) із вставками заморожували при температурі -70°С і розморожували при кімнатній температурі; пробірки обережно перевертали двадцять разів, відбирали проби і негай % димерів 11,3 6,7 3,7 Тривалість розморожування 6 год при температурі 21-22,3°С но переносили до трьох термостатів (25°С, 27°С і 29°С) на період часу, тривалість якого у цілому становила 24 год (розморожування+інкубування). Проби зберігали при температурі 2-8°С до проведення аналізу засобами NEW SEC-HPLC. Результати наведені у Таблиці 6. Таблиця 6 **Тривалість інкубування - 18,5 год Умови ** 25°С 27°С 29°С % мономерів 92,25 96,4 97,31 % агрегатів 0,58 0,5 0,44 Розморожування у термостаті і інкубування впродовж у цілому 16 год Пробірки (3250 мл) із вставками заморожували при температурі -70°С і розморожували нарізно у трьох термостатах (25°С, 27°С і 29°С); пробірки обережно перевертали двадцять разів % димерів 7,1 3,1 2,2 Тривалість розморожування 5 год і 30 хв при температурі 21,6-22,2°С після розморожування і інкубували впродовж періоду часу, тривалість якого у цілому становила 16 год (розморожування+інкубування). Проби зберігали при температурі 2-8°С до проведення аналізу засобами NEW SEC-HPLC. Результати наведені у Таблиці 7. 33 93349 34 Таблиця 7 **Тривалість інкубування - 16 год Умови ** 25°С, з циркуляцією повітря 27°С, з водяною оболонкою 29°С, з водяною оболонкою % мономерів 90,22 93,53 95,95 % агрегатів 0,52 0,56 0,47 Розморожування у термостаті і інкубування впродовж у цілому 24 год Пробірки (3250 мл) із вставками заморожували при температурі -70°С і розморожували нарізно у трьох термостатах (25°С, 27°С і 29°С); пробірки обережно перевертали двадцять разів, відбирали проби для NEW SEC-HPLC, і інкубува % димерів 9,2 5,9 3,6 Тривалість розморожування 3 год і 9 хв 5 год 3 год і 32 хв ли впродовж у цілому 24 год (розморожування+інкубування). Проби зберігали при температурі 2-8°С до проведення аналізу засобами NEW SEC-HPLC. Експеримент повторили у інший день - без відбирання проб після розморожування. Результати наведені у Таблиці 8а і Таблиці 8b. Таблиця 8а **Тривалість інкубування - 24 год Умови ** Негайно після розморожування при температурі 25°С Негайно після розморожування при температурі 27°С Негайно після розморожування при температурі 29°С Негайно після розморожування при кімнатній температурі % мономе- % агрега- % димерів тів рів 77,48 1,63 20,89 77,2 1,73 21,07 78,56 1,64 19,8 77,42 1,65 Тривалість розморожування 3 год і 21 хв 5 год 3 год і 30 хв 20,92 6 год Таблиця 8b Умови ** 25°С-А 25°С-В 27°С-А 27°С-В 29°С-А 29°С-В % мономерів 93,42 93,15 96,32 96,22 97,85 97,58 % агрегатів 0,42 0,51 1 0,54 0,57 0,53 0,51 4. Висновки: З вищенаведених експериментів можуть бути зроблені наведені нижче висновки: - Підвищення температури інкубування і збільшення тривалості інкубування підвищує ефективність термічної дисоціації. - Тривалість розморожування зменшується у разі розморожування усередині термостата, порівняно з розморожування при кімнатній температурі, завдяки чому підвищується рівень мономерів. - Розморожування і інкубування при 25°С, 27°С і 29°С впродовж періоду часу тривалістю до 24 год не має негативного впливу на молекулу r-h бета-IFN 1а за даними звичайної SEC HPLC (високоефективна рідинна витіснювальна хроматографія за розміром молекул), Deg/Ox HPLC (високоефективна рідинна хроматографія з оберненою фазою для продуктів розпаду та окиснених форм), QUANT-HPLC (кількісна високоефективна рідинна хроматографія), ES-MS (електронна спектроскопія-мас-спектрометрія), біоаналізу і CZE (клінічний капілярний електрофорез). Вищенаведені експерименти демонструють, що значні результати, з точки зору зниження олі % димерів 6,1 6,3 3,1 3,2 1,6 1,9 Тривалість розморожування 3 год і 8 хв 5 год 3 год і 30 хв гомеризації, одержують шляхом регулювання температури витримування і часу витримування попередньо замороженого нерозбавленого розчину інтерферону, що зберігався. Незалежно від того, яким чином розморожували препарат (наприклад, розморожування при кімнатній температурі або розморожування у термостаті), підвищення температури витримування до певної точки благотворно впливає на рівень мономерів інтерферону. Таким чином, існує взаємозв'язок між температурою витримування і рівнем мономерів білка; наслідком підвищення температури витримування з 25°С до 29°С є підвищення рівня мономерів білка. Найкращі результати одержують у тому разі, коли нерозбавлений розчин витримують при температурі 29°С. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, нерозбавлений розчин вміщують до термостата при температурі інкубування 29°С. У разі порівняння температур інкубування, підвищення рівня мономерів ~56% спостерігається у діапазоні температур від 25°С до 29°С. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, заморожений препарат безпосередньо вміщують до термостата і не розморо 35 93349 жують при кімнатній температурі перед інкубуванням (розморожування, таким чином, відбувається у термостаті). Результати показують також, що інкубування розмороженого нерозбавленого розчину інтерферону впродовж 10 год вже забезпечує одержання рівня вмісту мономерів, який перевищує 95%. Випробувані періоди інкубування, у разі розморожування при кімнатній температурі, дорівнювали 10 год або 18,5 год. Випробувані періоди інкубування, у разі розморожування у термостаті, дорівнювали 16 год або 24 год. Таким самим чином, час витримування також є фактором, який впливає на олігомеризацію. Незалежно від умов витримування (наприклад, розморожування при кімнатній температурі з подальшим інкубуванням або безпосереднє інкубування), існує взаємозв'язок між часом витримування і рівнем мономерів; триваліший час витримування підвищує рівень вмісту мономерів білка. Найкращі результати одержують у разі часу витримування, який дорівнює 24 год. У разі порівняння часу витримування, ~3% приріст мономерів досягається у діапазоні часу витримування від 16 год до 24 год. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, час витримування для замороженого препарату становить 24 год. Відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, заморожений препарат безпосередньо вміщують до термостата (розморожування відбувається у термостаті) на час інкубування (час витримування), який дорівнює 24 год. Завдяки об'єднанню двох змінних (час витримування і температура витримування), можна одержати ~9% підвищення рівня мономерів. Результати є ще більш вражаючими у разі порівняння інкубованих композицій з композиціями, які інкубуванню не піддавали. 77,48% Mon одержують у тому разі, якщо препарат аналізують негайно після розморожування (не інкубований), у той час як 97,9% Mon одержують у тому разі, коли заморожений препарат безпосередньо інкубують впродовж періоду часу інкубування, який дорівнює 24 год, при температурі інкубування, яка становить 29°С. 36 Таким чином, шляхом оптимізації двох змінних одержують 20% різницю у рівнях мономерів. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, для нерозбавленого розчину інтерферону встановлюють температуру витримування 29°С впродовж часу витримування, який дорівнює 24 год. Відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, нерозбавлений розчин інтерферону безпосередньо інкубують при температурі 29°С (розморожування відбувається у термостаті) впродовж часу інкубування, який дорівнює 24 год (найкращі результати дають рівень 97,9% Mon). На завершення, час витримування і температура витримування, а відповідно до варіанта, якому віддається перевага, температура інкубування і час інкубування, є важливими факторами, які роблять значний внесок до підтримування та/або підвищення стабілізації попередньо одержаного нерозбавленого розчину інтерферону або композиції. 1.b Експерименти з термічної дисоціації у лабораторному масштабі при температурі 29°С з різними циклами заморожування/розморожування Ці експерименти здійснювали з метою визначення впливу інкубування при температурі 29°С на рівень димерів і агрегатів у лікарській речовині r-h бета-IFN 1a. 1. Методика: a. NEW-SEC метод було застосовано для аналізу зразків нерозбавленого розчину r-h бета-IFN 1a, які інкубували при температурі 29°С впродовж 15 год або 3 год після розморожування і які піддавали різним циклам заморожування/розморожування (F/T), як вказано у Таблиці 9. Нерозбавлений розчин r-h бета-IFN 1a переносили до семи 15 мл пробірок (фірма Corning, по 0,9 мл до кожної пробірки). Пробірки заморожували при температурі -70°С. Нерозбавлений розчин r-h бета-IFN 1a (попередньо заморожений і розморожений) також переносили до двох 250 мл пробірок (фірма Corning, по 200 мл до кожної пробірки), пробірки заморожували при температурі -70°С. Таблиця 9 Обробка зразків для експерименту з термічної дисоціації у лабораторному масштабі Зразок Цикли заморожування/розморожування 1 1 Кімнатна температура - 2 год 2 1 Кімнатна температура - 2 год 3 1 На бані з циркуляцією води при температурі 29°С впродовж 4 хв 4 4 Кімнатна температура - 2 год 5 4 Кімнатна температура - 2 год 6 4 Кімнатна температура - 2 год Розморожування Зберігання перед аналізом засобами SEC-HPLC Зберігання при температурі 4°С При температурі 29°С у сухому термостаті впродовж 15 год При температурі 29°С у сухому термостаті впродовж 15 год Зберігання при температурі 4°С При температурі 29°С у сухому термостаті впродовж 15 год При температурі 29°С у сухому термостаті впродовж 3 год 37 93349 38 Продовження таблиці 9 1 2 7 4 8 (250 мл пробірка) 9 (250 мл пробірка) 3 На бані з циркуляцією води при температурі 29°С впродовж 4 хв 2 Кімнатна температура - 7 год 2 Кімнатна температура - 7 год b. 3 метою визначення впливу інкубування нерозбавленого розчину r-h бета-IFN 1a на молекулу, інкубований нерозбавлений розчин (після одного циклу F/T) перевіряли наведеними нижче методами: Deg/Ox-HPLG, IEF, ES-MS, QuantHPLC, CZE. c. На додаток до цього, визначали також кінетику термічної дисоціації у лабораторному масштабі після одного циклу F/T. Аліквоти нерозбавленого розчину r-h бета-IFN 1a у 250 мл пробірці, після одного циклу F/T, переносили до 15 мл пробірок з інкубуванням у термостаті при температурі 29°С. 4 При температурі 29°С у сухому термостаті впродовж 15 год При температурі 29°С у сухому термостаті впродовж 15 год Зберігання при температурі 4°С 2. Результати: 1) Інкубування нерозбавленого розчину r-h бета-IFN 1a (1 цикл F/T) після розморожування при кімнатній температурі підвищило рівень мономерів з 82,8% до 97,57% і зменшило рівень агрегатів з 0,7% до 0,2% (дивись Таблицю 10). Інкубування при температурі 29°С (термостат) впродовж 15 год є ефективним щодо дисоціації димерів. 2) Інкубування нерозбавленого розчину r-h бета-IFN 1a після розморожування на бані підвищило рівень мономерів з 82,8% до 96,7%, але підвищило рівень агрегатів з 0,7% до 1,97% (дивись Таблицю 10). Таблиця 10 Результати дослідження 0,9 мл зразків нерозбавленого розчину після 1 циклу F/T засобами SEC-HPLC Агрегати Димери Мономери Зразок % площини % площини % площини 0,72 17,01 82,27 1 цикл F/T Розморожували при кімнатній температурі впродовж 2 год, зберігали при температурі 4° С - Контроль 0,69 15,88 83,43 Середнє 0,70 16,4 82,85 0,23 2,3 97,47 1 цикл F/T Розморожували при кімнатній температурі впродовж 2 год, інкубували при температурі 29°С - 15 год 0,19 2,14 97,67 Середнє 0,21 2,22 97,57 1,97 1,43 96,6 1 цикл F/T Розморожували на бані (29°С, 4 хв.), Інкубували при температурі 29° С - 15 годин 1,97 1,18 96,85 Середнє 1,97 1,30 96,72 3) Інкубування нерозбавленого розчину r-h бета-IFN 1a (4 цикли F/T) впродовж 3 год після розморожування при кімнатній температурі підвищило рівень мономерів з 82,3% до 89,5% унаслідок зменшення рівня димерів (дивись Таблицю 11 і Фіг. 2). 4) Інкубування нерозбавленого розчину r-h бета-IFN 1a впродовж 15 год (4 цикли F/T) після розморожування при кімнатній температурі дода тково підвищило рівень мономерів (порівняно з інкубуванням впродовж 3 год) з 82,3% до 93,7% унаслідок зменшення рівня димерів (дивись Таблицю 11 і Фіг. 2). 5) Інкубування нерозбавленого розчину r-h бета-IFN 1a після розморожування на бані підвищило рівень мономерів з 82,3% до 94,7% унаслідок зменшення рівня димерів (дивись Таблицю 11 і Фіг. 2). Таблиця 11 Результати дослідження 0,9 мл зразків нерозбавленого розчину після 4 циклів F/T засобами SEC-HPLC Зразок 4 цикли F/T Розморожували при кімнатній температурі впродовж 2 год, зберігали при температурі 4°С - Контроль Середнє 4 цикли F/T Розморожували при кімнатній температурі впродовж 2 год, інкубували при температурі 29°С - 3 год Агрегати Димери Мономери % площини % площини % площини 2,89 14,16 82,95 3,03 15,26 81,71 2,96 14,71 82,33 2,98 7,66 89,36 2,92 7,42 89,66 39 93349 40 Продовження таблиці 11 1 Середнє 4 цикли F/T Розморожували при кімнатній температурі впродовж 2 год, інкубували при температурі 29°С - 15 год Середнє 4 цикли F/T Розморожували на бані, інкубували при температурі 29°С - 15 год Середнє 6) Інкубування 200 мл зразка нерозбавленого розчину r-h бета-IFN 1a після розморожування при кімнатній температурі підвищило рівень мо 2 2,95 2,97 2,91 2,94 2,89 2,83 2,86 3 7,54 3,45 3,27 3,36 2,38 2,31 2,34 5 89,51 93,58 93,82 93,7 94,73 94,86 94,79 номерів з 73% до 91,2% і зменшило рівень агрегатів з 3,9% до 2,9% (дивись Таблицю 12 і Фіг. 3). Таблиця 12 Результати дослідження 200 мл зразків нерозбавленого розчину після 2 циклів F/T засобами SEC-HPLC Агрегати Димери Мономери % площини % площини % площини 4,06 23,3 72,64 200 мл розморожували при кімнатній температурі впродовж 7 год, зберігали при температурі 4°С, контроль 3,85 22,71 73,44 Середнє 3,9 23,0 73,04 2,98 5,65 91,37 200 мл розморожували при кімнатній температурі впродовж 7 год, інкубували при температурі 29°С впродовж 15 год 2,95 6,05 91 Середнє 2,9 5,8 91,18 Зразок 7) Інкубовані зразки нерозбавленого розчину rh бета-IFN 1a (0,9 мл, 1 цикл F/T) аналізували наведеними нижче методами разом із контрольним зразком, який розморожували при кімнатній температурі і зберігали при температурі 4° С (дивись Таблицю 13): Deg/Ox-HPLC - підвищення рівня окиснення інкубованих зразків, порівняно з контрольним зразком (який зберігався при температурі 4°С), не спостерігалось. ES-MS - різниці у рівні вуглеводів інкубованих зразків, порівняно з контрольним зразком, не спостерігалось. Quant-HPLC - суттєвих різниць концентрації не спостерігалось. CZE - Були одержані електроферограми ідентичного профілю. IEF - Зразок нерозбавленого розчину r-h бетаIFN 1a, який розморожували на бані з циркулюванням води, продемонстрував додаткову смугу на рівні приблизно pI 7. Контрольний зразок і зразок, розморожений при кімнатній температурі і інкубований впродовж 15 год, відповідав технічним специфікаціям. Таблиця 13 Вплив термічної дисоціації на інтерферон Зразок один цикл заморожування/розморожування при кімнатній температурі, при температурі 4°С один цикл заморожування/розморожування при кімнатній температурі, при температурі 29°С впродовж 15 год один цикл заморожування/ розморожування при температурі29°С впродовж15 год Deg/Ox ES-MS IEF Q HPLC % NON MONO DI TRI 8,9-9 8,5 7,9-8,0 мкг/мл CZE 99,3 1 15 72 12 19 58 23 334 відповідає 99,4 1 15 71 12 20 55 24 338 відповідає 99,4 2 16 70 12 15 56 28 363 відповідає Таблиця 13 показує, що інкубування лікарського засобу r-h бета-IFN 1a при температурі 29°С впродовж періоду часу тривалістю до 15 год після розморожування при кімнатній температурі, не впливає на параметри молекули r-h бета-IFN 1a, як визначалось за допомогою DEG/OX HPLC, ESMS, Quant-HPLC, CZE та IEF. 41 93349 8) Результати дослідження кінетики термічної дисоціації при одному циклі F/T наведені у Таблиці 14 і на Фіг. 4-6. Таблиця 14 Кінетика термічної дисоціації у лабораторних масштабах при одному циклі F/T Час (год) 0 3 6 9 12 15 24 Мономери 73,4 90,04 94,13 95,09 95,92 96,56 97,2 Димери 24,7 8,54 4,7 3,79 3,09 2,54 1,94 Агрегати 1,94 1,42 1,19 1,12 0,99 0,91 0,87 3. Висновки: 1) Інкубування зразків r-h бета-IFN 1a при температурі 29°С впродовж 15 год після розморожування при кімнатній температурі значно знизило рівень олігомеризації (головним чином, димерів). 2) Інкубування зразків r-h бета-IFN 1a при температурі 29°С впродовж 15 год після розморожування на бані при температурі 29°С значно знизило рівень олігомеризації. 3) Виходячи з результатів, які були одержані за допомогою застосованих аналітичних методів, інкубування нерозбавленого розчину r-h бета-IFN 1a впродовж 15 год при температурі 29°С після розморожування при кімнатній температурі, не мало негативного впливу на параметри молекули бета-IFN 1а, як визначалось за допомогою DEG/OX HPLC, ES-MS, Quant-HPLC, CZE та IEF. Згадана процедура була ефективною щодо дисоціації нековалентних олігомерів, однак дисоціюють не усі нековалентні олігомери (4% нековалентних олігомерів у 250 мл пробірках не дисоціювало). Відсоток мономерів у 250 мл пробірках досягав 94% (інкубування впродовж 9 год при температурі 29°С) і 97,57% у невеликих пробірках (інкубування впродовж 15 год при температурі 29°С). Рівновага олігомерів була досягнута негайно після термічної дисоціації (дивись Таблиці і Фігури). Термічна дисоціація при температурі 29°С у 15 мл пробірках завершується через 15 год. Підсумовуючи, ці експерименти (1.а і 1.b) показують, що термічна дисоціація, здійснювана при конкретній температурі і конкретній тривалості (тобто температурі витримування і часі витримування або часі інкубування і температурі інкубування), є критичною для підтримання та/або підвищення стабільності (мономерного) білка або композиції, яка містить (мономерний) білок. Кінетика термічної дисоціації бетаінтерферону додатково показує, що термічна дисоціація при одному циклі F/T забезпечує 90% рівень мономерів усього через 3 год, майже завершується через 6 год, після чого досягає "плато" через 15 год. Відповідно до варіанта, якому відда 42 ється перевага, термічну дисоціацію здійснюють впродовж щонайменше 3 год. Відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, тривалість (час витримування або час інкубування) термічної дисоціації бета-інтерферону встановлюється у межах від 6 год до 40 год. Відповідно до варіанта, якому віддається ще більша перевага, тривалість термічної дисоціації бета-інтерферону встановлюється у межах від 15 год до 30 год або впродовж 10 год, 16 год, 18,5 год або 24 год. Відповідно до варіанта, якому віддається навіть ще більша перевага, тривалість термічної дисоціації бетаінтерферону становить 24 год. Температура інкубування або витримування, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, встановлюється у межах від 27°С до 31°С. Відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, згадана температура дорівнює 29°С. Незважаючи навіть на те, що результати кінетики термічної дисоціації були одержані після одного циклу заморожування/розморожування, фахівець у цій галузі, за допомогою традиційних методів, може легко визначити кінетику термічної дисоціації після багатьох циклів F/T (наприклад, після 2 циклів F/T, 4 циклів F/T або 11 циклів F/T; або після напруження будьякого роду) чи навіть для усього виробничого процесу або будь-якої його частини будь-якого бетаінтерферону (наприклад, r-h бета-IFN 1a) або будь-якого мономерного білка. Цей винахід, як такий, не повинен обмежуватись конкретним часом інкубування або тривалістю інкубування (або часом витримування). Подібним же чином, фахівець у цій галузі за допомогою традиційних методів може легко визначити найприйнятнішу температуру інкубування (або температуру витримування) після одного або декількох циклів F/T (або після напруження будь-якого іншого роду) або навіть для усього виробничого процесу чи будь-якої його частини будь-якого бетаінтерферону (наприклад, r-h бета-IFN 1a) або будь-якого мономерного білка. Цей винахід, як такий, не повинен обмежуватись конкретною температурою інкубування (або температурою витримування). Приклад 2: Стабілізація бета-інтерферону шляхом додання наповнювача до нерозбавленого розчину інтерферону. Ці експерименти були здійснені для перевірки захисного ефекту, який демонструють деякі наповнювачі, наприклад, амінокислоти, бактеріостатичні препарати, поверхнево-активні речовини і агенти для регулювання ізотонічності, на нерозбавлений розчин r-h бета-IFN 1a з точки зору олігомеризації і агрегування. Наведені нижче дослідження здійснювали без додання сироваткового альбуміну людини (HSA) до попередньо одержаних нерозбавлених розчинів r-h бета-IFN 1a. 1.0 Словник спеціальних термінів/скорочення 43 93349 44 Агрегати Акт про проведення аналізу Димери Продукти розпаду Кінцева стандартна лікарська форма Заморожування і розморожування Рекомбінантний людський бета-інтерферон 1a (r-h IFN-beta 1a) з клітин СНО (яєчник киr-h IFN-beta 1a тайського хом'ячка) r-h IFN-beta FDF Кінцева стандартна лікарська форма r-h IFN-beta 1a (r-h IFN-beta FDF) SE-HPLC Високоефективна рідинна витіснювальна хроматографія за розміром молекул SAB 50 мМ розчин ацетату натрію, рН 3,8 Темп. Температура Agg СОА Dim Deg FDF F/T 2.0 Введення Це дослідження зосереджувалось на зведенні до мінімального рівня олігомеризації r-h бета-IFN 1a на стадіях виробництва із фракції SEC-EL до зберігання кінцевої лікарської форми з метою забезпечення наявності стабілізованого нерозбавленого розчину бета-інтерферону. Зведення до мінімального рівня олігомеризації, обумовленої напруженнями (наприклад, циклом заморожування/розморожування), здійснювали таким чином: 1) попереднє змішування нерозбавленого розчину білка з наповнювачами та/або іншими стабілізувальними агентами і без сироваткового альбуміну людини; 2) визначення впливу температур зберігання (20°С, -70°С, 2-8°С) на олігомеризацію попередньо одержаного нерозбавленого розчину. Зразки попередньо одержаного нерозбавленого розчину аналізували засобами SE-HPLC. 3.0 Мета/обсяг Зведення до мінімального рівня олігомеризації r-h бета-IFN 1a під час обробки нерозбавленого розчину. 4.0 Обладнання і матеріали 4.1 Обладнання 0,2 мк фільтрувальна установка P/N MPGL025 Millipore 0,2 мк фільтр зі шприцем фірми Millex P/N SLGV025LS Millipore 250 мл конічні центрифужні пробірки - фірма Corning 1,8 мл пробірки, стійкі до низької температури - фірма Nunc 4.2 Матеріали a) Фракції SEC-EL2 b) D-маніт, DAB (Німецька фармакопея), Ph Eur (Європейська фармакопея), ВР (Британська фармакопея), USP (Фармакопея США), FCC (Міжнародний харчовий хімічний кодекс), Е421 (код 1.05980, фірма Merck) c) Льодяна оцтова кислота 100% (код 1.00063, фірма Merck) d) 10 Μ розчин гідроксиду натрію e) Poloxamer 188 (Lutrol F 68 DAC, USP/NF, Basf), 5163315 f) Л-метіонін (1.05707, фірма Merck) g) Бензиловий спирт, Ph Eur, BP, NF (додаток до Американської фармакопеї) (код 1.00987, фірма Merck) h) Л-аргініну моногідрохлорид (код 1.01544, фірма Merck) і) Tween 20 Ph Eur, NF (код 8.17072, фірма Merck) j) Лізин (код 1.05701, фірма Merck) k) r-h бета-IFN 1a, 0,48-0,5 мг/мл або 0,088 мг/мл l) 50 мМ або 10 мМ розчин ацетатного буфера, рН 3,8 Стабілізатори: Амінокислоти: 1) Аргінін, 31,6 мг/мл 2) Лізин, 27,4 мг/мл 3) Метіонін. 0,12 мг/мл (антиоксидант) Поверхнево-активні речовини: 1) Твін 20, 0,05 мг/мл 2) Poloxamer 188 (Плуронова кислота), 0,5 мг/мл Бактеріостатичний препарат: 1) Бензиловий спирт, 5 мг/мл Агент для регулювання ізотонічності: 1. Маніт,54,6 мг/мл Методика Дослідження здійснювали на фракціях SECEL2. Загальна схема дослідження представлена на Фіг. 7. Різні умови попереднього одержання нерозбавлених розчинів білка наведені у Таблиці 15 і Таблиці 16. 45 93349 46 Таблиця 15 Експериментальна схема ПоверхневоСтабілізатор активна речовина + + + Твін 20 + Poloxamer 188 4°С -20°С -20°С 2мл пробі- 250мл про- 2мл пробіАнтиоксидант рка бірка рка + + + Л-метіонін + + Л-метіонін + + Л-метіонін + + + + + -70°С 250 мл пробірка + + -70°С 2 мл пробірка + + + + + Стабілізатор: бензиловий спирт/Л-аргінін/маніт/лізин Таблиця 16 Випробувані умови попереднього одержання нерозбавленого розчину білка Умови Ацетатний Бензиловий Л-аргініну моногід- Маніт, Лізин, буфер, рН спирт, мг/мл рохлорид, мг/мл мг/мл мг/мл Роlоха-mег 188, мг/мл Tween Л-метіонін, 20мг/мл мг/мл 1 5 2 3 4 5 5 5 0,5 0,05 0,12 0,12 0,12 5 31,6 31,6 31,6 31,6 0,5 0,05 0,12 0,12 0,12 9 54,6 10 11 12 13 Контроль 14 Контроль 54,6 54,6 54,6 0,5 0,05 0,12 0,12 0,12 27,4 27,4 27,4 27,4 0,5 0,05 0,12 0,12 0,12 6 7 8 15 16 17 18 50 мМ рН3,8 10 мМ рН3,8 50 мМ рН3,8 6.1 Одержання розчинів 6.1.1 Одержання 1 л 50 мМ розчину ацетату натрію, рН 3.8 (SAB) До 1000 мл WFI (вода для ін'єкцій) додавали 3,003 г льодяної оцтової кислоти, і розчин перемішували впродовж 5 хв. Для доведення рН до рівня 3,8 додавали приблизно 0,56 мл 10 Μ розчину гідроксиду натрію, розчин перемішували впродовж 5 хв, відбирали проби для визначення провідності і фільтрували на 0,2 мк фільтрі. До складу попередньо одержаного розчину включають приблизно 0,1% (критична міцелярна концентрація) Poloxamer 188 (або Рluronic F-68) для запобігання адсорбції лікарської речовини на поверхні контейнерів під час виробничого процесу; більш високі концентрації можуть негативно вплинути на стабільність продукту (підвищене окиснення); більш низькі концентрації мо Кількість пробірок 4250 мл 62 мл 62 мл 62 мл 62 мл 4250 мл 62 мл 62 мл 62 мл 62 мл 4250 мл 62 мл 62 мл 62 мл 62 мл 2250 мл 62 мл 62 мл 4250 мл 62 мл 62 мл 62 мл 62 мл жуть бути менш ефективними щодо обмеження адсорбції. 6.1.2 Одержали один літр наведених нижче розчинів: 1) 50 мМ ацетатний розчин, рН 3,8, 10 мг/мл бензилового спирту Відповідно до п. 6.1.1, з доданням 10 г бензилового спирту перед доданням гідроксиду натрію. 2) 50 мМ ацетатний розчин, рН 3,8, 5 мг/мл бензилового спирту Відповідно до п. 6.1.1, з доданням 5 г бензилового спирту перед доданням гідроксиду натрію. 3) 50 мМ ацетатний розчин, рН 3,8, 63,2 мг/мл аргініну Відповідно до п. 6.1.1, з доданням 63,2 г аргініну перед доданням гідроксиду натрію. 4) 50 мМ ацетатний розчин, рН 3,8, 31,6 мг/мл аргініну 47 Відповідно до п. 6.1.1, з доданням 31,6 г аргініну перед доданням гідроксиду натрію. 5) 50 мМ ацетатний розчин, рН 3,8, 54,8 мг/мл лізину Відповідно до п. 6.1.1, з доданням 54,8 г лізину перед доданням гідроксиду натрію. 6) 50 мМ ацетатний розчин, рН 3,8, 27,4 мг/мл лізину Відповідно до п. 6.1.1, з доданням 27,4 г лізину перед доданням гідроксиду натрію. 7) 50 мМ ацетатний розчин, рН 3,8, 600 мМ розчин маніту До 0,926 кг WFI (вода для ін'єкцій) додавали 3,003 г льодяної оцтової кислоти, і розчин перемішували впродовж 5 хв. До згаданого розчину додавали 100,3 г маніту і перемішували впродовж 5 хв. Для доведення рН до рівня 3,8, додавали приблизно 0,56 мл 10 Μ розчину гідроксиду натрію, розчин перемішували впродовж 5 хв, відбирали проби для визначення провідності і фільтрували на 0,2 мк мембранному фільтрі. 8) 50 мМ ацетатний розчин, рН 3,8, 300 мМ розчин маніту До 0,966 кг WFI (вода для ін'єкцій) додавали 3,003 г льодяної оцтової кислоти, і розчин перемішували впродовж 5 хв. До згаданого розчину додавали 55,1 г маніту і перемішували впродовж 5 хв. Для доведення рН до рівня 3,8, додавали приблизно 0,56 мл 10 Μ розчину гідроксиду натрію, розчин перемішували впродовж 5 хв, відбирали проби для визначення провідності, і фільтрували на 0,2 мк мембранному фільтрі. 6.1.3 Одержали один літр наведених нижче розчинів: 1) 50 мМ ацетатний розчин, рН 3,8, 5 мг/мл бензилового спирту, 12 мг/мл метіоніну Відповідно до п. 6.1.2, з доданням 12 г метіоніну. 2) 50 мМ ацетатний розчин, рН 3,8, 5 мг/мл бензилового спирту, 12 мг/мл метіоніну, 50 мг/мл Poloxamer 188 Відповідно до п. 6.1.2, з доданням 12 г метіоніну і 50 г Poloxamer 188. 3) 50 мМ ацетатний розчин, рН 3,8, 5 мг/мл бензилового спирту, 12 мг/мл метіоніну, 5 мг/мл твін 20 Відповідно до п. 6.1.2, з доданням 12 г метіоніну і 5 г твін. 4) 50 мМ ацетатний розчин, рН 3,8, 31,6 мг/мл аргініну, 12 мг/мл метіоніну Відповідно до п. 6.1.2, з доданням 12 г метіоніну. 5) 50 мМ ацетатний розчин, рН 3,8, 31,6 мг/мл аргініну, 12 мг/мл метіоніну, 50 мг/мл Poloxamer 188 Відповідно до п. 6.1.2, з доданням 12 г метіоніну і 50 г Poloxamer 188. 6) 50 мМ ацетатний розчин, рН 3,8, 31,6 мг/мл аргініну, 12 мг/мл метіоніну, 5 мг/мл твін 20 Відповідно до п. 6.1.2, з доданням 12 г метіоніну і 5 г твін. 7) 50 мМ ацетатний розчин, рН 3,8, 300 мМ розчин маніту, 12 мг/мл метіоніну Відповідно до п. 6.1.2, з доданням 12 г метіоніну. 93349 48 8) 50 мМ ацетатний розчин, рН 3,8, 300 мМ розчин маніту, 12 мг/мл метіоніну, 5 мг/мл Poloxamer 188 Відповідно до п. 6.1.2, з доданням 12 г метіоніну і 5 г Poloxamer 188. 9) 50 мМ ацетатний розчин, рН 3,8, 300 мМ розчин маніту, 12 мг/мл метіоніну, 5 мг/мл твін 20 Відповідно до п. 6.1.2, з доданням 12 г метіоніну і 5 г твін. 10) 50 мМ ацетатний розчин, рН 3,8, 27,4 мг/мл лізину, 12 мг/мл метіоніну Відповідно до п. 6.1.2, з доданням 12 г метіоніну. 11) 50 мМ ацетатний розчин, рН 3,8, 27,4 мг/мл лізину, 12 мг/мл метіоніну, 5 мг/мл Poloxamer 188 Відповідно до п. 6.1.2, з доданням 12 г метіоніну та 5 г Poloxamer 188. 12) 50 мМ ацетатний розчин, рН 3,8, 27,4 мг/мл лізину, 12 мг/мл метіоніну, 5 мг/мл твін 20 Відповідно до п. 6.1.2, з доданням 12 г метіоніну та 5 г твін. 6.2 Попереднє одержання нерозбавленбго розчину білка Загальна схема одержання нерозбавленого розчину білка і композиції представлена на Фіг. 7 і у Таблиці 15. Перша стадія 6.2.1 197 г фракції SEC-EL розбавляли 1:1 (мас.) SAB, 10 мг/мл бензилового спирту. 6.2.2 197 г фракції SEC-EL розбавляли 1:1 (мас.) SAB, 63,2 мг/мл аргініну. 6.2.3 197 г фракції SEC-EL розбавляли 1:1 (мас.) SAB, 600 мМ розчином маніту. 6.2.4 197 г фракції SEC-EL розбавляли 1:1 (мас.) SAB, 54,8 мг/мл лізину. 6.2.5 92 г фракції SEC-EL розбавляли 208 г SAB для одержання розчину, що містить 0,5 мг/мл r-h бета-IFN 1a. Після фільтрації розчини розподіляли між двома 250 мл пробірками (які містили 130 г нерозбавленого розчину) та шістьома 2 мл пробірками (які містили 0,5 мл нерозбавленого розчину). Одну 250 мл пробірку і дві 2 мл пробірки заморожували і зберігали при температурі -70°С. Одну 250 мл пробірку і дві 2 мл пробірки заморожували при температурі -70°С, після чого переносили до другої морозильної шафи для зберігання при температурі -20°С. Дві 2 мл пробірки зберігали при температурі 28°С. Фракцію SEC-EL розбавляли водою для одержання 6 мл розчину, що містить 0,088 мг/мл r-h бета-IFN 1a у 10 мМ ацетатному розчині, рН 3,8. Друга стадія Наведені нижче розчини одержали з концентрацією r-h бета-IFN 1a 0,5 мг/мл. 6.2.6 Розчин відповідно до п. 6.2.1 розбавляли SAB, 5 мг/мл бензилового спирту. 6.2.7 Розчин відповідно до п. 6.2.2 розбавляли SAB, 31,6 мг/мл аргініну. 6.2.8 Розчин відповідно до п. 6.2.3 розбавляли SAB, 300 мМ розчином маніту. 6.2.9 Розчин відповідно до п. 6.2.4 розбавляли SAB, 27,4 мг/мл лізину. 49 93349 6.2.10 Після фільтрації ці чотири розчини (6.2.6-6.2.9) розподіляли між чотирма 250 мл пробірками (які містили 130 г нерозбавленого розчину) та шістьома 2 мл пробірками (які містили 2 мл нерозбавленого розчину). У цілому - чотирнадцять 250 мл пробірок і вісімнадцять 2 мл пробірок. Залишковий об'єм цих трьох розчинів піддавали додатковій обробці (третя стадія). 6.2.11 По дві 250 мл пробірки і дві 2 мл пробірки кожного розчину заморожували і зберігали при температурі -70°С. По дві 250 мл пробірки і дві 2 мл пробірки кожного розчину заморожували при температурі 70°С, після чого переносили до другої морозильної шафи для зберігання при температурі -20°С. По дві 2 мл пробірки кожного розчину зберігали при температурі 2-8°С. Третя стадія (розведення 1:100) 6.2.12 29,7 мл розчину відповідно до п. 6.2.6 розбавляли 0,3 мл SAB, 5 мг/мл бензилового спирту, 12 мг/мл метіоніну. 6.2.13 29,7 мл розчину відповідно до п. 6.2.6 розбавляли 0,3 мл SAB, 5 мг/мл бензилового спирту, 12 мг/мл метіоніну, 50 мг/мл плуроніку. 6.2.14 29,7 мл розчину відповідно до п. 6.2.6 розбавляли 0,3 мл SAB, 5 мг/мл бензилового спирту, 12 мг/мл метіоніну, 5 мг/мл твін 20. 6.2.15 29,7 мл розчину відповідно до п. 6.2.7 розбавляли 0,3 мл SAB, 31,6 мг/мл аргініну, 12 мг/мл метіоніну. 6.2.16 29,7 мл розчину відповідно до п. 6.2.7 розбавляли 0,3 мл SAB, 31,6 мг/мл аргініну, 12 мг/мл метіоніну, 50 мг/мл плуроніку. 6.2.17 29,7 мл розчину відповідно до п. 6.2.7 розбавляли 0,3 мл SAB, 31,6 мг/мл аргініну, 12 мг/мл метіоніну, 5 мг/мл твін 20. 6.2.18 29,7 мл розчину відповідно до п. 6.2.8 розбавляли 0,3 мл SAB, 300 мМ розчином маніту, 12 мг/мл метіоніну. 6.2.19 29,7 мл розчину відповідно до п. 6.2.8 розбавляли 0,3 мл SAB, 300 мМ розчином маніту, 12 мг/мл метіоніну, 50 мг/мл плуроніку. 6.2.20 29,7 мл розчину відповідно до п. 6.2.8 розбавляли 0,3 мл SAB, 300 мМ розчином маніту, 12 мг/мл метіоніну, 5 мг/мл твін 20. 50 6.2.21 29,7 мл розчину відповідно до п. 6.2.9 розбавляли 0,3 мл SAB, 27,4 мг/мл лізину, 12 мг/мл метіоніну. 6.2.22 29,7 мл розчину відповідно до п. 6.2.9 розбавляли 0,3 мл SAB, 27,4 мг/мл лізину, 12 мг/мл метіоніну, 50 мг/мл плуроніку. 6.2.23 29,7 мл розчину відповідно до п. 6.2.9 розбавляли 0,3 мл SAB, 27,4 мг/мл лізину, 12 мг/мл метіоніну, 5 мг/мл твін 20. 6.2.24 Усі розчини (6.2.12-6.2.23) фільтрували нарізно за допомогою 0,2 мк фільтра зі шприцем фірми Millex. 6.2.25 Розчини розподіляли між 2 мл пробірками (щонайменше 6 пробірок для кожного розчину). 6.2.26 По дві 2 мл пробірки кожного розчину заморожували і зберігали при температурі -70°С. По дві2 мл пробірки кожного розчину заморожували при температурі -70°С, після чого переносили до другої морозильної шафи для зберігання при температурі -20°С. По дві 2 мл пробірки кожного розчину зберігали при температурі 2-8°С. 6.3 Аналіз нерозбавленого розчину По одній 2 мл пробірці, які зберігали при температурі 2-8°С, -70°С і -20°С, для кожної умови попереднього одержання нерозбавленого розчину, аналізували засобами SE-HPLC після розморожування при кімнатній температурі впродовж 2 год. Зразки, які зберігали при температурі -20°С, знову переносили до морозильної шафи з температурою -70°С на 4 год перед розморожуванням. Результати наведені у Таблиці 17. Одну 250 мл пробірку, яку зберігали при температурі -70°С, для умов 1, 5, 9, 13 і 15 (дивись Таблицю 1), аналізували засобами SE-HPLC після розморожування при кімнатній температурі впродовж 6 год. Результати наведені у Таблиці 18. На додаток до цього, дослідження з термічної дисоціації здійснювали із зразками у 15 мл пробірках після одного циклу F/T при температурі інкубування 29°С впродовж 8 год (1 мл зразки з 250 мл пробірок після одного циклу F/T) і аналізували засобами SE-HPLC (результати дивись у Таблиці 19). 7.0 Результати Таблиця 17 Результати попереднього одержання нерозбавленого розчину для пробірок фірми Nunc (0,5 мл), які зберігали при температурі -70°С, -20°С і 2-8°С Умови 1 ВА 2 ВА, MET 3 ВА, MET, TW 4 ВА, MET, POL 5 ARG 6 ARG, MET 7 ARG, MET, TW 8 ARG, MET, POL 2-8°С * %MONO %AGG 98,8 1,1 99 0,94 98,7 0,14 98,9 1,0 99,1 0,53 98,9 0,52 98,6 0,8 98,9 0,7 Умови зберігання -20°С ** %MONO %AGG 97,3 0,83 97,7 0,84 98,9 0,85 97,3 0,93 83,4 7,1 84,6 5,1 97,5 2,5 76,6 12,1 -70°С %MONO %AGG 97,8 0,89 98,1 0,78 99,1 0,84 98,1 0,71 98,9 0,58 98,8 0,66 99 0,49 98,9 0,43 51 93349 52 Продовження таблиці 17 1 9 MAN 10 MAN, MET 11 MAN, MET, TW 12 MAN, MET, POL 13 50 мМ ацетатний розчин Контроль 14 10 мМ ацетатний розчин 15 LYS 16 LYS, MET 17 LYS, MET, TW 18 LYS, MET, POL Лише твін 20 2 99,9 100 100 100 3 0,05 0 0 0. 4 81,2 83,5 98,1 83,3 5 1,3 0,97 0,26 1,1 6 97,8 98,2 99,9 87,5 7 0 0 0 0,68 100 0 80,9 2,7 84 0,75 100 99,6 99,4 99,1 99,5 0 0 0 0,18 0,24 89 97,4 99,4 99,4 86,7 0 0 0 0,23 2,3 92,4 99,6 99,4 99,6 96,7 99,8 0,82 0,08 0,03 0,13 0,59 0,13 * Зберігали при температурі 2-8°С впродовж 3 тижнів. ** Заморожували при температурі -70°С, зберігали при температурі -20°С впродовж 16 днів і знов переносили назад до морозильної шафи з температурою -70°С на 4 год. Результати являють собою середнє подвійних повторень. Буфер нерозбавленого розчину містив 50 мМ розчин ацетату натрію, рН 3,8+наповнювачі у різних комбінаціях (ВА - бензиловий спирт, MET - метіонін, MAN - маніт, TW - твін 20, POL - полоксамер) Таблиця 18 Результати попереднього одержання нерозбавленого розчину для 250 мл пробірок, які зберігали при температурі -70°С з (+INC) або без інкубування при температурі 29°С впродовж 8 год Умови 1 пробірка (фірма Nunc) 1-(250 мл пробірка) 1-(250 мл пробірка)+інкубування 5 пробірок (фірма Nunc) 5-(250 мл пробірка) 5-(250 мл пробірка)+інкубування 9 пробірок (фірма Nunc) 9-(250 мл пробірка) 9-(250 мл пробірка)+інкубування 13 пробірок (фірма Nunc) Контроль 13 Контроль (250мл пробірка) 13 Контроль (250 мл пробірка)+інкубування 15 пробірок (фірма Nunc) 15-(250 мл пробірка) 15-(250 мл пробірка)+інкубування Твін 20 (фірма Nunc) Твін20 (фірма Nunc)+ інкубування Бензиловий Моногідрохлорид Маніт спирт Л-аргініну Лізин Роіохаmer 188 Твін 20 Л-Met % % % Mono Agg Dim  96,2 1,1 2,7  95,2 1,2 3,5  97,6 1,08 1,3  98,2 0,81 1,0  98,5 0,41 1,1  99,46 0,58  97,4  78,1 0,52 21,4  95,1 0 0 0 2,6 4,9 82,1 1,2 16,6 73,2 2,2 24,5 95,1 1,12 3,8  99,6 0,02 0,42  99,4 0,03 0,61  99,9 0,11 98,1 99,8 0,04 0,13 Результати являють собою середнє подвійних повторень. 0 0 1,84 53 93349 54 Таблиця 19 Термічна дисоціація у 15 мл пробірках після одного циклу F/T Домішка Бензиловий спирт Аргінін Маніт Лізин Твін 20 Контроль Умови Перед інкубуванням Через 8 год при температурі 29°С Перед інкубуванням Через 8 год при температурі 29°С Перед інкубуванням Через 8 год при температурі 29°С Перед інкубуванням Через 8 год при температурі 29°С Перед інкубуванням Через 8 год при температурі 29°С Перед інкубуванням Через 8 год при температурі 29°С 8.0 Спостереження Додання наповнювача(-ів) до нерозбавленого розчину r-h бета-IFN 1a постійно зменшує відсоток димерів та агрегатів (з постійним підвищенням, завдяки цьому, відсотка мономерів). Порівнюючи впливи термічної дисоціації і вибраних наповнювачів на r-h бета-IFN, доданням наповнювачів можна досягти дещо вищого рівня мономерів (з більш низьким рівнем димерів і агрегатів). На додаток до цього, попередньо одержані нерозбавлені розчини, стабілізовані наповнювачами, демонструють навіть вищі рівні мономерів у разі додаткового піддання термічній дисоціації (наприклад, інкубування при температурі 29°С). 1) 2 мл пробірки - При температурі 4°С Одержують невеликі різниці відсотків мономерів за різних умов (максимальна дельта 1,3%) і зразки, що містять маніт, мали найвищий рівень мономерів (100%). Agg Dim Deg FDF F/T г-h IFN-beta 1a r-h IFN-beta FDF SE-HPLC SAB Темп. Мономери 94,76 97,58 98,02 99,43 78,29 95,08 99,3 99,89 98,15 99,82 73,4 95,09 Дімери 4,08 1,34 1,42 0 21,72 4,93 0,62 0 1,84 0,13 24,67 3,79 Агрегати 1,17 1,08 0,56 0,58 0 0 0,09 0,11 0 0,04 1,93 1,12 - При температурі -70°С Комбінація маніт+твін 20+метіонін є дещо кращою за лізин. Усі стабілізатори за різних умов можуть дати відсоток мономерів 99. - При температурі -70°С і зберіганні при температурі -20°С Найвищій відсоток мономерів одержують із комбінацією лізин+твін 20+метіонін. 2) 250 мл пробірки - При температурі -70°С Спостерігається чітко виражена перевага лізину щодо зниження рівня олігомеризації, порівняно з іншими випробуваними наповнювачами. Приклад 3. Стабілізація бета-інтерферону шляхом додання наповнювача до нерозбавленого розчину інтерферону з аналізом засобами ультрацентрифугування. SEC та Deg/Ox HPLC 1.0 Словник спеціальних термінів/скорочення Агрегати Димери Продукти розпаду Кінцева стандартна лікарська форма Заморожування і розморожування Рекомбінантний людський бета-інтерферон 1a (r-h IFN-beta 1a) із клітин СНО (яєчник китайського хом'ячка) Кінцева стандартна лікарська форма r-h IFN-beta 1a (r-h IFN-beta FDF) Високоефективна рідинна витіснювальна хроматографія за розміром молекул 50 мМ розчин ацетату натрію, рН 3,8 Температура 2.0 Введення Це дослідження зосереджувалось на зведенні до мінімального рівня олігомеризації r-h бета-IFN 1a на стадіях виробництва із фракції SEC-EL до зберігання кінцевої лікарської форми з метою забезпечення наявності стабілізованого нерозбавленого розчину інтерферону. Зведення до мінімального рівня олігомеризації здійснювали таким чином: 1) Попереднє змішування нерозбавленого розчину білка з наповнювачами та/або іншими стабі лізувальними агентами перед заморожуванням при температурі -70°С. 2) Попереднє змішування нерозбавленого розчину білка з наповнювачами та/або іншими стабілізувальними агентами без заморожування і зберігання при температурі 2-8°С. 3) Зберігання при температурі 2-8°С незамороженого нерозбавленого розчину r-h бета-IFN 1a без попереднього змішування. Зразки попередньо одержаного нерозбавленого розчину аналізували засобами SE-HPLC, 55 93349 Deg/Ox HPLC та шляхом ультрацентрифугування. SE-HPLC, ймовірно, виявляє лише ковалентні олігомери, у той час як ультрацентрифугування забезпечує також кількісне і якісне виявлення нековалентних олігомерів. 3.0 Мета/обсяг Зведення до мінімального рівня олігомеризації r-h бета-IFN 1a під час обробки нерозбавленого розчину. 4.0 Обладнання і матеріали 4.1 Обладнання 0,2 мк фільтрувальна установка P/N MPGL025 Мillіроrе Морозильна шафа (-70°С) Перистальтичний насос 250 мл конічні центрифужні пробірки - фірма Corning 1,8 мл пробірки, стійкі до низької температури - фірма Nunc 4.2 Матеріали 56 Фракція SEC-EL2 D-маніт, DAB (Німецька фармакопея), Ph Eur (Європейська фармакопея), ВР (Британська фармакопея), USP (Фармакопея США), FCC (Міжнародний харчовий хімічний кодекс), Е421 (код 1.05980, фірма Merck) Льодяна оцтова кислота 100% (код 1.00063, фірма Merck) 10 Μ розчин гідроксиду натрію Л-метіонін (1.05707, фірма Merck) Л-аргініну моногідрохлорид (код 1.01544, фірма Merck) Лізин (код 1.05701, фірма Merck) 5.0 Методика Дослідження здійснювали на фракції SEC-EL2. Загальна схема дослідження представлена на Фіг. 8. Різні умови попереднього одержання нерозбавлених розчинів білка наведені у Таблиці 20. Таблиця 20 Умови попереднього одержання Умови Л-аргінін Мг/мл Маніт MM Лізин Мг/мл 1 Контроль 2 31,6 3 300 4 82,2 Л-метioнін Кількість пробіЗберігання Кінцевий рН мг/мл* мг/мл рок 1250 мл повна 12 мл повна 2-8°С 3,9 495 12 мл напівпуста 1250 мл -70°С 22 мл 1250 мл -70°С 3,83 420 42 мл 2250 мл повна 0,12 2-8°С 3,92 507 42 мл 2250 мл -70°С 3,95 437 42 мл * перевірено засобами quant-HPLC 6.4 Одержання розчинів Розчини одержували за Прикладом 2. 1) Одержання 50 мМ розчину ацетату натрію, рН 3,8 (SAB) Дивись Приклад 2. 2) Одержання 0,5 л 50 мМ ацетатного розчину, рН 3,8, 63,2 мг/мл аргініну. a) Відважили 0,483 кг WFI (вода для ін'єкцій). b) Додали 31,6 г аргініну. c) Розчин перемішували впродовж 5 хв до розчинення аргініну. d) Додали 1,5 г оцтової кислоти. e) Розчин перемішували впродовж 5 хв. f) У процесі визначення рН додали приблизно 0,28 мл 10 Μ розчину NaOH, доки рН не досягнув рівня 3,8. g) Відібрали проби розчину для визначення провідності і рН. h) Розчин профільтрували через 0,2 мк фільтр. 3) Одержання 1 л 50 мМ ацетатного розчину, рН 3,8, 31,6 мг/мл аргініну a) Відважили 0,986 кг WFI (вода для ін'єкцій). b) Додали 31,6 г аргініну. c) Розчин перемішували впродовж 5 хв до розчинення аргініну. d) Додали 3,002 г оцтової кислоти. e) Розчин перемішували впродовж 5 хв. f) У процесі визначення рН додали приблизно 0,56 мл 10 Μ розчину NaOH, доки рН не досягнув рівня 3,8. g) Відібрали проби розчину для визначення провідності і рН. h) Розчин профільтрували через 0,2 мк фільтр. 4) Одержання 1 л 50 мМ ацетатного розчину, рН 4,1, 164,4 мг/мл лізину a) Відважили 0,835 кг WFI (вода для ін'єкцій). b) Додали 164,4 г лізину. c) Розчин перемішували впродовж 5 хв до розчинення лізину, d) Додали 3,002 г оцтової кислоти. e) Розчин перемішували впродовж 5 хв. 57 93349 f) Додали 0,56 мл 10 Μ розчину NaOH, рН досягнув рівня приблизно 4,1. g) Відібрали проби розчину для визначення провідності і рН. h) Розчин профільтрували через 0,2 мк фільтр. 5) Одержання 1 л 50 мМ ацетатного розчину, рН 4,0, 82,2 мг/мл лізину a) Відважили 0,92 кг WFI (вода для ін'єкцій). b) Додали 82,2 г лізину. c) Розчин перемішували впродовж 5 хв до розчинення лізину. d) Додали 3,002 г оцтової кислоти. e) Розчин перемішували впродовж 5 хв. f) Додали 0,56 мл 10 Μ розчину NaOH, рН досягнув рівня приблизно 4,1. g) Відібрали проби розчину для визначення провідності і рН. h) Розчин профільтрували через 0,2 мк фільтр. 6) Одержання 1 л 50 мМ ацетатного розчину, рН 3,8, 600 мМ розчину маніту, 0,24 мг/мл метіоніну a) Відважили 0,92 кг WFI (вода для ін'єкцій). b) Додали 110,28 г маніту. c) Розчин перемішували впродовж 5 хв до розчинення маніту. d) Додали 3,002 г оцтової кислоти. e) Розчин перемішували впродовж 5 хв. f) Додали 0,24 г метіоніну. g) Розчин перемішували впродовж 5 хв. h) У процесі визначення рН додали приблизно 0,56 мл 10 Μ розчину NaOH, доки рН не досягнув рівня 3,8. і) Відібрали проби розчину для визначення провідності і рН. j) Розчин профільтрували через 0,2 мк фільтр. 7) Одержання 2 л 50 мМ ацетатного розчину, рН 3,8, 300 мМ розчину маніту, 0,12 мг/мл метіоніну a) Відважили 1,93 кг WFI (вода для ін'єкцій). b) Додали 110,28 г маніту. c) Розчин перемішували впродовж 5 хв до розчинення маніту. d) Додали 6,006 г оцтової кислоти. e) Розчин перемішували впродовж 5 хв. f) Додали 0,24 г метіоніну. g) Розчин перемішували впродовж 5 хв. h) У процесі визначення рН додали приблизно 1,12 мл 10 Μ розчину NaOH, доки рН не досягнув рівня 3,8. і) Відібрали проби розчину для визначення провідності і рН. 58 j) Розчин профільтрували через 0,2 мк фільтр. 6.1 Попереднє одержання нерозбавленого розчину білка Загальна схема одержання нерозбавленого розчину білка і композиції представлена на Фіг. 8 і у Таблиці 20. Нижче наведено докладний опис попереднього одержання нерозбавлених розчинів. Оптичну густину фракції SEC-EL визначали на 280 нм, концентрація дорівнювала 1,31 мг/мл. Перша стадія (Розбавлення фракції SEC-EL 1:1 (мас.) різними буферами) 6.2.1 155 г фракції SEC-EL розбавляли 1:1 (мас.) 155 г SAB, 164,4 мг/мл лізину. 6.2.2 78 г фракції SEC-EL розбавляли 1:1 (мас.) 78 г SAB, 63,2 мг/мл аргініну. 6.2.3 220 г фракції SEC-EL розбавляли 1:1 (мас.) 220 г SAB, 600 мМ розчином маніту, 0,24 мг/мл метіоніну. 6.2.4 189 г фракції SEC-EL розбавляли 306 г SAB для одержання розчину, що містить 0,50 мг/мл r-h бета-IFN 1a. Після фільтрації цей розчин розподіляли між 250 мл пробірками та 2 мл пробірками (фірма Nunc) і зберігали при температурі 70°С або 2-8°С; 250 мл пробірки для зберігання при температурі 2-8°С заповнили до пробки. Друга стадія (кінцеве розведення нерозведеного розчину до 0,50-0,58 мг/мл r-h бета-IFN 1a) Одержали наведені нижче розчини (цільова концентрація становила 0,5 мг/мл r-h бета-IFN 1a). 6.2.5 310 г розчину відповідно до п. 6.2.1 розбавляли 90 г SAB, 82,4 мг/мл лізину. 6.2.6 156 г розчину відповідно до п. 6.2.2 розбавляли 48 г SAB, 31,6 мг/мл аргініну. 6.2.7 440 г розчину відповідно до п. 6.2.3 розбавляли 132 г SAB, 300 мМ розчином маніту, 0,12 мг/мл метіоніну. 6.2.8 Після фільтрації ці 3 розчини (6.2.5-6.2.7) розподіляли між 250 мл пробірками та 2 мл пробірками (які містили 2 мл нерозбавленого розчину). 6.2.9 250 мл пробірки і 2 мл пробірки з розчинами, що містили лізин і аргінін, заморожували і зберігали при температурі -70°С; розчин, що містив маніт і метіонін, зберігали при температурі 28°С (250 мл пробірку заповнили до кришки). 6.3 Обробка попередньо одержаних нерозбавлених розчинів Зразки, які зберігали при температурі -70°С і 28°С, аналізували шляхом ультрацентрифугування, засобами Deg/Ox HPLC та SE-HPLC. 7.0 Результати Таблиця 21 Умови 1 Контроль SEC-HPLC 1 Контроль AUC 1 Контроль SEC-HPLC 1 Контроль AUC Л-аргінін мг/мл Лізин Мг/мл Маніт MM Метіонін мг/мл Зберігання РН % % % DEG/OX Mono Agg Dimer HPLC 77,6 1,6 20,8 80,4 2,2 17,4 -70°С 1,1 2-8°С 99,9 2-8°С 95 3,9 1,1 59 93349 60 Продовження таблиці 21 1 2 SEC-HPLC 2 AUC 3 SEC-HPLC 3 AUC 4 SEC-HPLC 4 AUC 2 31,6 31,6 3 82,2 82,2 4 300 300 300 300 8.0 Спостереження Результати, одержані у Прикладі 2, підтверджуються у цьому дослідженні даними ультрацентрифугування і SEC (різниці рівня відсотка мономерів обумовлюються ймовірним виявленням SEC лише ковалентних олігомерів). На додаток до цього, дані DEG/OX HPLC вказують, що рівень окиснених форм, після додання наповнювачів до 5 0,12 0,12 0,12 0,12 6 -70°С -70°С 2-8°С 2-8°С -70°С -70°С 7 3,83 3,92 3,95 3,95 8 99 96,6 99,8 95 99,6 93,8 9 0 0,7 0,2 0,6 0,4 0,6 10 1 2,7 0 4,4 0 5,6 11 1 1,1 1,1 нерозбавленого розчину r-h бета-IFN 1a, залишається стабільним. Приклад 4: Стабілізація бета-інтерферону шляхом додання наповнювача до нерозбавленого розчину інтерферону перед або після стадії фільтрації 1.0 Словник спеціальних термінів/скорочення Агрегати Акт про проведення аналізу Димери Продукти розпаду Високоефективна рідинна хроматографія з оберненою фазою для продуктів розпаду та Deg/Ox-HPLC окиснених форм F/T Заморожування і розморожування Високоефективна рідинна хроматографія з оберненою фазою для кількісного визначення Quant-HPLC r-IFNP в нерозбавленому розчині r-h бета-IFN 1a Рекомбінантний людський бета-інтерферон 1a (r-h IFN-beta 1a) із клітин СНО (яєчник киr-h IFN-beta 1a тайського хом'ячка) г-h IFN-beta FDF Кінцева стандартна лікарська форма r-h IFN-beta 1a (r-h IFN-beta FDF) SE-HPLC Високоефективна рідинна витіснювальна хроматографія за розміром молекул Темп. Температура Agg СОА Di Deg 2.0 Короткий виклад суті За допомогою методів SE-HPLC та ультрацентрифугування було показано, що попереднє змішування нерозбавленого розчину бета-IFN 1а з 300 мМ розчином маніту (перед заморожуванням) зводить до мінімального рівня ковалентні і нековалентні олігомери та агрегати, у разі додання перед або після фільтрації нерозбавленого розчину і після одного і чотирьох циклів F/T. Вплив додання 300 мМ розчину маніту перед фільтрацією є значнішим щодо зниження рівня олігомеризації, зокрема, нековалентних олігомерів і агрегатів, у 250 мл пробірках (звичайні контейнери для нерозбавленого розчину r-h бетаIFN 1a). За допомогою методів SE-HPLC та ультрацентрифугування було показано, що олігомери не утворюються у незамороженому нерозбавленому розчині r-h бета-IFN 1a, який зберігався при температурі 2-8°С, але утворюються під час заморожування і розморожування нерозбавленого розчину r-h бета-IFN 1a. 3.0 Введення Зведення до мінімального рівня олігомеризації і агрегування r-h бета-IFN 1a під час циклів заморожування/розморожування є бажаною метою, оскільки гадають, що білкові агрегати можуть викликати імуногенні реакції, наслідком яких є продукування нейтралізувальних антитіл. Аналітичним методом, який на сучасному етапі застосовують для визначення рівня мономерів у нерозбавленому розчині, є SE-HPLC. Попередні результати, одержані за допомогою ультрацентрифугування, як видається, вказують на те, що SE-HPLC може виявляти лише ковалентні олігомери, у той час як ультрацентрифугування забезпечує як кількісне, так і якісне виявлення також нековалентних олігомерів (дивись експеримент 2). Мета цього дослідження полягала у визначенні впливу попереднього змішування нерозбавленого розчину білка з манітом у виробничому масштабі на олігомеризацію і агрегування r-h бета-IFN 1a за допомогою SE-HPLC та ультрацентрифугування, як аналітичних методів. 4.1 Мета/обсяг 4.1.1 Визначити, чи є присутніми нековалентні агрегати у фракції SEC (перед фільтрацією і перед заморожуванням). 4.1.2 Визначити, чи зводить маніт (300 мМ) до мінімуму ковалентні і нековалентні олігомери і агрегати у разі додання перед або після фільтрації нерозбавленого розчину, перед заморожуванням і після одного і чотирьох циклів заморожування/розморожування. 4.1.3 Визначити, чи зводить маніт (150 мМ) до мінімуму ковалентні і нековалентні олігомери і агрегати у разі додання перед фільтрацією нерозбавленого розчину, перед заморожуванням і